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Artigo de método

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

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DOI:

10.3791/51389

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20 de maio de 2014

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1Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften, ISAS, 2Department of Biochemical Engineering, University College London, 3Institute for Life Sciences, University of Southampton

Neste artigo

Resumo

Protocolos para único neurônio microfluídicos arraying e mascaramento de água para a padronização dos revestimentos de biomateriais plasma em-chip são descritos. Altamente interligados co-cultura pode ser preparado através de entradas de células mínima.

Resumo

Realizações microfluídicos da câmara Campenot têm atraído grande interesse da comunidade da neurociência. Estas plataformas de co-cultura interligados pode ser usado para investigar uma variedade de questões, abrangendo desenvolvimento neurobiologia e funcional para a infecção e propagação da doença. No entanto, os sistemas convencionais requerem entradas significativas celulares (muitos milhares por compartimento), inadequados para o estudo de células de baixa abundância, como nigra primário dopaminérgico substantia, gânglios espiral, e os neurônios melanogaster Drosophilia e impraticável para a experimentação de alto rendimento. As culturas densas são também altamente enredada localmente, com algumas excrescências (<10%) que interligam as duas culturas. Neste trabalho protocolos microfluídicos e padronização simples são descritos que enfrentar esses desafios: (i) um neurônio único microfluídicos método arraying, e (ii) um método de mascaramento de água para revestimentos de biomateriais padronização de plasma para register neurônios e promover crescimento entre os compartimentos. Minimalista neuronais co-culturas foram preparadas com de alto nível (> 85%) conectividade intercompartimental e pode ser usado para experimentos neurobiologia alto rendimento com precisão uma única célula.

Introdução

Tecido neuronal é altamente complexa; uma mistura heterogênea de celular que é espacialmente ordenados dentro camadas e compartimentos definidos e com conectividade de plástico através de contatos celulares e especialmente via axônio e dendrito excrescências. Novas técnicas são necessárias para conferir maior liberdade experimental para obter insights mais profundos e mecanismos centrais desvendar a doença, o desenvolvimento ea função saudável. A câmara Campenot 1,2 e, mais recentemente, microfabricados concretizações 3,4 pode ser usado para a preparação ex vivo de rede neuronal co-culturas com a capacidade de perturbar selectivamente as diferentes populações somáticas e também as suas excrescências de neurites. Estes dispositivos microfluídicos têm, por exemplo, foram usados ​​para estudar a degeneração de axônios e regeneração seguinte químico 5,6 ou laser axotomia 6-8, tauopathy 9, a disseminação viral 10,11, e localização de mRNA em axônios 4.

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Para ampliar o alcance dos neurobiólogos, os avanços tecnológicos são necessários para preparar minimalistas neuronais co-culturas. Isso permite disentanglement da rede neuronal para a investigação do sistema com uma única célula e precisão sub-celular. O requisito mínimo para o número de células é aberta a possibilidade de analisar os tipos de células raras, incluindo células dopaminérgicas substantia nigra relevantes para a doença de Parkinson, gânglios espirais do ouvido, os neurónios periféricos, e células estaminais. Além disso, a economia celular é relevante para a iniciativa 3Rs. Usando essas plataformas microfluídicos, telas de toxicidade em grande escala ou outra alta taxa de transferência, os dados rico série experimental exigindo neurônios animais já pode ser considerado.

Neste trabalho são descritos os protocolos para a fabricação e uso de um dispositivo micro. Arraying microfluídicos em combinação com um em biomateri situmétodo de padronização al pode ser utilizado para o registro de altamente interconectadas co-culturas de neurônios que usam números de celular mínimos. Arraying microfluídico se baseia numa abordagem de fluxo diferencial de 12-15, em que armadilhas microestruturados são posicionadas dentro de um circuito de fluido (ilustrado, juntamente com imagens de MEV da Figura 1). O caminho 0 → 1 tem a resistência mais baixa de fluidos (R2> R 1) para o transporte de neurónios de um conjunto linear de aberturas microestruturadas - As entradas para os canais de crescimento de neurites. Ocupação da armadilha por uma única célula localmente impede o fluxo para desviar as linhas de corrente para capturar células subseqüentes em armadilhas vizinhos. Ocupação completa das armadilhas na matriz de liga a proporção de fluidos (1 R> R 2) para desviar as linhas de corrente para o trajecto sinuoso (0 → 2) para produzir um modo de operação manual para a remoção de excesso de neurónios.

