Respostas Bexiga Distensão Evocado Visceromotor como um modelo para Bexiga dor em camundongos

Resumo

Aproximadamente 3-8.000.000 de pessoas nos Estados Unidos sofrem de síndrome intersticial dor cistite / vesical (IC / BPS), uma condição debilitante caracterizada em parte pela dor pélvica. A fim de estudar as contribuições do sistema nervoso para a condição, um modelo fisiológico de dor na bexiga urinária é usado em ratinhos e ratos.

Resumo

Aproximadamente 3-8.000.000 de pessoas nos Estados Unidos sofrem de síndrome de cistite / dor na bexiga intersticial (IC / BPS), uma condição debilitante caracterizada pelo aumento da urgência e frequência urinária, bem como noctúria e dor pélvica em geral, especialmente sobre o enchimento da bexiga ou micção. Apesar de anos de investigação, a causa da IC / BPS permanece indefinida e estratégias de tratamento são incapazes de fornecer alívio completo aos pacientes. A fim de estudar as contribuições do sistema nervoso para a condição, muitos modelos animais têm sido desenvolvidos para imitar a dor e sintomas associados com CI / EPB. Um modelo murino tal é a distensão da bexiga urinária (UBD). Neste modelo, o ar comprimido de uma pressão específica é entregue à bexiga de um animal ligeiramente anestesiado durante um período de tempo definido. Durante todo o processo, os fios nos músculos abdominais oblíquos superior registrar a atividade elétrica do músculo. Esta actividade é conhecido como a resposta visceromotor (VMR) e isa medida confiável e reprodutível de nocicepção. Aqui, descrevemos os passos necessários para executar esta técnica em camundongos, incluindo manipulações cirúrgicas, gravação fisiológica e análise de dados. Com o uso deste modelo, a coordenação entre os neurônios sensoriais primários, secundários aferentes na medula espinhal, e áreas do sistema nervoso central mais elevados envolvidos na dor da bexiga podem ser desvendados. Este conhecimento básico da ciência pode ser então traduzido clinicamente para tratar pacientes que sofrem de CI / EPB.

Introdução

A dor crônica é oficialmente definida como a dor que persiste por cerca de três meses, ou por mais tempo do que o tempo normal de cicatrização do tecido ^1. Este tipo de dor é uma das principais razões que as pessoas são levados a procurar atendimento médico ² e pode custar até 635000000000 dólares dólares anualmente ^3. Estratégias de enfrentamento da dor crônica atual são consideradas arcaicas; depois de décadas de avanços médicos, AINEs (medicamentos anti-inflamatórios não-esteróides) e os opióides continuam sendo os tratamentos primários prescritos por médicos. No entanto, estes tratamentos alvo todos os diferentes tipos de dor, da mesma forma, proporcionando efeitos analgésicos em todo o corpo ao invés de focar especificamente sobre a causa desse incidente exata da dor. A fim de melhor ajudar aqueles que sofrem de dor crônica, atenção investigação deve ser deslocado para a etiologia e possíveis tratamentos específicos de dor associada com as causas mais comuns de dor crônica. O objetivo deste manuscript é descrever um modelo usado para entender melhor uma condição conhecida como Síndrome de cistite intersticial / dolorosa bexiga (IC / BPS).

IC / BPS é uma condição debilitante que afeta milhões de pessoas, principalmente mulheres com mais de 40 anos de idade ^4. As causas exatas do IC / BPS não são conhecidos, no entanto prevalência tem sido associada à genética ^5, dietas específicas e altos níveis de estresse ⁶ . Os sintomas de IC / BPS incluem, mas não estão limitados a: Aumento da urgência para urinar, aumento da frequência urinária, dor, piercings, dor ou ardor durante o enchimento da bexiga e micção, noctúria e ^7. Os doentes com estas condições têm níveis mais elevados de estresse e são mais ansiosos ^8. Este aumento de resultados de tensão em aumento da dor, o que aumenta os níveis de estresse originais. Estudos têm demonstrado que os níveis de depressão e ansiedade diminuir seguintes tratamentos que aliviam a dor urinário, assim efetivamente rompendo esse ciclo de feedback positivo ^{9. Um dos desafios na descoberta de novos tratamentos para o IC / BPS tem sido a escassez de uma compreensão científica básica de dor na bexiga.}

