Summary
يتم وصف طرق الكروماتوغرافي طبقة رقيقة (TLC) فصل المستخلصات النباتية وbioautography الاتصال لتحديد نواتج مضادة للجراثيم. يتم تطبيق أساليب لفحص المركبات الفينولية البرسيم الأحمر تثبيط فرط إنتاج الأمونيا البكتيريا (HAB) الأصلي إلى الكرش البقري.
Abstract
يتكون شاشة مشترك لمصنع المركبات المضادة للميكروبات فصل المستخلصات النباتية عن طريق الورق أو اللوني طبقة رقيقة (TLC أو PC)، وفضح المخططات الاستشرابية لتعليق الميكروبية (مثل الفطريات أو البكتيريا في مرق أو أجار)، مما يتيح الوقت للميكروبات أن تنمو في بيئة رطبة، وتصور المناطق مع عدم وجود نمو الميكروبات. فعالية هذا الأسلوب الفرز، والمعروفة باسم bioautography، ويعتمد على كل من نوعية الفصل الكروماتوغرافي والرعاية التي اتخذت مع الظروف الثقافة الميكروبية. وتصف هذه الورقة البروتوكولات القياسية لTLC والاتصال bioautography مع تطبيق رواية لالأمينية البكتيريا تخمر حامض. يتم فصل استخراج على مرونة (المدعومة من الألومنيوم) لوحات السيليكا TLC، وتصور العصابات تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء. يتم قطع مناطق من وحضنت وجهه لأسفل على أجار تلقيح مع اختبار الكائنات الحية الدقيقة. وتصور العصابات المثبطة التي كتبها تلطيخ لوحة آغارق مع نتروبلو الحمراء. يتم تطبيق طريقة لفصل البرسيم الأحمر (نفل pratense السيرة الذاتية. Kenland) المركبات الفينولية والفرز من أجل نشاط ضد كلوستريديوم sticklandii، على إنتاج الأمونيا بكتيريا فرط (HAB) التي هي أصلية في الكرش البقري. تطبيق أساليب TLC لأنواع عديدة من المستخلصات النباتية والأنواع البكتيرية الأخرى (الهوائية أو اللاهوائية)، فضلا عن الفطريات، ويمكن أن تستخدم الكائنات اختبار إذا تم تعديل الشروط الثقافة لتناسب متطلبات نمو الأنواع.
Introduction
يعاير عن المركبات المضادة للميكروبات في محطات يتطلب فصل مكونات مستخلصات نباتية، وفضح الكائنات الحية الدقيقة اختبار لتلك المكونات، وتحديد ما إذا كان يتم تثبيط نمو الكائنات الحية الدقيقة من قبل أي من المركبات. فصل من ورقة أو اللوني طبقة رقيقة (TLC أو PC) هي مريحة لأن العديد من المركبات يمكن فصل على سطح مستو. ويستند الفاصل على قطبية، مع بعض المركبات ملزمة بإحكام إلى مكثف (السليلوز في حالة الكمبيوتر، ومجموعة متنوعة من الممتزات في حالة TLC) والهجرة أقل من غيرها 1. الشكل 1 يوفر مثالا على الأوضاع النسبية لل المركبات الفينولية القطبية وغير القطبية بعد الانفصال على طبق من السيليكا TLC.
الشكل 1. وتستخدم بياني يوضح توزيع المركبات من أقطاب مختلفة بعد الانفصال على السيليكا طبقة رقيقة الكروماتوغرافي (TLC) لوحة. مركبات الفينول من البرسيم الأحمر (نفل pratense L.) كمثال. مركبات قطبية، مثل clovamide، لديها تقارب قوي لمكثف القطبية مثل السيليكا وتبقى بالقرب من المنشأ (OR)، في حين أن مركبات القطبية أقل، مثل الايسوفلافون ثلاثة قرب الجبهة المذيبات (SF)، والتقسيم بسهولة أكبر في المذيبات (التي هي أقل من السيليكا القطبية ما لم يتم تضمين الماء، والأحماض، أو القواعد) وتهاجر أبعد تصل اللوحة.