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Figura 1. Microfluidic Circuit. A) O circuito de resistência diferencial fluídico para arraying único neurônio, com flanquear câmaras cultura interligados por canais de crescimento de neuritos. B, imagens C) SEM da bicamada neurônio compartimentada co-cultura array com menisco fixando micropillars. Com este projeto, as estruturas de neurônio de captura em forma de tridente foram usados ​​para promover fasciculation das excrescências neurite. Figura e lenda reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Clique aqui para ver imagem ampliada.

A preparação de redes neuronais micropatterned em substratos planares pode ser facilmente alcançada (para exampl es do nosso grupo, ver Frimat et al. 16 e Heike et al. 17). No entanto, encapsulando padrões materiais bioativos dentro de dispositivos de PDMS e com a exigência de alinhamento micrômetro escala destes para os canais microfluídicos representa um grande desafio técnico. Na seção 3.1 um protocolo para a em-chip, ou in situ, a preparação de padrões de biomateriais é apresentado. Esses padrões permitem registro neurônio durante prazos longos de cultura e promover outgrowths entre os compartimentos. Microestruturas menisco-pinagem são usados ​​para alinhar uma máscara de água chamado com o neurônio arraying sites e canais de crescimento de neuritos. A máscara de água protege revestimentos moléculas de adesão durante o tratamento de plasma, enquanto que as superfícies expostas são desintegrados para definir o padrão biomaterial. Além disso, os protocolos são fornecidos para a cultura de células e para o isolamento de fluidos necessários para o tratamento selectivo dos diferentes compartimentos de co-cultura.

ve_content "> Os protocolos são projetados para alavancar os princípios user-friendly de litografia suave para a replicação de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) dispositivos microfluídicos 18. Da mesma forma, em biomaterial situ padronização é simples, explorando de evaporação de superfície e fenômenos de tensão, e só exigindo uma fonte de plasma de mão barato. microfluídicos O circuito de forma eficaz os programas de carregamento do compartimento celular e tratamentos específicos que fazem essas operações simplesmente uma questão de distribuição de materiais na porta inferior correto e aspiração de cima. Desta forma, pretende-se dar os neurobiólogos a liberdade de preparar e utilizar dispositivos microfluídicos em seus próprios laboratórios.

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Protocolo

Os protocolos são destinados para os neurocientistas, e estão resumidos na Figura 2. Como tal, é recomendável que microfabricação dos SU-8 mestres usados ​​para replicação PDMS é terceirizada para instalações comerciais ou institucionais. Os dois projetos de máscara de camada estão disponíveis gratuitamente como informação suplementar (CEP) na Royal Society of Chemistry website 12. Importante, a primeira camada de SU-8 deve ser fabricado, a uma profundidade de 2,5-3,0 um, e a segunda a uma profundidade de 25-30 m. Estas são dimensões fundamentais necessários para arraying neurônio eficaz. O limite de altura de 3 mícron é também necessário para evitar que os neurónios a ser transportado ou migração entre os dois compartimentos 12.

1. Microfluidic replicação de dispositivos no PDMS

  1. Misture o pré-polímero de PDMS completamente com o agente de cura (184), a uma proporção de 10:1 e desgaseificar a mistura em um secador de vácuo para tipicamente 20 min. Alternativamente, coloque o mixtura em um tubo Falcon 50 ml e usar baixa g centrifugação para a desgaseificação.
  2. Coloque a 2-camada microestruturada SU-8 bolacha numa placa de aquecimento de 80 ° C e alinhar quadros de polímero para cada dispositivo da bolacha. Despeje PDMS nos quadros a uma profundidade de 5 mm e ≥ permitir> 1 hora para garantir a completa cura térmica.
  3. Uma vez curado, remover a pastilha da placa de aquecimento e deixa-se arrefecer sobre uma superfície plana.
  4. Usar óculos de protecção e de trabalho de um canto (longe dos SU-8 microestruturas) com um bisturi rígida para gentilmente prêmio do quadro e PDMS do wafer.
  5. Retirar o molde PDMS da armação e usar um par de tesouras para cortar o dispositivo de PDMS em excesso. Este assim chamado intermitente é geralmente produzido quando uma película fina de PDMS espalha entre a armação de polímero e a superfície da bolacha.
  6. PDMS restantes pode ser aplicada a toda a bolacha e curado para proteger a pastilha durante o armazenamento. Remover esta antes da moldagem dispositivo subseqüente, e ao fazê-lo remover qualquer particular os contaminantes da superfície.

