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Artigo de método

Papel colorimétrico à base de Detecção de

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DOI:

10.3791/51414

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9 de junho de 2014

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1Department of Animal Science, University of Wyoming, 2Department of Chemistry, Colorado State University, 3Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 4Department of Animal Sciences, Colorado State University, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Food Science and Human Nutrition, Citrus Research and Education Center, University of Florida, 7Department of Food Science and Agricultural Chemistry, McGill University

Neste artigo

Resumo

Um protocolo envolvendo concentração integrada, enriquecimento e detecção colorimétrica de ponto final de patógenos transmitidos por alimentos em grandes volumes de água agrícola é apresentado aqui. A água é filtrada através de Swabs de Moore modificados (MMS), enriquecidos com meios seletivos ou não seletivos, e a detecção é realizada usando dispositivos analíticos baseados em papel (μPAD) embutidos com substratos colorimétricos indicativos bacterianos.

Resumo

Este protocolo descreve a detecção colorimétrica rápida de Escherichia coli, Salmonella spp., E Listeria monocytogenes, a partir de grandes volumes (10 L) de águas agrícolas. Aqui, a água é filtrada através de estéril modificação Moore Cotonetes (MMS), que consistem de um filtro de gaze simples fechado em um cartucho de plástico, para concentrar as bactérias. Após a filtração, enriquecimentos não selectivos ou selectivos para as bactérias alvo são realizadas no MMS. Para a detecção colorimétrica da bactéria alvo, os enriquecimentos são então ensaiadas usando os dispositivos de análise à base de papel (μPADs) incorporados com substratos bactérias indicativos. Cada substrato reage com enzimas bacterianas alvo indicativo, gerando produtos coloridos que podem ser detectados visualmente (detecção qualitativa) na μPAD. Alternativamente, as imagens digitais das μPADs reagiram podem ser gerados com a digitalização comum ou dispositivos fotográficos e analisados ​​usando o software ImageJ, almugido para interpretação mais objetiva e padronizada de resultados. Embora os procedimentos de rastreio bioquímicos são concebidos para identificar os agentes patogénicos bacterianos acima mencionados, em alguns casos, enzimas produzidas por bactérias do fundo ou a degradação dos substratos colorimétricos podem produzir um falso positivo. Portanto, é necessária a confirmação através de um diagnóstico mais discriminatória. No entanto, esta plataforma de concentração e detecção de bactérias é barato, sensível (0,1 CFU limite de detecção / ml), de fácil execução e rápida (concentração, enriquecimento e detecção são realizados dentro de aproximadamente 24 horas), justificando o seu uso como um método de triagem inicial para a qualidade microbiológica da água na agricultura.

Introdução

É importante que os agentes de doenças de origem alimentar são detectados rapidamente e de preferência em ambientes baseados em campo, a fim de reduzir a carga de doenças transmitidas por alimentos. As estratégias comuns para detectar bactérias patogênicas transmitidas por alimentos incluem perfis bioquímicos, cultura seletivo e diferencial, isolamento e detecção imunológica e detecção molecular. No entanto, estes métodos são prejudicados pela contaminação esporádica, pequenas amostras testadas, as baixas concentrações muitas vezes das bactérias patogênicas transmitidas por alimentos, requerem longos tempos de processamento e / ou não são aplicáveis ​​para as definições de campo. Além disso, os compostos em diversas matrizes alimentares são inibitórios para aplicações de diagnóstico e detecção. A fim de melhorar a probabilidade de detecção microbiana, os Estados Unidos Food and Drug Administration tem sugerido que o teste da água na agricultura (como água de lavagem e água de irrigação), que quer entrar em contato com uma grande superfície de produtos frescos ou serve como um veículo para pcontaminação roduce é uma alternativa viável para o teste direto de alimentos 1. Mesmo assim, a freqüência baixa patógeno-peso natural, juntamente com o efeito de diluição da amostra de água agrícola representante torna os métodos de preparação de amostras para a concentração do patógeno essencial. Tal método poderia exigir a amostragem de grandes volumes de água (≥ 10 L), adequada patógeno-concentração, e compatibilidade com estratégias de detecção a jusante.