A fim de estudar as contribuições do sistema nervoso para a condição, muitos modelos animais têm sido desenvolvidos para imitar a dor e sintomas associados com CI / EPB. Tradicionalmente, a cistite foi recriado em animais com a introdução de vários produtos químicos, tais como o óleo de mostarda, acetona, lipopolissacárido, o ácido clorídrico, e ciclofosfamida na bexiga. No entanto, não agentes estrangeiros estão presentes na urina estéril de pacientes IC / BPS, questionando, assim, a validade desses modelos. Outro modelo murino de dor urológica é a distensão da bexiga urinária (UBD) ^10. Neste modelo, o ar comprimido de uma pressão específica é entregue à bexiga de um animal acordado ou levemente anestesiados durante um período de tempo definido. Durante todo o processo, fios no oblíquo músculos abdominais registro atividade elétrica superiordade do músculo (com um electromiograma (EMG)). Esta actividade é conhecido como a resposta visceromotor (VMR) e é medida de confiança, reprodutíveis de nocicepção ^10. Similar oco distensão do órgão (por exemplo, bexiga, reto) em voluntários humanos saudáveis ​​produz sentimentos de desconforto e aumentos significativos na dor relatada ^11,12, características que são frequentemente utilizados para diagnosticar IC / BPS. Assim, em conjunto com os métodos eléctricos, farmacológicas, e optogenetic de estimulação ou de inibição, UBD é um modelo útil para a compreensão e válido ambos os componentes do sistema nervoso periférico e central de nocicepção e dor na bexiga.

Aqui, descrevemos o procedimento para UBD como é usado atualmente em nosso laboratório dentro de membros do sexo feminino da linhagem do rato comum, C57Bl/6J. Devido a dificuldades no processo de cateterismo dos homens, este procedimento é realizado principalmente em ratos fêmeas. Este protocolo foi adaptado a partir do desenvolvido por Ness et al. ¹⁰ e publicado anteriormente no nosso laboratório ^13. O protocolo seguinte descreve quatro componentes principais deste modelo em animais anestesiados: (1) do cateter vesical e gravação cirurgia eléctrodo (2) indução de anestesia parcial (3) de distensão da bexiga e gravação VMR, e (4) de análise de dados de matérias vestígios VMR / EMG . Diferenças sutis no procedimento UBD-VMR, devido à escolha do organismo, a profundidade da anestesia e indução, ea temperatura do corpo são discutidas abaixo.

Protocolo

O protocolo a seguir foi aprovado pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade de Duquesne e é consistente com as diretrizes do National Institutes of Health.