بعد فصل مقتطف على لوحة TLC، يمكن أن يتعرض الكائنات الدقيقة اختبار لجميع المركبات على لوحة، وبالتالي تسريع التعرف على مكونات نشطة من مقتطف 2. إذا تعرضت ثقافة الفطرية أو البكتيرية إلى اللوني، وسوف يحدث نمو الجراثيم في كل مكان ما عدا في مناطق مع النمو المانعمركبات ذ. مناطق تثبيط ثم يمكن تصور بملاحظة التناقض بين النمو أفطوري والمناطق الخالية من النمو إذا تم تطبيقها الفطريات 3 أو عن طريق الرش مع المركبات التي تغير لونها عندما خفضت أو تحلل من قبل الخلايا الحية 4. على الرغم من أن استخدام ورقة أو رقيقة طبقة المخططات الاستشرابية لفحوصات مضادة للميكروبات تم تطبيق أول من المضادات الحيوية ومبيدات الفطريات 5 3،6، والآن في كثير من الأحيان فحص المستخلصات النباتية للمركبات المضادة للميكروبات مع هذا الأسلوب، وغالبا ما يشار إليها باسم bioautography. البروتوكولات وصف ينطبق هنا لbioautography من المخططات الاستشرابية طبقة رقيقة. ويستخدم على نطاق واسع TLC لأنه سريع نسبيا ويمكن تنفيذها على الممتزات مختلفة (مثل السيليكا، والنشا، والألومينا)، فضلا عن تقديم قرار جيد وحساسية 1.
المستخلصات النباتية يمكن أن تكون على استعداد لTLC في نواح كثيرة. وتشمل الطرق الشائعة استخراج المواد النباتية في ALCمخاليط ohol المياه مثل الايثانول 80٪ 7،8، وربما مع إضافة حمض أو قاعدة 9. بعد استخراج في مثل المذيبات، والتي تحتوي على بعض الماء وربما هي الحمضية أو الأساسية، يجب أن تتركز مقتطفات بحيث يمكن تطبيقها على لوحات TLC في حجم الحد الأدنى. ويمكن تحقيق تركيز الكحول مقتطفات المياه عن طريق تقسيم مع إمتزاج الماء أو المذيبات العضوية 8 مع خليط من هذه المذيبات، مثل إيثيل الأثير، خلات الإيثيل (1:1، ت / ت) 10،11. يتم استخراج نواتج الأيض النباتية المختلفة في المذيبات العضوية المختلفة، اعتمادا على أقطاب بهم. لضمان أن يتم استخراج النباتية الأحماض العضوية أو القواعد الى المذيبات العضوية في هذه المرحلة، ودرجة الحموضة لاستخراج المياه الكحول يمكن رفع أو خفض مع حامض للذوبان في الماء أو قاعدة لتحويل التحاليل فصلها في أشكالها nondissociated، والتي هي ثم قابل للذوبان في المذيبات العضوية محايد 9. ويمكن بعد ذلك تكون المرحلة العضوية البريدvaporated تحت ضغط منخفض أو تحت النيتروجين وتعديلها لحجم المطلوب لTLC. الرقم الهيدروجيني للاستخراج من غير المرجح أن تكون قاتلة للميكروبات الأحيائي بسبب التقسيم من analytes في المذيبات محايدة، صغيرة الحجم النهائي، والتبخر للاستخراج على لوحة TLC قبل الانفصال.
