Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Resumo

Vários métodos estão disponíveis para medir o pH intracelular, mas muito poucos deles permitem a medição simultânea do pH citoplasmático e organelar. Aqui, descrevemos em detalhes uma metodologia rápida e precisa para medir simultaneamente o pH citoplasmático e vesicular por imagem raciométrica de células vivas.

Resumo

O pH intracelular é rigidamente regulado e diferenças de pH entre o citoplasma e as organelas foram relatadas¹. A regulação do pH celular é crucial para o controle homeostático de processos fisiológicos que incluem: síntese de proteínas, DNA e RNA, tráfego vesicular, crescimento celular e divisão celular. Alterações na homeostase do pH celular podem levar a alterações funcionais prejudiciais e promover a progressão de várias doenças². Vários métodos estão disponíveis para medir o pH intracelular, mas muito poucos deles permitem a medição simultânea do pH no citoplasma e nas organelas. Aqui, descrevemos em detalhes um método rápido e preciso para a medição simultânea do pH citoplasmático e organelar usando microscopia confocal em células vivas³. Este objetivo é alcançado com o uso de dois corantes raciométricos com sensor de pH que possuem particionamento seletivo do compartimento celular. Por exemplo, SNARF-1 é compartimentado dentro do citoplasma, enquanto HPTS é compartimentado dentro de organelas endossômicas / lisossômicas. Embora o HPTS seja comumente usado como um indicador de pH citoplasmático, esse corante pode rotular especificamente vesículas ao longo da via endossômico-lisossômica após ser absorvido pela pinocitose^3,4. Usando essas sondas de detecção de pH, é possível medir simultaneamente o pH dentro dos compartimentos endocítico e citoplasmático. O comprimento de onda de excitação ideal do HPTS varia dependendo do pH, enquanto para o SNARF-1, é o comprimento de onda de emissão ideal que varia. Após o carregamento com SNARF-1 e HPTS, as células são cultivadas em diferentes soluções calibradas de pH para construir uma curva padrão de pH para cada sonda. A imagem celular por microscopia confocal permite a eliminação de artefatos e ruído de fundo. Devido às propriedades espectrais do HPTS, esta sonda é mais adequada para medição do compartimento endossômico levemente ácido ou para demonstrar a alcalinização das organelas endossômicas/lisossômicas. Este método simplifica a análise de dados, melhora a precisão das medições de pH e pode ser usado para abordar questões fundamentais relacionadas à modulação do pH durante as respostas celulares a desafios externos.

Protocolo

1. Preparação das soluções de calibração para pH celular

1. Adicionar os seguintes compostos de cinco tubos cónicos de 50 ml separados para preparar soluções a 5 para ser utilizados para a calibração:
   • De NaCl (1 ml de 1 M de NaCl) (NaCl 1 M = 0,58 g em 10 ml de H ₂ 0)
   • KCl (6,75 ml de 1 M de KCl) (1 M KCl = 0,75 g em 10 ml de H ₂ 0)
   • Glucose (1 ml de 1 M de D-glicose) (1M de D-Glucose = 1,80 g em 10 ml de H ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml de 1 M de _MgSO4) (1 M _MgSO4 = 1,20 g em 10 ml de H ₂ 0)
   • HEPES 20 mM (1 ml de HEPES 1M) (HEPES 1 M = 2,38 g em 10 ml de H ₂ 0)
   • _CaCl2 (0,05 ml de 1M de _CaCl2) (1 M _CaCl2 = 1,47 g em 10 ml de H ₂ 0)
     Prepare todas as soluções em duas vezes destilada H ₂ O (DDH ₂ O).
2. Complete cada solução com 35 ml de _ddH2O e misturar com um agitador magnético até entãolução é alcançado.
3. Ajustar o pH de cada solução com 1 N de KOH ou HCl 1 N para se obter os valores de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 e 7,5 de pH. Em seguida, ajustar o volume com água desionizada até um volume final de 50 ml.
4. Medida 5 mg de nigericina e adicioná-lo ao 670 ul de EtOH absoluto para se preparar uma solução de 10 mM de nigericina estoque.
   Atenção: nigericina é altamente tóxico e deve ser manuseado com muito cuidado (luvas, óculos de segurança e máscara). Misture a solução por inversão até a nigericina esteja completamente dissolvido.
5. Adicionar 0,05 ml de nigericina 10 mM (concentração final 10 uM) a cada solução de calibração. Nigericina é um ionóforo que aumenta a permeabilidade da membrana da célula e causa de equilíbrio do pH intracelular e extracelular, na presença de uma concentração de despolarização de K ⁺ extracelular.
6. Soluções de calibração podem ser armazenados até 1 mês a 4 ° C