2. Assembléia dispositivo e Interligação

  1. Prepare as seis portas de interface usando de 3 mm de diâmetro biópsia soco. Trabalhar em uma superfície escura, em boas condições de luz e com as características microstructured viradas para cima para ajudar o alinhamento das portas com os canais microfluídicos.
  2. Inspecione o dispositivo para partículas. Remova os com fita adesiva reversível.
  3. O circuito de microfluidos é encapsulado usando uma camada de PDMS fina montados numa lamela de vidro: Estes são preparados por vazamento de um pequeno volume (~ 0,5 ml) da mistura de agente de cura de PDMS-(10:1, 601) sobre a base de um sistema flexível, grau bacteriológica placa de Petri. Pressione suavemente uma lamela sobre a camada de PDMS, coloque sobre a placa de aquecimento e cura térmica por alguns minutos. Rapidamente após o resfriamento, usar um bisturi para cortar e prêmio da bicamada lamela-PDMS da placa de Petri. Aparar com uma tesoura, se necessário.
  4. Vínculo Plasma o dispositivo PDMSe camada de suporte para produzir uma boa vedação: As condições ótimas são instrumento específico. Por exemplo, um forno de plasma a funcionar a 70 W e 40 kHz, numa atmosfera de oxigénio de 0,2 mbar durante 40 segundos produz uma excelente ligação PDMS-PDMS. Uma vez tratada plasma, pressionar ambas as partes juntas e deixe por um minuto para totalmente vínculo.
  5. Use tubo de silicone (1,6 mm DI, 3.2 mm de diâmetro externo) para fazer a interface com as bombas e seringas.

3. Biomaterial Padronização e Operações microfluídicos

Os protocolos para a modelação em biomaterial in situ, cultura neurónio e tratamentos fluídicos estão ilustrados na Figura 2.

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Figura 2. Protocolos microfluídicos Illustrated. A) PL e PLL-g-PEG padronização; Além da camada de adesão de células (por exemplo,PL, verde), com a produção a máscara de água alinhada B) tratamento de plasma de ar atmosférica do PL exposto evaporação.; dois pinos de antena são usados, com a antena introdução plasma ilustrado com uma estrela rosa. C) PBS (azul) lavagem por aspiração é usado para evitar contaminar a região tratada com plasma com PL. D) Entrega de PLL-g-PEG (vermelho ) por aspiração para revestir as regiões tratadas com plasma E) carregamento celular.; arraying microfluídicos simultânea de neurônios para ambos os compartimentos de acompanhamento por aspiração, F) mídia () perfusão rosa usando um fluxo hidrostática orientado G) tratamentos fluídicos isolados.; tratamento periférico de um agente de teste (preto) entregues a partir da entrada inferior de flanco por aspiração e H) central de tratamento livrou da entrada central inferior por aspiração. Figura e lenda reproduzido com permissão da Sociedade Real de Química(RSC) 12. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Imediatamente após plasma colagem dos canais microfluídicos PDMS são altamente hidrofílico (ângulo de contato ≤ 5 °). Tais superfícies são adequadas para a adesão e a cultura de linhas de células, tais como células neuronais, como SH-SY5Y humanas diferenciadas. Para a cultura ex vivo de neurónios primários e a cultura de linhas de células precursoras neuronais tais como a linha de células do mesencéfalo Lund humano (LUHMES) um revestimento de poliaminas, ou polilisina (PL) ou poliornitina (PO), é necessário, como uma âncora electrostático. Além de proteínas de adesão tais como laminina ou a fibronectina são muitas vezes necessário que o revestimento de interface de integrina. No entanto, os revestimentos PL e PO prontamente ligam os neurônios, dificultando a entrega de microfluídica para os sites da matriz e também a imposição de tensões de cisalhamento indesejados. Para resolver este problema biomaterial em-chippadronização é necessária para localizar materiais de adesão nos sites armadilha e os microcanais conseqüência. Isso também promove o desenvolvimento de conexões inter-compartimento e reduz emaranhamento local. O protocolo envolve também a adição de materiais de PEG para áreas vizinhas para garantir as proteínas e os neurónios são restritas para os locais desejados durante a cultura prolongada. O protocolo seguinte é documentado na Figura 3:

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Figura 3. Água mascaramento para modelação prependicular biomaterial por plasma. A) Ilustração do processo de mascaramento água com os micropillars PDMS fixando os menisco de água no local para stencil plasma. A curvatura do menisco no plano vertical, tem sido negligenciado. B) uma máscara de água visualizadas com um corante vermelho e posicionada por menisco pinning. C) O estampados revestimento PL-FITC fotografada após stencil plasma. D) A adição de proteína rejeitar e repelente célula PLL-g-PEG-TRITC a um revestimento com estampas de plasma PL-FITC. Isto foi usado para o registro de células SH-SY5Y e também para padronizar uma camada de fibronectina adicional para células LUHMES. Figura e lenda reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Clique aqui para ver imagem ampliada.