Cotonetes Moore Modificados (MMS) são dispositivos de baixo custo, simples e robustos utilizados para concentrar bactérias de grandes volumes (≥ 10 L) de água 2-4. O MMS é composta de uma cassete de plástico cheio com gaze, que serve como um filtro grosseiro para grandes volumes de água bombeados através da caixa, utilizando uma bomba peristáltica. O MMS é um método não-discriminatório de concentração bacteriana (≥ concentração 10 vezes) que captura material particulado orgânico e inorgânico, incluindo microrganismos em li processadoamostras quid. É provável que a excelente eficiência de concentração de microrganismos alvo por o MMS pode ser explicado pelo fato de que os microorganismos devem ser ligados à fracção-argilo ou micro-agregados orgânicos dos sólidos em suspensão 3. O design robusto do MMS permite superar a maioria dos defeitos associados a outros métodos de filtragem para a captura e concentração de bactérias da água, como o entupimento dos filtros, a incapacidade de processar grandes volumes, as amostras de filtro com alta turbidez, e custos elevados. Por estas razões, o FDA está recomendando que da MMS ser incorporados procedimentos oficiais para procedimentos de coleta de amostras ambientais e relacionadas com a produzir 5.

Aqui, é descrito um método para a concentração, o enriquecimento, e a detecção de Escherichia coli, Salmonella spp., E Listeria monocytogenes de águas agrícolas. A MMS é usado para concentração de bactériaeria, e também serve como um recipiente para o enriquecimento selectivo de bactérias ou não selectiva. Detecção bacteriana é conseguido bioquimicamente usando dispositivos analíticos baseados em papel (μPADs) 6. μPADs pode ser fabricado como redes fluídicas ou testes local usando uma variedade de métodos, incluindo fotolitografia, impressão a jato de tinta, estampagem, e cera de impressão 7-11. Exemplos de modelos de fluidos podem ser os padrões de canal dendríticas em que a amostra é depositada no centro e, subsequentemente, os fluxos de reservatórios distais ou padrões de canal único, no qual a amostra ou o substrato são puxados a partir dos reservatórios exteriores do canal, por acção capilar até ao centro 12. Para este protocolo, optou-se por empregar para 7 mm de diâmetro com papel de cera matrizes ponto encaixados com substratos cromogênicos que podem ser processados ​​por enzimas indicativas dos microrganismos testados aqui: Clorofenol vermelho β-D-galactopyranoside (CPRG) e 5 - bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucuronido (X-Gluc)para detecção de β-galactosidase e β-glucuronidase produzidas por E. coli; Caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo (magenta caprilato) para a detecção de C8-esterase produzidas por Salmonella spp.; e-5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato de mio-inositol (X-InP) para a detecção específica de fosfatidilinositol-fosfolipase C (PLC-PI) produzida por L. monocytogenes 6. Assim, a presença de uma bactéria em particular pode ser observado visualmente, sem a necessidade de equipamento complexo ou a interpretação de dados. A especificidade e sensibilidade da detecção colorimétrica μPAD à base de enzimas destas bactérias alvo específicas tem sido explorada anteriormente 6. Além disso, a sensibilidade do método de detecção de concentração integrada para estas bactérias alvo foi avaliada por cravação de grandes volumes de água com níveis de microorganismos (dados não publicados e Bisha et al. 13) pré-determinados.