1. Implantação cirúrgica de eletrodos de fio e Bexiga Cateter Usando técnicas estéreis (tempo total de 5-10 min)

1. Os seguintes itens devem ser preparadas antes da cirurgia inicial:
   1. Ativamente monitorar e ajustar a temperatura do corpo a 37,5 ± 0,5 ° C usando o sistema de monitoramento de temperatura, com uma almofada de aquecimento funciona com bateria e animal corpo da sonda de temperatura (Lista de Materiais) Conecte sistema automático para uma lâmpada de calor de baixa potência para o controle adicional da temperatura corporal.
   2. Equipamento necessário para a anestesia isoflurano inclui ar comprimido (por exemplo, 100% O _2), vaporizador isoflurano, isoflurano, câmara de indução isoflurano (para knockdown inicial), cone de nariz, e sistema de escape.
   3. Montar ªe instrumentos adequados cirúrgicas, IV cateter, e eletrodos (Lista de Materiais)
2. Induzir o estado anestésico na câmara de indução em 2-3% de isoflurano. Remover rato da câmara quando reflexo de endireitamento é perdido (0-1 min).
3. Coloque o mouse no nariz cone com 2-2,5% de isoflurano. Aperte dedo para verificar se há anestesia completos. Não deve haver nenhuma resposta do animal. Comece timer.
4. Coloque uma gota de pomada oftálmica em cada olho do rato.
5. Vire mouse sobre tão lado dorsal está voltada para baixo.
6. Insira cateter através da uretra e na bexiga.
7. Mergulhar cateter no lubrificante cirúrgico para lubrificar cateter.
   1. Gentilmente segurar abertura da uretra com uma pinça de pontas perpendiculares ao corpo do animal. Segurando cateter com o conjunto de 2 ^ª de fórceps, insira suavemente final cateter na uretra em um ângulo perpendicular ao corpo do animal.
   2. Quando cateter tenha ido para uretra ~ 1-2 mm, ajustar suavemente cateter de modo que agora é paralela ao corpocom o objetivo em direção à cabeça. Esse movimento é necessário para evitar o osso púbico.
   3. Empurre cuidadosamente cateter para o corpo do mouse. O cateter deve deslizar para dentro da cavidade do corpo de forma suave e sem resistência. Não force cateter. Se cateter não entra sem problemas, voltar à posição perpendicular cateter e começar de novo.
   4. Com cateter totalmente inserido na bexiga, empurre para baixo sobre o abdômen do rato para expulsar o conteúdo da bexiga. Remova toda a urina do cateter, empurrando um pequeno pedaço de toalha de papel na abertura do cateter. Quando toalha de papel embebido com urina, substituir. Remover urina continuamente ao longo do protocolo restantes, incluindo durante as experiências distensão da bexiga (ver Protocolo 3 abaixo).
8. Insira dois fios de prata nos músculos abdominais à esquerda e um fio de prata no peito (como um terreno.)
   1. Use álcool ou iodo para desinfectar área lateral à direita do cateter (lado esquerdo do animal de corpo.)
   2. Expor músculo abdominal esquerdo.
      1. Segure a pele perto do músculo abdominal esquerda, com uma pinça. Faça uma pequena incisão de 1-2 cm com uma tesoura cirúrgica de média.
      2. Introduza a ponta de tesouras em incisão e expandir suavemente incisão de 2 cm.
      3. Use uma pinça para mover fascia sobrejacente para expor o músculo abdominal oblíquo superior. Tenha cuidado para não cortar / rasgar qualquer um dos principais vasos sanguíneos que estão localizadas nesta região.
   3. Dobre três fios de prata pela metade. Use afiada agulha 21 G para tomar um pequeno pedaço de músculo. Em seguida, empurre a agulha através do músculo. Ao inserir no músculo ter cuidado para não perfurar quaisquer órgãos internos ou induzir danos desnecessários ao músculo.
   4. Cole uma extremidade livre de um fio de prata na abertura da agulha G 21. Com cuidado, puxe a agulha para trás através do músculo para tirar o fio de prata através da picada do músculo. Quando a agulha está livre de músculo, puxe fio de prata através do músculo até que o loop no fio fique nivelada com omordida muscular.
   5. Repita os passos 1.7.3-1.7.4 para segundo fio muscular. Este fio deve ser colocado ~ 0,5 centímetros a partir do primeiro arame de dilatação. É importante que os dois fios não toque após a inserção.
   6. Inserir o terceiro fio de prata (solo) no peito inferior ao coração.
      1. Use afiada agulha 21 G para tomar um pequeno pedaço de pele (não é necessário para fazer uma incisão ou raspar a pele) e empurre a agulha através da pele.
      2. Insira fio de prata, como descrito acima e puxe pela pele.
9. Colocar uma pequena quantidade de 37,5 ° C, o óleo mineral estéril sobre os músculos expostos a mantê-los húmidos e puxa a pele sobre o músculo, tanto quanto possível, exposta.
10. Injetar 0,5 ml de solução salina por via subcutânea, para ajudar a manter os níveis de fluidos durante as etapas subseqüentes.
11. Rolo delicadamente animais para o lado, de modo que a temperatura do corpo pode ser facilmente mantida.

2. Parcial Anestesia Step-down Procedimento (total tempo de ~ 75 min)

O seguinte protocolo de anestesia foi aprovado pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade de Duquesne e é consistente com as diretrizes do National Institutes of Health.

1. Imediatamente após a Secção I (acima) é completo, inferior a 1,5% de isoflurano. Segure a este nível para 15 min.
2. Baixa isoflurano tal que o animal é anestesiado parcialmente.
   1. Menor isoflurano por 0,125% a cada 15 minutos até exposições de animais uma resposta flexão aos pés pitada mas não vocalizar ou não se mover.
   2. Tipicamente, um nível de 0,8-1,0% de isoflurano é óptimo, no entanto, os níveis podem variar devido a diferenças nas configurações de anestesia. Vocalização e / ou a deambulação são eventos extremamente raros, quando a anestesia é no nível adequado.