  1. Masking Água para in situ Biomaterial Patterning por Plasma Stenciling
    1. Pouco tempo depois da ligação de plasma pipeta de um volume de 0,5 ul de PL ou PO (100 ug / ml em PBS 1x) no centro da parte inferior da porta. Em questão de segundos, todo o circuito microfluídica é preenchido por ação capilar. Deixar durante alguns minutos para revestir completamente a superfície de PDMS hidrofílicos com a poliaminas.
    2. Remover moléculas de poliamina não ligados por lavagem controlado por aspiração com 1x PBS (ver figura 2C) durante 1 min.
    3. Remova toda a PBS dos portos e aquecer o dispositivo de iluminação com um microscópio. Isso aumenta a evaporação das portas para a formação da água máscara rápida. A máscara de água (ilustrado na Figura 3A e documentado na Figura 3B) é estabelecida dentro de ~ 5 min.
    4. Inspecione o dispositivo por meio de microscopia para garantir mascaramento água está completa. Por favor note estruturas reservatório a montante do local de matriz estão incluídas no projecto de máscara para prolongar a estabilidade da máscara de água (~ 15 min).
    5. Inserir pinos de aço inoxidável nas portas (Figura 2B). Estes são usados ​​para acoplar o plasma gerado por uma descarga de coroa à pressão atmosférica de mão ou gerador Tesla (por exemplo, operando a 2 MHz, de 30 de sinal kV) 19,20 para os canais de microfluidos vagos. Aponte a ponta da tele plasma fonte próxima à ponta de um alfinete e plasma tratar a microcanais para ≤ 1 seg. Use condições de pouca luz para observar padrões plasma.
    6. Retire a máscara de água com uma etapa de lavagem. Use aspiração paralelo das 3 portas superiores. Use 4 comprimentos iguais de tubo de silicone conectado por um adaptador de 4 direções para uma bomba de aspiração de alcançar a aspiração paralelo. Comece aspiração e dispensar PBS nas 3 portas de fundo para desenhar PBS através do circuito de microfluídica. Desta maneira um material de contraste de PDMS-poliamina é produzido (veja a Figura 3C). PBS evacuar do circuito de microfluidos e deixar durante várias horas para restaurar o estado nativo, hidrofóbico. Isso torna os PDMS totalmente não-permissiva para adesão celular.
    7. Deve materiais de adesão adicionais, tais como laminina ou fibronectina, ser necessário realizar as seguintes etapas são necessárias e deve ser feito imediatamente após a remoção da máscara de água: Pipetar um volume de 10 ul do enxerto de co-polímero de poli-L- Lisina-poli (etileno-glicol) (PLL-g-PEG, 100 ug / ml, em PBS), em ambos os canais de fundo de flanqueamento, seguindo-se a aspiração dos canais flanqueando superiores durante 2 min.
    8. Sem interromper o fluxo, remover o excesso de PLL-g-PEG por troca com um tampão PBS. A selectivamente revestimentos das regiões não-revestido de poliamina com a unidade de PEG agir para evitar a adsorção de proteínas e adesão celular 17,21.
    9. Proteínas de adesão, tais como laminina ou fibronectina, em seguida, pode ser co-localizada com o revestimento de poli-amina: Pipetar 10 ul de volume destas proteínas de ECM (tipicamente de 10 ug / ml) em todos os três portas inferiores. Aspirar a partir dos três portas superiores até que o dispositivo está cheio com a solução de proteína e incubar durante 1 hora para produzir um revestimento de boa qualidade.
    10. Remover o excesso de proteínas, aspirando PBS a partir dos três portas inferiores.
  2. Microfluidic único neurônio arraying
    1. Prime os dispositivos com aprocomeu mídia. Adicionar 20 volumes ul às 3 portas inferiores e por aspiração paralelo de três portas superiores rapidamente encher o circuito microfluídicos com a mídia. Use um conector de tubulação de 4 vias para acoplar as 3 portas superiores através de tubos de silicone de tamanho igual a uma bomba de aspiração.
    2. Adicionar 20 ul de uma suspensão de células desagregadas (1 x 10 6 células / ml) a cada uma das portas de entrada de flanqueamento (0, na Figura 1).
    3. Equipar uma bomba de aspiração com um regulador de fluxo ou usar uma seringa para aspiração delicada das 3 portas superiores. Completa arraying neurônio tipicamente requer 1 min.
    4. Colha os neurônios em excesso permanecem nos 4 portas de acompanhamento com uma pipeta para arraying em dispositivos microfluídicos subseqüentes.
    5. Remova o tubo. Preencha todas as portas com a mídia e coloque o dispositivo na incubadora. Dentro de algumas horas, as células tornam-se totalmente aderente no padrão biomaterial.
  3. Cultura Neuron, Selective Fluidic Tratamento e Immunostaining
    1. Troque a mídia por perfusão periódica utilizando alimentação hidrostática (a 2 milímetros diferença de altura da coluna é adequadamente lento).
    2. Alternativamente, mergulhe o dispositivo micro na mídia, trocando a mídia periodicamente (2-3 dias), como com culturas de células normais.
    3. Tratamentos fluídicos selectivos para qualquer compartimento de cultura de neurónios ou o compartimento de crescimento de neurites central são atingidos como se segue: Pipetar 20 ul da substância de teste na porta de fundo do canal de interesse, e aspirado a partir da porta directamente acima. Para tratamentos longos reduzir a taxa de fluxo através de um regulador de fluxo e reabastecer a substância de teste, conforme necessário.
    4. Protocolos de imunocoloração variam para cada alvo molecular e reagentes associados. Para contrariar o risco potencial de dano induzido pelo cisalhamento para os neurônios de uma taxa de fluxo lento foi usado. Isso resulta em aumento épocas de aplicação para aspergir completamente o sistema, estendendo tempos normais de protocolo. Hyperfusão drostatic usando portas com diferentes alturas de coluna (por exemplo, 2 mm) foi utilizada para fornecer os reagentes. Adição de reagente mais rápida e remoção utilizando uma bomba pode ser usada para reduzir os prazos experimentais. Ligue uma bomba de aspiração para as 3 portas superiores a desenhar a partir dos reagentes 3 portas inferiores.