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Protocolo

1. Concentração de bactérias a partir de grandes volumes de água agrícolas que utilizam MMS

  1. Preparação MMS
    1. Corte uma seção retangular de 4-ply gaze medindo 40 x 12 cm.
    2. Dobre o pano ao longo de ambos os eixos para obter um retângulo de 20 x 6 cm.
    3. Enrole a gaze firmemente ao longo do seu eixo longitudinal de modo a formar uma haste cilíndrica de cerca de 6 cm de altura e 3 cm de diâmetro.
    4. Autoclave o cotonete gaze em papel alumínio, não autoclave cassete. Descontaminar a cassete por imersão durante 30 minutos em 10% de água sanitária, e desactivar o cloro residual por imersão a cassete durante 15 minutos em um pentahidrato de tiossulfato de sódio (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O) de solução (50 mg / L preparadas em água estéril).
    5. Insira o cotonete na cassete MMS.
      NOTA: Se a versão não-descartável da cassete MMS é usado, comece com uma folha de 4-ply de gaze menta 80 x 22 cm, dobre-o para 40 x 11 cm e enrole para formar um cilindro de aproximadamente 11 cm de altura e 6 cm de diâmetro.
    6. Monte o MMS.
    7. Anexar tubo de vinil de espigões em ambos os lados do MMS, garantindo a tubagem adere completamente aos espigões, e corrigir tubo na bomba peristáltica. Certifique-se de que a tubagem a montante da bomba peristáltica é de comprimento suficiente para amostragem.
  2. A concentração de bactérias
    1. Amostra de pelo menos 10 litros de água agrícola, executando a bomba peristáltica em alta velocidade.
    2. Após a amostragem for concluída, retirar a entrada da bomba peristáltica a partir da amostra de água e continuar a executar a bomba até que nenhuma água efluente é observado sair do MMS.
    3. Se um colector é usado para executar várias amostras ao mesmo tempo, recolher o efluente de cada MMS, e quando é 10 L é filtrada através de um único MMS fechar a válvula para que o MMS particulares e continuar a funcionar a bomba.
      1. Quando a amostragem is concluído, retire a entrada da bomba peristáltica da água na agricultura, abrir todas as válvulas do colector, e continuar a executar a bomba até que nenhuma água efluente é observado sair do MMS.
  3. Quando a concentração tenha sido concluída para todas as mensagens MMS, remova cuidadosamente o tubo de vinil a partir das torneiras MMS e tampar as torneiras em ambos os lados do MMS. MMS bem fechados pode ser armazenado por até 12 horas antes de adicionar mídia de enriquecimento.

2. MMS Enriquecimento e Preparação de Amostras

  1. Enriquecimento
    1. Soltar a tampa do MMS, e adicionar assepticamente 20 ml de caldo de enriquecimento estéril apropriado. Use um MMS para cada enriquecimento seletivo. Alternativamente, realizar um enriquecimento não selectivo para propagar as três bactérias alvo na mesma amostra.
      NOTA: Se a versão não-descartável da cassete MMS é usado, de forma asséptica remover filtro de pano da cassete e coloque em um saco estéril antes de anúncioding 225 ml da mídia enriquecimento adequado.
      1. Para o enriquecimento de E. coli, adicionar 20 ml de água de peptona tamponada (BPW) suplementado com 8 mg / L de cloridrato de vancomicina.
      2. Para o enriquecimento de Salmonella spp., Adicionar 20 ml de BPW suplementado com o suplemento de Salmonella (4 ml / l).
      3. Para o enriquecimento de L. monocytogenes, adicione 20 ml de VIDAS UP Listeria (LPT) caldo.
      4. Para enriquecimento não seletivo simultânea para todos os três microrganismos utilizando um único MMS, use caldo preenrichment universal (UPB).
    2. Feche a tampa do MMS para trás com força. Certifique-se de que as torneiras estão bem tampada, para evitar derrames e possível contaminação durante o enriquecimento.
    3. Incubar as MMS para até 18-24 horas numa incubadora com agitação a 200 rpm. Utilizar 42 ° C durante E. coli e Salmonella spp. enriquecimentos seletivos. Use 30 ° C para L. monocytogenes enriquecimento seletivo, e usar 37 & #176; C para o enriquecimento não-seletivo.
  2. Preparação de Amostras
    1. Quando incubação estiver concluída, remova as MMS da incubadora, destampar uma das torneiras, e gentilmente dispensar cerca de 0,5 ml em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Alternativamente, desapertar os MMS e pipeta fora 0,5 ml de enriquecimento durante a noite.
      NOTA: Se a versão não-descartável da cassete MMS é usado, pipetar 0,5 ml de enriquecimento do saco.
    2. Para a análise colorimétrica de E. coli de enriquecimento selectivo, ou para a análise dos enriquecimentos não selectivos, sonicar 0,5 ml de enriquecimento a 5 W, 22 kHz, durante 20 segundos usando um sonicador de sonda.