ويعمل كل من الفطريات والبكتيريا مثل الكائنات الحية الدقيقة في اختبار bioautography من المستخلصات النباتية 2. أبواغ الفطريات بعض، مثل المبغثرة الطيرية، تنبت على لوحات TLC (وبصرف النظر عن المناطق مع المركبات المثبطة) إذا رش على لوحات في المحلول المغذي وحضنت في بيئة رطبة لعدة أيام 3. أفطورة المظلم من C. الطيرية على مناطق noninhibitory يوفر تناقض حاد مع المناطق الحرة من النمو أفطوري. على الرغم من أن البكتيريا تم تطبيقها على طبقة رقيقة اللوني (TLC) لوحات بنفس الطريقة 4،12، وسكب البكتيريا أيضا أكثر من TLCالسطوح وحة في أجار يعلو 13،14. الخميرة، مثل المبيضات البيض، ويمكن تطبيقها في تراكب أجار وكذلك 14. بدلا من ذلك، لوحات TLC يمكن وضعها مقلوبة على أجار تلقيح مع البكتيريا أو الخميرة 10،15 8، طريقة تعرف باسم الاتصال bioautography 2.
نحن تصف طريقة للاتصال bioautography للكشف عن المركبات الفينولية المضادة للميكروبات من البرسيم الأحمر (نفل pratense السيرة الذاتية. Kenland). الكائنات الحية الدقيقة الاختبار هو sticklandii كلوستريديوم، وهو فرط انتاج الأمونيا بكتيريا الكرش (HAB) واهوائي مجبر. على الرغم من أن فصل المستخدمة لا حل جميع مكونات استخراج، كانت تسهل تحديد مناطق نشاط مضادات الميكروبات، وبالتالي تضييق مجموعة من المركبات المضادة للميكروبات ممكن. بروتوكول يستخدم إجراءات موحدة لTLC 1. يصف البروتوكول أيضا بعض التقنيات اللازمة لزراعة obliاللاهوائيات بوابة لمثل هذا الفحص، واستخدام الاتصال bioautography 15 وطريقة التصور مع الملح نتروبلو، التي بقع الخلايا الحية 2،4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد مستخلصات نباتية
- يرى كاغان وFlythe 10 لاستخراج المركبات الفينولية من نفل pratense السيرة الذاتية. Kenland.
- لاستخراج المركبات الأخرى في النباتات الأخرى، والتحقق من الأدب التحليل الكيميائي النباتي لأساليب الاستخراج نبات أو المستقلب محددة (وكثير موصوفة)، أو للبحث عن بروتوكولات مثل تلك التي خرام وآخرون 7،8 الذي عزل العديد من المركبات مع واسعة مجموعة من التناقضات.
2. إعداد لوحات رقيقة طبقة
- لوحات TLC نظيفة من خلال تطوير في واحدة أو أكثر القطبية والمذيبات محايدة، من أجل التحرك الملوثات كثف بعيدا عن منطقة النمو.
- في غطاء الدخان، وإعداد ما يكفي من تنظيف المذيبات (مثل 15-100 مل من خلات الإيثيل الميثانول 2:1، ت / ت) لتغطية الجزء السفلي من الغرفة TLC النامية، فضلا عن الحافة السفلية من لوحة TLC عندما مجموعة داخل الغرفة.
- استخدام تسويقيةالزجاج المتاحة cially TLC النامية غرف (الأحجام المختلفة المتاحة، مع الأغطية) أو المغطاة احباط الأكواب بيركس أو الجرار المحافظة.
- استخدام مقص لقطع الألومنيوم أو (مرنة) لوحات هلام السيليكا المدعومة من البلاستيك، والتي تأتي في مختلف الأحجام (20 سم × 20 سم وأصغر)، لتناسب غرفة النامية المتاحة. (تنبيه: السيليكا يمكن أن تسبب تلفا رئويا في حالة استنشاقه العمل في غطاء الدخان، والتعامل مع لوحات TLC مع قفازات لتجنب الحصول على زيوت الجلد على السيليكا.)
- إدراج لوحات في غرفة، مع قمم يتكئ على جدران الغرفة. يجب أن لا تلمس لوحات بعضها البعض. تغطية القاعة والسماح للمذيب تتحرك صعودا لوحة من قبل عمل شعري.