2. Preparação celular

1. Sob um Safet biológicay capuz, as células de semente de 35 milímetros x 10 milímetros em pratos de cultura de 2 ml de meio de crescimento suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos. Utilizar a quantidade de células necessárias para assegurar cerca de 50% de confluência após 24 hr.
   NOTA: Em nossos experimentos, usamos a linha de células HT-1080 e placa 1 x 10 ⁵ células por placa de cultura.
2. Determinar o número de pratos de cultura necessárias para a 5 pratos de cultura adicionais experimento e placa a ser usada para a calibração.
3. Pratos de cultura em lugar de um de 37 ° C / 5% de _CO2 durante pelo menos 24 horas.

3. Preparação de Sondas de pH sensores

1. Prepare uma solução estoque 1M da sonda fluorescente pH 8 hidroxipireno-1, 3,6 trissulfónico, sal trissódico (HPTS / piranina) em DDH ₂ a 0. Esta solução deve ser armazenada à temperatura ambiente e protegida da luz.
2. Prepara-se uma solução de reserva de 1 mM de 5 - (e-6)-carboxil seminaphthorhodafluor acetoximetil éster de etilo (C-SNARF-01:00; chamado Thereaepois SNARF-1) através da dissolução de 1 mg de SNARF-1 em 1,76 ml de DMSO. Misture bem por pipetagem repetida. SNARF-1 solução deve ser armazenada a -20 ° C e protegida da luz.

4. Labeling celular

1. Dezasseis horas antes de imagem ao vivo de células, adicionar 2 ml de solução de estoque 1M HPTS (concentração final 1 mM) para cada placa de cultura contendo 2 ml de meio completo.
2. Retorne os pratos de cultura para a incubadora. A sonda HPTS é célula-impermeant, portanto, a etiqueta organelas a sonda deve ser tomada por pinocitose. Esta condição implica que as incubações das células com HPTS são realizadas em meio de cultura suplementado com soro.
3. Após a incubação com HPTS, lavar as células duas vezes com PBS estéril e adicionar 2 ml de meio isento de soro, durante pelo menos 2 horas. A incubação com SNARF-1 tem de ser realizada em meio isento de soro, porque o soro pode impedir a absorção da sonda.
4. Adicionam-se 10 ul de uma SNARF-1 de solução stock a 1 mM para se obter afinal concentração de 5 uM e permitir que as células a incubar durante 20 minutos a 37 ° C, sob luz fraca. C-1-SNARF concentração e tempo de incubação pode variar de acordo com o tipo de célula.
5. No final da incubação, lavar as células duas vezes em PBS estéril e adicionar 2 ml de meio isento de soro.

5. Adição de pH moduladores

1. Para avaliar se o método pode detectar alterações de pH nas células, diferentes reagentes que modulam o pH intracelular pode ser usado:
   • Bafilomicina A1, um inibidor específico da V-ATPase ⁵
   • Isoforma permutador Na ⁺ / H ⁺ 1 (NHE-1) ⁶
   • _NH4Cl, uma base fraca que aumenta o pH intracelular ⁷
   1. Preparar soluções estoque de reagentes mencionados acima:
      • Bafilomicina A1: acrescentar 10 ug de bafilomicina A1 a 160 ul de DMSO para se obter uma solução stock de 100 uM
      • EIPA: adicionar 25 mg de EIPA para 1,67 ml de metanol a obtina concentração final de 50 mM
      • _NH4Cl: dissolver 0,53 g de cloreto de amónio em 10 ml de _ddH2O para obter uma concentração final de 1 mM.
      