3. Preparação e incorporação de substratos colorimétricos em μPADs

  1. Prepare μPADs suficientes para cada amostra e alvo testado. Para detectar E. coli preparar CPRG e X-Glic μPADs, por Salmonella spp. detecção preparar μPADs MC, e por L. monocytdetecção ogenes preparar μPADs X-InP.
    1. Preparar tampão HEPES [0,1 M de HEPES com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA)] para os substratos colorimétricos e ajustar o pH do tampão de acordo com o substrato que vai ser usado: pH 7,5 para a preparação de CPRG ou X-Gluc, pH 9 para MC, e pH 7 para X-InP.
    2. Preparar soluções stock dos substratos em que o pH ajustado a concentrações de tampão de HEPES de 3 mM (CPRG), 62,5 mM de (X-Gluc), 15 mM de (MC), 100 mM de (X-InP). Proteger as soluções estoque da luz.
    3. Coloque os μPADs dentro de uma placa de Petri estéril, em seguida, encaixar o microspot μPAD com 24 mL de cada solução de substrato.

4. Detecção e Análise de Dados

  1. Detecção
    1. Adicionar 6 ml da amostra enriquecida para cada microspot μPAD apropriado contido em uma placa de Petri.
    2. Coloque a tampa de volta na placa de Petri e selá-lo com Parafilm.
    3. Incubar a amostracom a μPAD a 37 ° C durante até 3 horas para permitir o desenvolvimento da cor e secagem dos microspots.
  2. Exame visual dos resultados
    1. Realizar a detecção por simples inspeção visual das mudanças de cor das μPADs.
      NOTA: Normalmente, fortes reações que produzem mudanças de cor definitivos são esperados com a 18-24 horas de enriquecimento, o que deve evitar a necessidade de mais esclarecimentos e deve ser considerado positivo.
    2. Determinar a presença de uma E. coli amostra positiva, observando microspots encaixados com a mudança CPRG do amarelo ao vermelho-violeta e microspots encaixados com X-Gluc mudança de incolor a azul-esverdeada.
    3. Determinar a presença de um L. monocytogenes amostra positiva, observando microspots encaixados com X-InP mudança de incolor a índigo.
    4. Determinar a presença de uma Salmonella spp. amostra positiva por microspots observando encaixados com MC mudança de colorless ao roxo-lilás.
  3. Software Aided Análise de Dados
    NOTA: Conduzido para determinar claramente se reacções fracas são positivos ou negativos e permitir uma análise semi-quantitativa dos resultados.
    1. Permitir que as μPADs para secar completamente.
    2. Digitalizar o μPAD usando um scanner plano.
    3. Use o software ImageJ para processar a imagem.
      1. "Abrir" imagem digitalizada para ser analisado em ImageJ localizado na guia "Arquivo" no menu principal (ou pressione "Clt + O").
      2. Inverta a imagem selecionando "Inverter", localizada na aba "Editar" no menu principal (ou pressione "Clt + Shift + I").
      3. Use a guia "Analisar" no menu principal e selecione "Definir Medidas ..." para selecionar as medições relatados analisados.
      4. Certifique-se de que a "intensidade de cinza média", "Limite de limiar", e "caixas rótulo de exibição" sãomarcada, e pressione "OK". Isso define a forma como o software analisa cada área selecionada e como ela relata ele.
      5. Use a ferramenta "Oval" para desenhar um círculo que define a área que você deseja medir dentro.
      6. Sob a guia "Analisar", selecione "Measure", (ou pressione "Clt + M"). O software irá medir a intensidade cinza médio dentro da área definida e relatá-lo em uma tela pop-up que pode ser copiado e colado para se destacar para análise posterior.
        NOTA: Para uma análise mais precisa, pelo menos, duas repetições técnicos de cada amostra deve ser realizada.

