Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Resumo

Ensaio única expressão gênica de células é necessária para a compreensão da heterogeneidade de células-tronco.

Resumo

A heterogeneidade da população de células-tronco dificulta compreensão detalhada da biologia de células-tronco, tais como a sua propensão para a diferenciação diferentes linhagens. Um ensaio de transcriptoma única célula pode ser uma nova abordagem para dissecar variação individual. Desenvolvemos o método de uma única célula de qRT-PCR, e confirmaram que o método funciona bem em vários perfis de expressão de gene. Em nível de uma única célula, cada célula-tronco embrionárias humanas, classificado por OCT4 :: células positivas EGFP, tem alta expressão no OCT4, mas um nível diferente de expressão NANOG. Nosso ensaio de expressão único gene da célula deve ser útil para interrogar heterogeneidades da população.

Introdução

Populações eucariotos maioria superiores são heterogêneos, assim, com a análise da amostragem populacional, muitas vezes é difícil de interpretar as suas características celulares. As células individuais dentro de uma população pode ser sutilmente diferente, e essas diferenças podem ter consequências importantes para a propriedade ea função de toda a população ^{1, 2.} Especialmente, as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são conhecidos por ser heterogêneo, o que provoca diferentes níveis de pluripotência e diversas potencialidades para especificação das linhagens em delicadamente e distintas formas ^{3, 4.} Por exemplo, os antigénios de superfície de células diferentes podem ser usados ​​para classificar as células estaminais pluripotentes indiferenciadas, ⁵ e o grupo Austin Smith propostos diferentes níveis de pluripotência em mastócitos embrionários de ratinho, com base na sua morfologia, propensão diferenciação e dependência da via de sinalização ^6. Este fenômeno foi levantada a hipótese de embrião humanoAs células estaminais nic ^7. Considerando que os estudos gerais foram realizadas entre as diferentes linhas de células estaminais, e não células-tronco único indivíduo, que poderia ser muito interessante para analisar diferentes níveis de pluripotência no nível da célula única, o que potencialmente afeta as suas capacidades de diferenciação em relação a todas as linhagens de células somáticas.

Heterogeneidade celular e molecular pode ser ditada pela transcrição de perfil, que é chamado de 'transcriptoma única célula' e destaca novas abordagens para quantificar os níveis de expressão do gene ^8-10. Para a análise dos níveis de expressão de genes em células individuais, foi desenvolvido um protocolo simples, mas robusta de uma única célula RT-PCR quantitativo. Foi confirmada a eficácia e viabilidade do nosso protocolo, comparando cada metade de lisados ​​de células individuais, bem como RNAs totais diluídas em série de hESCs, resultando em variações técnicas mínimas e diferenças. Além disso, foi utilizada uma linha repórter genética para isolar homogênea população de hESCs utilizando sistema de metas de gene. O vector dador de segmentação OCT4 lócus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construção) e um par de plasmídeos talen foram usadas ^11. O vetor doador e um par de plasmídeos Talen foram introduzidos hESCs (H9, WA09) usando nosso nucleofection e protocolo de seleção clonal e manutenção de hESCs foi realizada com base no nosso protocolo de rotina ^12. Nós confirmamos esta linha repórter genética expressar EGFP para a expressão OCT4 em OCT4 :: EGFP hESCs.

Nosso resultado demonstra que hESCs individuais (classificadas por OCT4 :: EGFP células fortemente positivas) manter altos níveis de expressão OCT4, mas diferentes níveis de expressão NANOG. Então, o nosso ensaio de expressão único gene de células deve ser útil para estudar as heterogeneidades da população de células-tronco pluripotentes.

Protocolo

1. Preparação de uma placa de 96 poços

1. Misture 1 ml de Single Cell DNase1 a 9 mL Single Cell Lysis Solution.
2. Coloque a solução mista de 10 mL em cada poço da placa de 96 poços de PCR.