- عندما وصلت المذيبات الجزء العلوي من لوحات، وإزالة لوحات من غرفة وترتيب في وضع الوقوف داخل غطاء الدخان حتى يتبخر المذيب.
- تحقق لمعرفة ما إذا كان قد هاجر الشوائب بالقرب من أعلى لوحة TLC التي كتبها تبحث عن الفرقة الصفراء تحت مرئيةالضوء، أو فرقة الفلورسنت تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء (انظر "الجبهة النجاسة" أو IF في الشكل 2B). إذا كانت الغالبية العظمى من لوحة لا يزال لديه لون مصفر، وتكرار عملية التنظيف.
- بعد إزالة لوحات TLC من الغرفة، وتجاهل المذيبات. تسمح المذيبات المتبقية لتتبخر تماما قبل استخدام الغرفة لبروتوكول 2.
- لإزالة الرطوبة المتبقية التي يمكن أن تؤثر الهجرة من المركبات على السيليكا 16، دعم لوحات تستقيم في فرن التجفيف عند 100 درجة مئوية (10-15 دقيقة ل20 سم × 20 سم لوحة، و 5 دقائق لمدة 7 سم × 10 سم لوحات ).
- إذا فرن تجفيف 100 درجة مئوية ليست متاحة، لوحات حرارة لفترة أطول من الوقت في درجات حرارة منخفضة (أي 40 دقيقة في 60 درجة مئوية).
- بعد لوحات جافة، والسماح لهم يبرد إلى درجة حرارة الجو المحيط قبل التحميل.
3. إعداد النامية غرف لاستخراج الفصل
4. التحميل والتنمية من لوحات TLC
- بخفة بمناسبة الأصل مع قلم رصاص. إذا كانت لوحة مكثف TLC لينة وتلف بسهولة، وجعل علامات على الحواف. يجب أن تكون مركبات فوق سطح المذيب النامية عندما يتم إدراج لوحات في غرفة TLC.
- تذوب في المذيبات العضوية مقتطفات يكفي (في هذه الحالة، والميثانول) أن يكون لها حل المركزة بدلا من عكرالتعليق.
- تحميل عينات والمعايير كما نطاقات ضيقة مع حقنة ميكروليتر أو بال micropipettes الشعرية، وترك الحدود 1 سم على جانبي اللوحة. السماح للعصابات لتجف (تأجيج وحة أو تحميله في غطاء الدخان يساعد).
- إذا كانت هناك حاجة إلى تركيز أكبر من العينة على طبق من ذهب، "overspot" حسب العينات التحميل مرة أخرى على العصابات المجففة.
- بالملقط أو ملقط، تعيين لوحة (ق) داخل غرفة TLC المشبعة. يجب أن لا تلمس لوحات الفتيل لأنها قد توفر المذيبات إلى لوحات في نقاط الاتصال، وبالتالي تغيير مسار الهجرة المجمع. تغطية القاعة والسماح لوحات تطويرها.
5. إعداد لوحات للالأحيائي
- إزالة لوحة (ق) من خزان TLC قبل أن تصل الجبهة المذيبات الجزء العلوي من لوحة، وعلامة على ارتفاع الجبهة مذيب مع قلم رصاص. السماح لوحة جافة في الدخان غطاء محرك السيارة.
- وضع أي لوحات TLC المتبقية في نفس الغرفة TLC، وهو جنرال الكتريكnerally صالحة للاستعمال لمدة يوم كامل إذا ما واصلت مغلقة. إعادة تشكيل خليط مذيب للغرفة TLC إذا كانت كمية المذيب في غرفة يقلل أبرزها.
- بعد لوحات جافة، تصور العصابات تحت الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية، وترسيم العصابات مع قلم رصاص. وغرفة عرض مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة غير مريحة، وخاصة إذا كان مصباح يمكن الكشف عن المركبات في كل 254 نانومتر (الموجة القصيرة الأشعة فوق البنفسجية) و 365 نانومتر (الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة).