      Nota: Todas as soluções de reserva deve ser mantida a 4 ° C, excepto para bafilomicina A1, que deve ser armazenada a -20 ° C e protegida da luz.
   2. Em pratos de cultura separados, adicionar um dos reagentes, tal como descrito abaixo:
      • 2 ul de 100 uM bafilomicina A1 (concentração final 100 nM)
      • 1 ul de EIPA 50 mM (concentração final 25 uM)
      • 40 ul de 1M _de NH ₄ Cl (concentração final 20 mM)
   3. Incubar as células durante 30 min a 37 ° C.
2. Vá para a aquisição de imagem.

6. Especificações do Microscópio de imagem de células vivas e configurações de aquisição

1. Realize imagens ao vivo de células usando uma objetiva de 40X montado em um invertido digitalização microscopia confocal espectralpe equipado com um estágio XY motorizada, uma câmara de vidro que acomoda placas de cultura de fundo em um ambiente controlado (temperatura, umidade, CO ₂₎ fase incubadora.
2. O instrumento confocal (Olympus FV1000) usada aqui está equipado com:
   • Um laser de diodo 405 nm
   • Um laser de argônio de 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm)
   • Um laser neon hélio (543 nm)
   • Objetivo de fluorita de 10x, NA0.4
   • Um objectivo LUCPLFLN 40X, NA0.60
   • Um objectivo óleo PLAPONSC PLANO APO 60X, NA1.4
   • Um espelho dicróico 405/458/488/543 DM
   • A SDM 560 e um SDM 640 filtros dicróicas
   • Um filtro de barreira BA655-755
   • A BS20/80 divisor de feixe
   • O software de análise de dados para a aquisição e análise de imagem,
3. Uma vez que a incubadora estágio tem aquecido até 37 ° C e o microscópio está configurado, coloque um prato de cultura previamente incubadas com HPTS e SNARF-1 para a câmara de estágio imagem confocal.
4. Aepois de localizar uma área de interesse, ajuste as configurações de aquisição de software Figura 1.
   • Configure dois conjuntos de canais virtuais.
   • Iniciar a primeira fase que corresponde ao HPTS excitação a 405 nm e coleta de emissão em 505-525 nm e SNARF-1 de excitação em 543 nm e coleta de emissão em 570-600 nm.
   • Inicie a segunda fase que corresponde ao HPTS excitação em 458 nm e coleta de emissão em 505-525 nm e SNARF-1 de excitação em 543 nm e coleta de emissão em 640 - 650 nm.
   • A abertura confocal está definido para 175 um por padrão e abertura ideal precisa ser configurado manualmente em 300 mm.
   • Tome Imagem por empilhamento de série secções ópticas horizontais (800 x 800 pixels) de 0,4 m de espessura.

NOTA: uma objetiva de 40X é útil para observar várias células simultaneamente e funciona bem para a visão organela. No entanto, a resolução espacial e intensidade do sinal são better conseguido usando uma objetiva de óleo 60X. Além disso, não há excitação ou de emissão de conversa cruzada entre os dois corantes.

7. Calibração de Sondas de pH de sensoriamento

1. Antes da calibração, remover o meio da placa de cultura previamente incubadas com HPTS e SNARF-1, lavar duas vezes com PBS estéril e, em seguida, adicionar 2 ml de uma das cinco soluções de calibração.
2. Coloque o prato de cultura na câmara de estágio confocal.
3. Vá para a aquisição de imagens de lapso de tempo de acordo com as seguintes definições:
   1. Defina o número de imagens e tempo de duração do intervalo para o experimento.
      NOTA: Normalmente usamos um intervalo de 1 min entre as imagens por até 30 min.
   2. Programe o obturador para fechar entre a aquisição de cada imagem.
4. Gravar a intensidade de fluorescência por minuto em um software de folha de cálculo e de determinar o momento em que a intensidade de fluorescência é constante. PH intracelular é geralmente estável depois de 15 - 20 min.
5. REPEAT os passos 7.1 a 7.4 usando um novo prato de cultura para cada solução de calibração restante.