. 3 Electromiograma (EMG) Gravação Durante bexiga Distensão com Pressões Graded (15-75 mmHg) (tempo total - variável, dependendo da experiência)

1. Setup os seguintes itens para gravação EMG e distensão da bexiga:
   1. Instalação de um amplificador, um digitalizador, e software de gravação. Nesta configuração, o digitador tem uma entrada para o amplificador e duas entradas para o regulador de pressão (pressão e insumos marcador estímulo, veja abaixo a seção 3.1.2). Configuração de hardware e software Exact é personalizável (veja a lista de materiais para obter instruções específicas).
   2. Instalação de um sistema para entregar rajadas específicas de pressão de ar para animal. Este sistema é referido como o "regulador de pressão temporizada" no protocolo seguinte. Ela permite a entrega de pressão automatizado incluindo a digitalização de pressão de ar, controle de comprimento julgamento, automação intervalo inter-julgamento, o controle de número de julgamento, e estímulo sinal digital início (ver ¹⁴ Anderson et al. Para esquemática de um regulador de pressão cronometrado).
2. Conecte todos os cabos de rato (2 fios abdominais + 1 fio terra) para o amplificador eodigitalizador e começar a gravação do sinal EMG em software digitalizador. Observe que o tempo "Write" é selecionado no software digitalizador.
3. Retirar uma toalha de papel a partir do cateter na bexiga. Conecte cateter para tubo de ar (a partir de regulador de pressão cronometrado.)
4. Entregar um único ensaio de 20 seg a 60 mmHg da pressão distensão.
   1. Ajuste o regulador de fluxo para 60 mmHg (pressão de seleção, usando um esfigmomanômetro analógico.)
   2. Ajustar o regulador de pressão temporizada para proporcionar um intervalo prepressure 20 seg (isto irá ser o sinal de estímulo 2V gravada em software digitalizador) seguido por um impulso de 20 segundos distensão pressão.
   3. Inicie o julgamento (intervalo prepressure + julgamento distensão pressão). Quando o julgamento real pressão começa, verifique a pressão usando os 3 esfigmomanômetros conectados ao sistema.
   4. Durante o ensaio de distensão pressão, um forte sinal de EMG (> 0,5 V) devem ser observados durante e depois, eventualmente, a 20 seg distensão. O animal pode apresentar abdomimovimento nal mas o animal não deve vocalizar ou não se mover. Apesar de rara, se forem observados movimentos anormais ou vocalizações, aumentar o nível de isoflurano.
5. Se o 1 ^º 60 distensão mmHg produz um sinal de EMG for o caso, repita o passo 3.4 mais duas vezes, com um intervalo entre tentativas de 1-2 min.
6. Ao receber sinais fortes a partir dos três ensaios 60 mmHg, execute distensões experimentais.
   1. Muitos estudos utilizam distensões graduados a partir de baixa pressão (10-15 mmHg) e trabalhando-se a pressões nocivos (75-80 mmHg) em incrementos de 10-15 mmHg. Veja resultados representativos abaixo, por exemplo traços em diferentes pressões.
   2. Ensaios típicos incluem um intervalo de 20 segundos prepressure, um ensaio de pressão distensão 20 seg, e um intervalo de 1-2 min entre tentativas.
   3. Realize três distensões em cada pressão e, em seguida, a média entre as três ensaios (para obter uma única resposta para cada visceromotor pressão). Num método alternativo, perform cinco distensões em cada pressão, descartar os testes de alta e baixa, e, em seguida, calcular a média dos restantes três respostas.
7. Distensões Uma vez experimentais estão completos, parar a gravação, salvar o arquivo experimento, e sacrificar animais utilizando métodos aprovados.