ملاحظة: عند هذه النقطة أو بعد الخطوة التالية، لوحات يمكن أن تكون ملفوفة في غلاف بلاستيكي، مع تغطية احباط، وتخزينها في -20 درجة مئوية. الحد الأقصى للوقت تخزين يعتمد على الاستقرار المجمع. لأن السيليكا ليست محايدة، قد تكون بعض المركبات تتحلل بينما على لوحة TLC. - تصوير أو رسم لوحات.
- استخدام نظام هلام photodocumentation إذا كان أحد مجهزة للأشعة فوق البنفسجية النفقات العامة و / أو أضواء مرئية هو متاح.
- إذا لم يكن هناك نظام photodocumentation التجارية متاحة، واصطف لوحات صورة داخل مربع مع ورقة أو قطعة قماش داكنة، وايمجموعة ال الكاميرا على ترايبود وضوء الأشعة فوق البنفسجية المحمولة فرضت لحلقة الوقوف 17. عند تصوير لوحات التي لديها أي مؤشر الفلورسنت، واستخدام عامل تصفية الضوء الأزرق خلال عدسة الكاميرا لتحسين مظهر الفرقة 17.
- للمساعدة في تشخيص العصابات، وحساب عامل الاستبقاء (R و) القيم عن طريق قياس المسافات التي تقطعها المركبة وجبهة المذيب، وتقسيم السابق من قبل (2A الشكل) الأخير.
6. البكتيرية الثقافة والفحص
- إعداد وتطعيم وسائل الاعلام تحت الظروف اللاهوائية. كانت الثقافة المستخدمة في هذه الحالة كلوستريديوم sticklandii سلالة ريال، والتي تم الحصول عليها من مجموعة ثقافة جيمس ب. راسل، جامعة كورنيل، إيثاكا، نيويورك.
- انظر Flythe وكاغان 13 وقائمة المواد للحصول على وصف HAB سائل الإعلام.
- تنمو ثقافة إلى مرحلة الأسي أو ثابتة. استخدام معقم اللاهوائية التقنيهوفاق عند العمل مع الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية.
- تطعيم ثقافة (1٪ ت / ت) في أجار المنصهر بعد درجة حرارة أجار (0.75٪ ث / ت) قد انخفض إلى أقل من 60 درجة مئوية. المزيج بلطف وجلب على الفور الى غرفة اللاهوائية (95٪ CO 2 -5٪ H 2 الغلاف الجوي للHAB سائل الإعلام) لتصب.
- تصب 15 ملم × 100 ملم البلاستيك أطباق بتري، والسماح ليصلب.
- مع مقص، وقطع لوحة TLC في المناطق التي تحتوي على الفرقة (ق) من الفائدة. وضع العصابات وجهه لأسفل على لوحات أجار، بمناسبة العصابات على دعم لوحة لتتبع التوجه الأصلي على لوحة TLC. وضع الشريط على TLC غير المستخدمة على لوحة أجار كمجموعة تحكم.
- احتضان لوحات أجار، جنبا أجار أسفل، في غرفة اللاهوائية (24 ساعة و 39 درجة مئوية).
7. تصور Bioassayed آجار لوحات
- مع ملقط، إزالة العصابات من لوحات أجار أثناء وجودهم في غرفة اللاهوائية.
- إضافة 1٪ (ث / ت) الشركة المصرية للاتصالاتtrazolium الأحمر، الذي أعد في الماء، قطرة قطرة على أسطح لوحات أجار. تسمح اللون لتطوير لمدة 20 دقيقة على الأقل، أو حتى يتحول لوحة تحكم الحمراء تماما، قبل إزالة من غرفة اللاهوائية. وسوف تبدأ البكتيريا اللاهوائية أن تفقد صلاحية مباشرة بعد إزالة من غرفة اللاهوائية، ولكن اللون هو مستقر لأكثر من 24 ساعة.