8. Aquisição de Dados

1. Uma vez que a calibração foi feito, adquirir dados de amostra 4-5 campos escolhidos aleatoriamente contendo 15-20 células por campo. Duas imagens são obtidas para cada campo: um para rotulagem HPTS (vesículas) e o segundo para SNARF-1 rotulagem (citosol).
2. A fluorescência de fundo (zona extracelular) é subtraído digitalmente imagens fluorescentes de ambas as sondas. Vesículas rotulados e citosol de suas respectivas imagens armazenadas são selecionados usando uma máscara binária. Para cada sonda de pH-sensing, intensidades de fluorescência são medidos em uma escala numérica (0-4,095 escala de nível de cinza). A intensidade média de todos os pixels na organelo ou citoplasma é calculada e os valores são utilizados para calcular os rácios de fluorescência.

9. Data Analysis

1. Vários pacotes de software estão comercialmente disponíveis para a análise de dados. IstoSoftware FluoView.
2. Em uma planilha, valores de registro e calcular índices de fluorescência da seguinte forma: No caso de HPTS, R = (F _{458 nm} / F _{405 nm)} e, no caso de SNARF-1, R = (F _{644 nm} / F _{584 nm} ).
3. Plotar os dados usando o software de gráficos científica como GraphPad Prism. A trama deve representar proporções de fluorescência (eixo Y) como uma função do pH (eixo X). Ajuste de curva é obtida por meio de regressão não-linear.
4. Recolhe intensidades de fluorescência das amostras, conforme descrito no passo 8.2 e calcular rácios de fluorescência. Use as curvas de calibração para transformar proporções em valores de pH.

Resultados

Para a medição simultânea de pH em ambos os compartimentos da célula intracelular e endossomal / lisossomal, foram usadas as sondas de pH de detecção fluorescente raciométrica Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 é restrita ao compartimento citosólico enquanto HPTS permite a medição de o compartimento endossomal / lisossomal raciométrica pH. Carregamento celular com HPTS para 16 horas permite a sua localização seletiva em endossomas / ⁴ lisossomos. Um exemplo típico de fluorescência registada a partir de células HT-1080 c...

Discussão

Medição de pH quantitativa em imagens ao vivo de células de diferentes compartimentos celulares é necessário para medir com precisão as variações de pH em respostas das células aos desafios externos. No entanto, um dos principais obstáculos que resta é fácil e visam especificamente compartimentos celulares. A este respeito, alguns estudos puseram em evidência o uso de HPTS como um indicador de pH intracelular introduzido nas células por electroporação ou microinjecção ^8-10. Estas técnicas sofrem de graves inc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soluções para calibração
Cloreto de sódio	Fischer	L-11621
Cloreto de potássio	Fischer	M-12445
D-Glicose (dextrose)	Fischer	D16-1
Sulfato de magnésio	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloreto de cálcio di-hidratado	Fischer	M-1612
Água deionizada	N/A	N/A
Nigericina	Calbiochem	481990	Tóxico por inalação ou em contato com a pele
Mantenha protegido da luz a 4 ° C
Placas de cultura &vazias; 35mm	BD Biosciences	354456
sondas
8-Hidroxipireno-1,3,6-ácido trisulfônico (HPTS)	Life technologies	H-348	Mantenha longe da luz à temperatura ambiente
5-(e-6)-Carboxy SNARF®-1, Éster Acetoximetílico, Acetato	Life technologies	C-1271	Mantenha longe da luz e da umidade a -20 > C
Dimetil Sufoxide (DMSO)	Fischer	BP231-1	nocivo
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 100X
Cloreto de potássio	Fischer	M-12445	20 g
Fosfato de sódio monobásico	Fischer	S369-1	115 g
Fosfato de potássio monobásico	J.T Baker	3246-01	20 g
Água deionizada	N/A	N/A	Leve para 1 L
Autoclave e ajuste o pH para 7,4
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Cloreto de sódio	Fischer	L-11621	40,5 g
Água desoinizada	N/A	N/A	Leve para 5 L
moduladores
Bafilomicina A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5- (N-Etil-N-isopropil)amilorida (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Cloreto de amônio	Fischer	A649-500

sensíveis ao pHde pH