4. Análise de Traços Raw EMG

1. Análise das respostas visceromotor (ou seja, gravações EMG) são facilmente feito usando o software digitalizador on-board ou através de um programa de terceiros (Lista de Materiais) As instruções a seguir são instruções gerais que poderiam ser usados ​​para analisar esses dados usando vários programas ou utilizando análise manual .
2. Para exportar EMG, pressão e dados de sinal de estímulo de software digitalizador faça o seguinte:
   1. Abra o arquivo experimental.
   2. Clique em "Arquivo" "Exportar como".
   3. Mude o tipo de arquivo para "texto planilha (. Txt)", nomeie o arquivo e clique em "Salvar".
   4. Na pojanela p-up, mude a taxa de amostragem de saída para "1000", alterar a hora de início da coleta de dados começou momento e mudar o tempo do fim para "MaxTime ()." Selecione a marcação "saída mudança de tempo caixa para que a primeira linha é um 0.0 sec "e clique em" OK ".
   5. Os dados agora serão exportados como um arquivo de texto que pode ser aberto em uma variedade de programas. O arquivo deve conter quatro colunas (temporizador, VMR (EMG), de pressão, de estímulo).
3. Para cada animal experimental testado, execute as seguintes operações matemáticas.
   1. Rectificar sinal EMG para o conjunto por meio do cálculo do valor absoluto de cada ponto de tempo de dados inteiros.
   2. Determinar a resposta EMG média durante a seção do experimento de fundo.
   3. Subtrair esta média de fundo resposta EMG de todos os pontos de dados corrigida no experimento para obter o fundo conjunto de dados corrigidos.
   4. Para determinar a área sob a curva (AUC) para cada 20 seg préintervalo de pressão no fundo conjunto de dados corrigidos.
   5. Determine a AUC para cada ensaio distensão pressão 20 seg no fundo conjunto de dados corrigidos.
   6. Divida cada AUC julgamento distensão pressão (obtido no passo 4.3.5) pelo menor intervalo prepressure AUC de todo o experimento (obtido no passo 4.3.4.). Essa é a AUC corrigido normalizada e fundo para cada ensaio completo distensão pressão.
4. Para cada animal experimental, média múltiplos ensaios normalizados de uma única pressão para obter o VMR normalizada em Volts * sec (Vsec).
5. Execute as estatísticas apropriadas sobre os dados de acordo com o delineamento experimental.

Resultados

Uma ilustração da configuração global UBD-VMR pode ser visto na figura 1A. Etapas de pressão crescentes induzir um aumento na VMR bruto (isto é, EMG) (Figura 1B.) A matéria-VMR, pressão, e o sinal do marcador de estímulo que devem ser observados durante a gravação usando software digitalizador pode ser visto na Figura 2. Do canal de topo em vista A Figura 2 é o traçado EMG (em V). O sinal do traço EMG fundo deve ser constante e de baixa amplitu...