- تصوير تحت الضوء المرئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر ممثل فصل السيليكا TLC من البرسيم الأحمر (نفل pratense السيرة الذاتية. Kenland) مقتطفات، التي تحتوي على مركبات فينولية، في الشكل 2. فصل الأحمر استخراج البرسيم في خلات الإيثيل الهكسان (9:1، ت / ت)، وأكثر من 8.5 سم، وأسفرت عن خمسة فرق، واحدة حل غير كامل من أصل (الشكل 2A). ومع ذلك، يوضح الشكل 2B التي كشفت عن العديد من ضعف العصابات عندما تم فصل عينة مختلفة من استخراج البرسيم الأحمر (من نفس الصنف، ولكن نمت في مؤامرة منفصلة في نفس المزرعة) على مسافة أكبر (15 سم بدلا من 8.5 سم) ومع اثنين من التطورات المتلاحقة في أنظمة المذيبات المختلفة. تم تطوير اللوني في الشكل 2B الأولى في خلات الإيثيل الهكسان (9:1، ت / ت)، ثم يترك ليجف وفصل في الإيثيل خلات من الميثانول (78:22، ت / ت). هذه النتائج تثبت أن كلا من حجم لوحة واختيار نظام المذيب (أو سلسلة من ليالي المذيباتystems) يمكن أن تؤثر على عدد من المركبات على فصل اللوني. في هذه الحالة بالذات، أكد شطف وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) من العصابات من فصل TLC أخرى من نفس مقتطفات أن المركبات المتبقية في أو بالقرب من الأصل يتألف أساسا من المركبات الفينولية (الأحماض الفينولية أو الايسوفلافون) مترافق إلى الأنصاف القطبية مثل مشتقات الأحماض الأمينية، السكريات، أو حمض الماليك. في المقابل، لا الايسوفلافون مترافق إلى الأنصاف القطبية هاجر أبعد حتى لوحات TLC 10.
وتظهر نتائج الأحيائي من لوحة TLC هو مبين في الشكل 2A مع كلوستريديوم sticklandii، وهو فرط انتاج الأمونيا بكتيريا الكرش (HAB)، في الشكل 3. إضافة 1٪ (ث / ت) نتج محلول مائي من نتروبلو الأحمر إلى لوحات أجار بعد الحضانة 24 ساعة في اللون الأحمر مشرق عندما كانت ملطخة الخلايا الحية. حضانة الفرقة 1 (biochanin A) وجزء من باالثانية 2 (formononetin) على البكتيريا المصنف أجار أسفرت عن منطقة محددة جيدا من تثبيط (الشكل 3A). ومع ذلك، الحضانة ما تبقى من الفرقة 2، جنبا إلى جنب مع فرق 3 و 4، ولم تمنع نمو البكتيريا (الشكل 3B). أظهرت هذه النتائج أن biochanin وكان المثبطة لC. وكان نمو sticklandii، ولكن لا formononetin.