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Resultados

Tal como descrito no presente protocolo, a concentração de bactérias que usam o MMS (Figura 1) pode ser realizada dentro de aproximadamente 15-20 min. Os MMS no construídos a partir de acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS) em dois componentes separados; uma tampa e um cartucho de ambos com um espigão de montagem integrado no qual uma haste de gaze cilíndrica é inserida (Figura 1A). Os dois componentes são então aparafusado em conjunto, formando o MMS (Figura 1B). Proce...

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Discussão

Este protocolo descreve um método para a detecção de E. integrado coli, Salmonella spp., e L. monocytogenes em água agrícola. Aqui, a concentração de MMS de bactérias a partir de grandes volumes (10 L) de água na agricultura, é acoplado com o enriquecimento bacteriana, e detecção colorimétrica de bactérias indicativo usando μPADs. O procedimento MMS pode lidar com elevado teor de partículas nas amostras de água enquanto se concentra a bactérias de 10 vezes, é robusta e simples o suficiente par...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos o financiamento para este projeto das doações do Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA 2009-01208 e 2009-01984.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ÁguaÁgua de irrigação, produzir água de lavagem, água de poço, etc.
Tubo de vinilWilmarBN-CVT1005  1/4" de diâmetro interno,  Diâmetro externo de 3/8", disponível em:  http://www.wilmar.com
Cartucho de cotonete Moore modificadoLumiere Diagnostics11 ½ cm de comprimento e 4 ½ cm de largura, disponível em:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativamente, uma versão não descartável do cartucho pode ser usada (consulte o texto)
GazeChesapeake Wiper & Fornecimento, Inc.CC90Grau #90, tecido 44 x 36, disponível em:  www.raglady.com
Alvejante domésticoVáriasconcentrações de hipoclorito de sódio aprox. 6%
Tiossulfato de sódio 5-hidratoManifold Mallinckrodt Baker Inc8100-04
ConstruídointernamenteOpcional, o dispositivo pode ser construído a partir de tubos de PVC e conexões apropriadas
Bomba peristálticaMedidores de mícronRPP1300Disponível em:  http://www.micronmeters.com
Pipeta sorológicaVáriosDescartáveis, 10 ml
Caldo de pré-enriquecimento universalDifco223510
Água peptonada tamponadaSuplementoDifco 218105
SalmonellaBiomé rieux Industry42650http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) CaldoBiomé rieux Industry410848http://www.biomerieux-usa.com
VancomicinaSigma-Aldrich861987http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-AidVáriosDrummond DP-110 usado aqui
Incubadora agitadaVáriosExcella E25, New Brunswick Scientific usado aqui
Micropipeta Vários10 μ l, 1 ml
Pontas de micropipetaVáriasbarreiras, 10 μ l, 1 ml
1.5 tubos de microcentrífugaVárioslivres de RNase e DNase
Q Sonica LLCSérie
µ PADsAvant Círculos de 7 mm de diâmetro impressos em cera, com linha de 4 pt de espessura. Entre em contato com o Dr. Charles Henry para obter informações adicionais
HEPES [N-(2-Hidroxietil)piperazina-N′ -2-ácido etanossulfônico]Sigma-AldrichH3375
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA8022
Clorofenol vermelho-galactopiranosídeo (CPRG)Sigma-Aldrich59767
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronídeo (X-Gluc)Sigma-AldrichB8174
5-bromo-6-cloro-3 indolilcaprilato (magenta caprilato) Sigma-Aldrich53451
5-Bromo-4-cloro-mio-inositol fosfato (X-InP) Placas de Petri Sigma-Aldrich38896
, poliestireno 100 mm por 15 mmVáriosde mesa plana estéreis
Váriosscanners USB
Xerox Software ImageJInstitutes of Healthhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
agrícola sonicadores de sonda XL-2000 scanners National

Referências

  1. Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
  2. Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
  3. Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
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  7. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
  8. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
  9. Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
  10. Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
  11. Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
  12. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , WO2012125781 A3 (2012).
  13. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).

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