Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Resumo

Vários métodos estão disponíveis para medir o pH intracelular, mas muito poucos deles permitem a medição simultânea do pH citoplasmático e organelar. Aqui, descrevemos em detalhes uma metodologia rápida e precisa para medir simultaneamente o pH citoplasmático e vesicular por imagem raciométrica de células vivas.

Resumo

O pH intracelular é rigidamente regulado e diferenças de pH entre o citoplasma e as organelas foram relatadas¹. A regulação do pH celular é crucial para o controle homeostático de processos fisiológicos que incluem: síntese de proteínas, DNA e RNA, tráfego vesicular, crescimento celular e divisão celular. Alterações na homeostase do pH celular podem levar a alterações funcionais prejudiciais e promover a progressão de várias doenças². Vários métodos estão disponíveis para medir o pH intracelular, mas muito poucos deles permitem a medição simultânea do pH no citoplasma e nas organelas. Aqui, descrevemos em detalhes um método rápido e preciso para a medição simultânea do pH citoplasmático e organelar usando microscopia confocal em células vivas³. Este objetivo é alcançado com o uso de dois corantes raciométricos com sensor de pH que possuem particionamento seletivo do compartimento celular. Por exemplo, SNARF-1 é compartimentado dentro do citoplasma, enquanto HPTS é compartimentado dentro de organelas endossômicas / lisossômicas. Embora o HPTS seja comumente usado como um indicador de pH citoplasmático, esse corante pode rotular especificamente vesículas ao longo da via endossômico-lisossômica após ser absorvido pela pinocitose^3,4. Usando essas sondas de detecção de pH, é possível medir simultaneamente o pH dentro dos compartimentos endocítico e citoplasmático. O comprimento de onda de excitação ideal do HPTS varia dependendo do pH, enquanto para o SNARF-1, é o comprimento de onda de emissão ideal que varia. Após o carregamento com SNARF-1 e HPTS, as células são cultivadas em diferentes soluções calibradas de pH para construir uma curva padrão de pH para cada sonda. A imagem celular por microscopia confocal permite a eliminação de artefatos e ruído de fundo. Devido às propriedades espectrais do HPTS, esta sonda é mais adequada para medição do compartimento endossômico levemente ácido ou para demonstrar a alcalinização das organelas endossômicas/lisossômicas. Este método simplifica a análise de dados, melhora a precisão das medições de pH e pode ser usado para abordar questões fundamentais relacionadas à modulação do pH durante as respostas celulares a desafios externos.

Protocolo

1. Preparação das soluções de calibração para pH celular

1. Adicionar os seguintes compostos de cinco tubos cónicos de 50 ml separados para preparar soluções a 5 para ser utilizados para a calibração:
   • De NaCl (1 ml de 1 M de NaCl) (NaCl 1 M = 0,58 g em 10 ml de H ₂ 0)
   • KCl (6,75 ml de 1 M de KCl) (1 M KCl = 0,75 g em 10 ml de H ₂ 0)
   • Glucose (1 ml de 1 M de D-glicose) (1M de D-Glucose = 1,80 g em 10 ml de H ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml de 1 M de _MgSO4) (1 M _MgSO4 = 1,20 g em 10 ml de H ₂ 0)
   • HEPES 20 mM (1 ml de HEPES 1M) (HEPES....

Resultados

Para a medição simultânea de pH em ambos os compartimentos da célula intracelular e endossomal / lisossomal, foram usadas as sondas de pH de detecção fluorescente raciométrica Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 é restrita ao compartimento citosólico enquanto HPTS permite a medição de o compartimento endossomal / lisossomal raciométrica pH. Carregamento celular com HPTS para 16 horas permite a sua localização seletiva em endossomas / ⁴ lisossomos. Um exemplo típico de fluorescência registada a partir de células HT-1080 c.......

Discussão

Medição de pH quantitativa em imagens ao vivo de células de diferentes compartimentos celulares é necessário para medir com precisão as variações de pH em respostas das células aos desafios externos. No entanto, um dos principais obstáculos que resta é fácil e visam especificamente compartimentos celulares. A este respeito, alguns estudos puseram em evidência o uso de HPTS como um indicador de pH intracelular introduzido nas células por electroporação ou microinjecção ^8-10. Estas técnicas sofrem de graves inc.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soluções para calibração
Cloreto de sódio	Fischer	L-11621
Cloreto de potássio	Fischer	M-12445
D-Glicose (dextrose)	Fischer	D16-1
Sulfato de magnésio	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloreto de cálcio di-hidratado	Fischer	M-1612
Água deionizada	N/A	N/A
Nigericina	Calbiochem	481990	Tóxico por inalação ou em contato com a pele
Mantenha protegido da luz a 4 ° C
Placas de cultura &vazias; 35mm	BD Biosciences	354456
sondas
8-Hidroxipireno-1,3,6-ácido trisulfônico (HPTS)	Life technologies	H-348	Mantenha longe da luz à temperatura ambiente
5-(e-6)-Carboxy SNARF®-1, Éster Acetoximetílico, Acetato	Life technologies	C-1271	Mantenha longe da luz e da umidade a -20 > C
Dimetil Sufoxide (DMSO)	Fischer	BP231-1	nocivo
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 100X
Cloreto de potássio	Fischer	M-12445	20 g
Fosfato de sódio monobásico	Fischer	S369-1	115 g
Fosfato de potássio monobásico	J.T Baker	3246-01	20 g
Água deionizada	N/A	N/A	Leve para 1 L
Autoclave e ajuste o pH para 7,4
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Cloreto de sódio	Fischer	L-11621	40,5 g
Água desoinizada	N/A	N/A	Leve para 5 L
moduladores
Bafilomicina A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5- (N-Etil-N-isopropil)amilorida (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Cloreto de amônio	Fischer	A649-500

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