الشكل 2. السيليكا طبقة رقيقة الكروماتوغرافي (TLC) فصل من مستخلص نفل pratense السيرة الذاتية. Kenland، وضعت في (أ) خلات الإيثيل-hexanes (9:1، ت / ت)، أو (B) في نفس المذيب تليها التنمية في الإيثيل خلات من الميثانول (78:22، ت / ت). المسافة هاجرت من قبل يشار المذيب بين الأصل (OR) وجبهة المذيب (SF) بالقرب منبين قوسين بين اثنين من تلك الحدود. في الشكل 2B، "الجبهة النجاسة" (IF، انتقل الموقع من الشوائب حتى لوحة من قبل prewashing في المذيبات القطبية) ينظر اليها على انها الفرقة الظلام بالقرب من أعلى اللوحة. حلت مقتطفات، أعدت 180-250 ملغ تجميد المجفف أوراق البرسيم الأحمر وينبع، في الميثانول، وتم تحميل 10٪ من استخراج (A) أو 32٪ (B) على لوحات السيليكا. تم formononetin المعايير تحميل (و، 7.1 نانومول)، biochanin A (با، 7.4 نانومول)، الجينيستين (ز، 9.8 نانومول)، وclovamide (CL، الشكل 2B فقط، 8.7 نانومول). وقد حلقت العصابات في حين ينظر تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية باليد في 254 نانومتر (الموجة القصيرة الأشعة فوق البنفسجية) و 365 نانومتر (الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة). تم استخدام كاميرا رقمية لتصوير لوحة تحت موجة قصيرة للأشعة فوق البنفسجية. خفض الأرقام إلى اليمين من البرسيم استخراج العصابات في الشكل 2A الرجوع إلى مناطق خارج لاختبارات بيولوجية. عوامل الاستبقاء (R و، المسافة traveleد من قبل الفرقة / المسافة التي يقطعها SF) هي بين قوسين بعد أرقام الفرقة في الشكل 2A.
الشكل 3. نتائج TLC اختبارات بيولوجية لوحة من (A) الفرقة 1 والجزء العلوي من حل غير كامل الفرقة 2 من لوحة TLC في الشكل 2A، و (ب) فرق 2-4 من نفس لوحة TLC. كانت قد وضعت العصابات وجهه لأسفل على HAB المتوسطة تلقيح مع كلوستريديوم sticklandii وحضنت هوائيا 24 ساعة عند 39 درجة مئوية. في نهاية هذه الفترة الحضانة، وأزيلت عصابات، وكانت ملطخة لوحات أجار مع محلول مائي من 1٪ (ث / ت) نتروبلو الأحمر وتصويرها تحت الضوء المرئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لفصل مقتطف إلى مجموعات فرعية من المركبات ومعايرة تلك المجموعات الفرعية عن طريق الاتصال bioautography. طريقة مماثلة تماما لتلك المستخدمة من قبل 15 Chomnawang آخرون للكشف عن نواتج النبات المثبطة للبكتيريا المسببة للمرض السيلان. نوع bioautography المستخدمة للكشف عن المركبات النباتية المضادة للجراثيم يعتمد على عوامل كثيرة، بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة الاختبار، وإعداد المختبر، وتفضيلات الشخص (الأشخاص) أداء الأحيائي. الاتصال bioautography، والطريقة المستخدمة في هذه الدراسة، قد تعرض لانتقادات لاعتمادا على قدرة مركب لنشر في وسائل الإعلام تلقيح 12. مناطق تثبيط على المركبات بتركيزات منخفضة، أو مع القدرة على القليل لنشر في وسائل الإعلام، قد لا تكون قابلة للكشف في حالة حدوث نمو في أجار تحت ديالة. أيضا، منطقة تثبيط التي أنشأتها الفرقة واحد قد انتشر خارج الأولي الفرقةالحدود، وبالتالي ربما اخفاء مناطق المثبطة التي أنشأتها المركبات المجاورة 14. ومع ذلك، bioautography الاتصال هو وسيلة سهلة الاستخدام، والقدرة على كومة لوحات بيتري يقلل من مقدار المساحة المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك، وضع العصابات TLC على أجار يزيل خطر الفرقة ونشر الانحلال التي يمكن أن تحدث عندما يتم مضافين لوحة TLC مع أجار تلقيح أو رش مع اختبار الكائنات الحية الدقيقة.