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Resultados

Exploits mascaramento Água tensão superficial. A tolerância de pressão na interface ar-líquido escalas inversamente com o raio de curvatura [ figure-results-1 , Produzindo as interfaces altamente estáveis ​​em dimensões de microfluidos. Os micropillars efetivamente ancorar a máscara de água no local. Formação máscara água é conduzida através de evaporação a partir das portas de microfluidos, com a taxa de aumento de aquecimento. Usando o calor de baixa ...

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Discussão

A técnica arraying microfluídica é o primeiro de seu tipo, que permite a manipulação de precisão único neurônio para o estabelecimento de culturas minimalistas. Juntamente com o método in situ padronização biomaterial, uma abordagem poderosa para alinhar os padrões celulares com estruturas microfluídicos, estas culturas minimalistas têm níveis de conectividade de alta intercompartimental com reduzida emaranhamento local. Estas características podem ser utilizadas para o estudo de eficiência de transmissão entre...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores são gratos a Ulrich Marggraf (ISAS) para SU-8 de fabricação e Maria Becker (ISAS) para SEM imagem. A pesquisa foi financiada pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), um Bundesministerium für Bildung und Forschung concessão (BMBF 0101-31P6541) e pelo Ministerium für Inovação, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf graças a Escola Internacional de Leibniz "Biologia de Sistemas Lab-on-a-Chip" de apoio financeiro.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PDMS Sylgard 184Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601Wacker
LamínulasVWR630-1590130-160 mm de espessura
3 mm punções de biópsiaKai MedicalLidar com cuidado -
tubulação TygonFisher ScientificS-50-HL1,65 mm de diâmetro; 3,35 mm OD
Seringa de 1 ml ( Inkjekt e Omnifix)Braun6064204
Conector de tubulação de 4 viasVWR ou Fisher Scientific
Regulador de fluxoHarvard Apparatus722645
pinos de 0,5 mmDepartamentos
de costura PLL-g-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]-PEG(5)A estabilidade no armazenamento pode ser um problema
poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407
Polilisina-FITCSigma-AldrichP3069
PoliornitinaSigma-AldrichP4957
FibronectinaSigma-AldrichF2006
LamininaSigma-AldrichL2020
PBSSigma-AldrichP4417
Microscópio fluorescente invertido
Exemplo de bomba de aspiraçãoKNF Neuberger, LaboportN811KVP
Dispositivo portátil de descarga coronaLeybold-Heraeus, USAVP23Pode não estar em conformidade com as normas de segurança do seu país
Forno de plasma FemtoDiener Dessecador ou
extremamente afiada centrífuga a vácuo eletrônico

Referências

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