2. Detaching hESCs para FACS Purificação

1. Separar OCT4 :: linha de células ES a partir de EGFP o prato de 60 mm e 1 ml de Accutase durante 20 min, a 37 ° C, as quais foram neutralizadas com meio ES humano.
2. Prepare a população de células em 1 ml de tampão de FACS e ajustar o celular para 1 x 10 ⁶ células / ml.
3. Passar a amostra de células através de um coador de células de 35 mM tampão tubo.
4. Armazenar o tubo em gelo antes de separação de células.

3. Lise de FACS purificado célula única em cada poço da placa de 96 poços

1. Classificar a amostra para células positivas EGFP em um classificador de células com um operador treinado. Coloque a única célula em solução Lysis/DNase1 única célula em placa de 96 poços PCR. Se necessário, a 96 poços da placa com a amostra pode ser armazenada num congelador a -80 ° C de profundidade inferior a um mês.
2. Incubar as amostras 5 min à temperatura ambiente para a lise celular.
3. Adicionar 1 ml de solução de paragem para parar reação de lise.
4. Incubar 2 min à temperatura ambiente.

4. Transcrição reversa

1. Adicione a cada uma alíquota de 0,5 mL de 20 mM SMA-T15, SMA-A.
2. Adicionar tampão 4 uL de 5X, 2 uL de DTT, 1 ul de transcriptase reversa, e 1 ul de dNTP em cada poço.
3. Realizar a transcrição reversa num termociclador.
   1. Definir o programa térmico a 42 ° C x 90 min e inactivar transcriptase reversa a 85 ° C x 5 min.

5. Amplificação

1. Adicionar 4 mL de reagente ExoSAP-IT para cada amostra transcrita reverter.
   1. Incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min e 80 ° C durante 15 min para inactivar o reagente ExoSAP-IT.
2. Preparar a mistura de reacção de PCR wom SMA-p2 (2 nM)
3. Adicionam-se 10 ul de mistura de reacção de PCR para cada uma das amostras de transcrição reversa.
4. Realizar a amplificação, consistindo em 20 ciclos de desnaturação (94 ° C durante 30 seg), emparelhamento (57 ° C durante 30 seg) e extensão (68 ° C durante 10 min).

6. Desempenho de qRT-PCR

1. Adicionar 10 ul de 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul de amplificado de ADNc, os iniciadores 2 nM, e 7 mL de água a cada poço.
   1. Definir o programa seguido por 95 ° C durante 3 seg, 60 ° C durante 30 seg x 40 ciclos.
2. Realiza-se em duplicado por erros técnicos.

Resultados

Amplificação de RNA única célula eficiente e robusta

Para minimizar a variação transcricional entre hESCs, usamos OCT4 :: EGFP hESC clone para FACS purificação. Após a separação de células positivas Oct4 :: EGFP em uma placa de 96 poços, cada célula é lisadas em tampão de lise e convertido poli (A) + RNA para cDNA de comprimento completo utilizando o SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) e iniciador de ancoragem com o SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) usando a tecn...

Discussão

Profiling gene célula única pode ser uma ferramenta importante para prever a funcionalidade de uma única célula ou uma população inteira. Devido a uma limitação técnica, análise de perfis gene inteiro tenha sido restrita às médias populacionais. As variações nos padrões de expressão dos genes e os níveis de entre as células individuais e as subpopulações foram propostos para fazer com que a interpretação errada. Tais aspectos celulares diferentes podem ser encontrados em hESCs e sua heterogeneidade faz com que a capacid...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de PCR de 96 poços	USA scientific	1402-8900
Kit de Lise de Células Ambion	Technologies	4458235
SMARTScribe Transcriptase Reversa	Clonetech	639536
ExoSAP-IT	USB	78200
Platinum Taq DNA polimerase Alta Fidelidade	Invitrogen	11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade	Invitrogen	18427
SYBR Universal 2X Master Mix	Kapa biosystem	KR0389
Accutase	Innovative Cell Tech	S-1100-1
FACS tampão			45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μ l DNase, filtro esterilizado
35 μ tubos de filtro de células m BD	Biosciences	352235