الحصول على معلومات من أي من الأنواع المذكورة أعلاه من bioautography يعتمد على الظروف الكروماتوغرافي، والتركيز اختبار الكائنات الحية الدقيقة، والظروف والثقافة / الحضانة. القرار الكروماتوغرافي من العصابات المضادة للميكروبات ليست لا غنى عنه، ولكن قد تكون حساسية أكبر للفرقة حلها جيدا 6. يمكن فصل التنمية عن طريق العصابات على لوحات أطول أو في أنظمة المذيبات متعددة في بعد واحد (الشكل 2B)، أو في بعدين من خلال تحويل لوحة TLC 90 درجة قبل التنميةفي المذيبات 16،19 ثانية. قد تكون مركبات قطبية الصعب فصل على السيليكا دون استخدام مخاليط المذيبات التي تحتوي على الأحماض أو القواعد. قد تكون هذه فتاكة بالنسبة لاختبار الكائنات الحية الدقيقة 12، على الرغم من أن استخدام كميات صغيرة من الأحماض تم الإبلاغ 14،15. ويمكن أن تشمل نظم المذيبات البديلة الماء أو الميثانول كمكونات 20،21. ويمكن أيضا أن تحل مركبات القطبية على أنواع مختلفة من لوحات TLC، مثل لوحات مغطاة C 18 مكثف أو الجريزوفولفين السيلولوز. ومع ذلك، فإن النمو 12 أو حساسية للوكيل التصور 14 قد يكون له أثر سلبي على بعض هذه الممتزات.
العديد من مجموعات مختلفة من الكائنات الحية الدقيقة واختبار وسائل الاعلام يمكن استخدامها لbioautography. ومع ذلك، يجب النظر في عدة عوامل عند اختيار الكائنات الحية الدقيقة وسائل الإعلام. وينبغي اختبار وسائل الإعلام لتحديد أنه لا توجد المكونات التي تقلل من تيتrazolium الملح وتسبب تغير لونها غير بيولوجية. وينبغي أيضا أن يكون أجار ما يكفي من الضوء في اللون لتوفير التباين بين الخلايا الملون والمناطق غير ملوثين من كبت. يمكن إزالة الكائنات الحية الدقيقة والتي يمكن أن تنمو فقط على سطح أجار جنبا إلى جنب مع الفرقة TLC أو غسله خلال تلطيخ. بالإضافة إلى ذلك، فإن اختيار الكائنات الحية الدقيقة / متوسطة الجمع الذي يقلل إنتاج الغاز تقليل فقاعات في أجار. الكرش HAB تنمو في، خالية من الكربوهيدرات متوسطة مخزنة كربونات مع خليط من الأحماض الأمينية أو الببتيد والركيزة النمو. لوحات أجار هي الذهب الضوء وشفافة. عندما C. ويزرع sticklandii في المتوسط، فإن معظم المنتجات هي للذوبان (الأحماض الدهنية المتطايرة، الأمونيا). ويتم إنتاج الغاز ضئيل جدا، مما يؤدي إلى لوحة آغار ناعمة مع عدم وجود فقاعات.
هذا الأحيائي وقد اثنين من التطبيقات المحتملة. حجم منطقة تثبيط يمكن أن تستخدم بمثابة تقدير تقريبي لكمية مجمع المثبطة، منذ نصف قطر منطقة المثبطة يتناسب مع لوغاريتم كمية من مركب يسبب تثبيط 17،22. ربما كان الاستخدام الأكثر شيوعا من اختبارات بيولوجية لوحة TLC هو لتضييق نطاق المركبات المضادة للميكروبات ممكن في مستخلصات نباتية. بعد أن يتم تحديد مناطق المثبطة من قبل الأحيائي، والمناطق المقابلة على لوحة TLC مكررة يمكن مزال مع المذيبات، مثل الميثانول أو خلات الإيثيل، وتحليلها من قبل HPLC مع الكشف الطيفي فوق البنفسجية لتبدأ تميز المركبات النشطة بيولوجيا 10،14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المادة هو فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا تعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأميركية. الكتاب تعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر المرحوم الدكتور نورم تايلور، النبات وقسم علوم التربة في جامعة كنتاكي، على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام عينات من له المؤامرات البرسيم الأحمر لهذه الدراسة. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وزارة الزراعة في الولايات المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