Discussão

Em humanos, a síndrome de dor cistite / bexiga intersticial (IC / BPS) representa um problema clínico importante, pois os pacientes têm dor debilitante que é muitas vezes insensível à dor tratamento regular ^{de 15.} Um dos grandes desafios na compreensão e, finalmente, o tratamento da dor crônica da bexiga é compreender os processos neurais normais que estão envolvidos na resposta à distensão da bexiga nocivo. De modo a ultrapassar este desafio, um modelo animal de dor de bexiga é necessário. Este modelo deve s...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Manta de aquecimento infravermelho e sistema de monitoramento	Kent Scientific	Right-Temp System	Este sistema está configurado para monitorar duas temperaturas separadas.  Isso deve incluir o animal e o cobertor de aquecimento.  Além disso, o sistema pode ajustar automaticamente a temperatura para manter uma temperatura definida. No entanto, esta função automática produz interferência elétrica durante a gravação EMG e deve ser desligada.  Kent pode fornecer uma bateria para a almofada de aquecimento para uso durante a parte de gravação riEMG do experimento.
Vaporizador de isoflurano	Draeger	Vapor 19.1	Qualquer vaporizador de isoflurano funcionará, mas é útil ter um que tenha vários entalhes entre 0-2% de isoflurano.
Isoflurano	múltiplas fontes	n/a
100% Oxigênio tanque de ar	múltiplas fontes	n/a	Para ventilação de animais
Grau de respiração	de ar múltiplas fontes	n/a	Para distensão da bexiga
24 G 0.56 in IV cateter	BD Biosciences	381411	Para cateterismo da bexiga
Surgilube (estéril)	Savage Laboratories	0281-0205-02	Qualquer lubrificante de grau cirúrgico funcionaria bem.
Óleo mineral (estéril)	múltiplas fontes	n/a
Salino (estéril)	múltiplas fontes	n/a
AG8W Fio de Prata, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, Sem Isolamento	Warner Instruments	W4 64-1318	Qualquer fio prateado com essas especificações funcionará.  O fio não precisa ser "clorado".
Pomada oftálmica	múltiplas fontes	n/a
Tesoura cirúrgica pequena	múltiplas fontes	n/a
Fórceps afiada	múltiplas fontes	n/a
21 G Agulha	múltiplas fontes	n/a
Amplificador de grama P511 com cabo de entrada de 3 derivações	Grass Instruments	P511 ( F-P5IC3/REV1)	Este é o "amplificador" usado no protocolo.  Amplificador com as seguintes configurações: Calibrador = 1 mV; Baixa frequência = 300 Hz; Amplificação = 20; Alta frequência = 10 kHz; Filtro de linha = in.
Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (ou equivalente)	Cambridge Electronic Design	1401 Plus	Este é o "digitalizador" usado no protocolo.  Outros sistemas digitalizadores da WINDAQ ou de outras empresas funcionariam bem; Precisa de entradas para sinal de pressão, EMG e sinal de estímulo.
Software CED Spike2	Cambridge Electronic Design	Spike 2	Este é o "software digitalizador" usado no protocolo.  Deve ser do mesmo fabricante que o digitalizador.  O programa deve ser configurado com 3 canais para pressão (escala de 0-100 mmHg), sinal EMG (normalmente faixa de -5 a +5 V) e faixa de marcador de estímulo (0-2 V).
Fluxograma do tanque de ar para o cateter da bexiga	n/a	n/a	Sequência de conexões do tanque de ar pressurizado para a bexiga do animal:  Tanque de ar para tubulação de 1/4 in para medidor de vazão Gilmont para conector y.  Ramo 1 do conector y para o esfigmomanômetro.  Ramificação 2 para uma única entrada na válvula de 4 vias para saída de válvula de 4 vias para o regulador de pressão temporizado para tubulação 3/32 do regulador de pressão temporizado para o conector 2nd y (ramo 1 para esfigmomanômetro) com tubulação de ramificação 2 para 3/32  para um conector do 3º Y.  O ramo 1 do conector y para um 3º esfigmomanômetro e o ramo 2 para o cateter vesical animal.
Medidor de Vazão Gilmont	Gilmont	GF8321-1401	Várias marcas de medidores de vazão funcionarão.  Para o ar de distensão da bexiga, o medidor de vazão deve ser capaz de lidar com altas pressões (como este medidor Gilmont).  Para respirar ar, a taxa de fluxo deve ser ajustável até 100 ml/min (a taxa típica do mouse é de 500-1.000 ml/min).
Válvula de 4 vias Elite			Este é um equipamento específico.  A válvula de gangue Elite é projetada para tanques de peixes em baixas pressões de ar.  Na configuração de distensão da bexiga, esta válvula atua como uma válvula de segurança caso a pressão aumente.  Uma pressão muito alta durante a ativação inicial do tanque arruinará o transdutor de pressão no regulador de pressão temporizado e/ou nos esfignômetros. Além disso, ao fornecer uma pequena quantidade de vazamento no sistema, esta válvula facilita o ajuste da pressão entre 10-80 mmHg.
Tubulação de 1/4 pol	de várias fontes	n/a
Tubulação de 3/32 polegadas	de múltiplas fontes	n/a
Conectores "Y" (1/4 e 3/32 pol)	de múltiplas fontes	n/a
Esfigmomanômetro	CVS		Qualquer esfigmomanômetro analógico de uma farmácia funcionará para esta aplicação.
Regulador de Pressão Cronometrado	personalizado		Esta é uma máquina personalizada (oficina mecânica da Universidade de Washington em St. Louis) que permite a entrega automatizada de pressão, incluindo digitalização da pressão do ar, controle da duração do teste, automação do intervalo entre testes, controle do número de testes e sinal digital de início de estímulo.  No entanto, os componentes básicos do sistema (pressão ligada e desligada por um determinado período de teste) podem ser controlados com um simples interruptor liga/desliga em linha.   Esse controle analógico de um estudo exigiria parâmetros de análise adicionais (consulte o Protocolo 4).  Além disso, seria necessário atribuir manualmente a pressão com base no esfigmomanômetro analógico durante a análise dos dados.
IGOR Pro	Wavemetrics	n/a	Para análise do sinal EMG. Muitos tipos diferentes de software podem ser usados para análise de dados nesses experimentos.