Imagiologia por espectrometria de massa (MSI) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para descobrir e identificar várias espécies químicas em tecidos intactos, preservando os compostos em seus ambientes nativos, que pode fornecer novos insights sobre processos biológicos. Aqui um método MSI desenvolvido para a análise de moléculas pequenas é descrito.
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Artigo de método
MALDI por espectrometria de massa de imagens de Investigação de metabólitos em
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Resumo
Resumo
A maioria das técnicas utilizadas para estudar moléculas pequenas, tais como fármacos ou metabolitos endógenos, empregam extractos de tecidos que requerem a homogeneização do tecido de interesse, que poderia, potencialmente, causar alterações nas vias metabólicas em estudo 1. Imagiologia por espectrometria de massa (MSI) é uma poderosa ferramenta analítica que pode fornecer informação espacial dos analitos dentro fatias intactas de amostras de tecidos biológicos 1-5. Esta técnica tem sido amplamente utilizado para o estudo de vários tipos de compostos, incluindo proteínas, péptidos, lípidos, e moléculas pequenas, tais como metabolitos endógenos. Com matriz assistida por laser de dessorção / ionização (MALDI)-MSI, distribuições espaciais de vários metabolitos podem ser detectados simultaneamente. Aqui, um método desenvolvido especificamente para a realização de experimentos de metabolômica MSI não segmentados em raízes leguminosas e nódulos radiculares é apresentado o que poderia revelar insights sobre os processos biológicos que ocorrem. Ométodo aqui apresentado mostra um fluxo de trabalho típico MSI, desde a preparação da amostra para aquisição de imagem, e centra-se na etapa de aplicação da matriz, o que demonstra várias técnicas de aplicação da matriz que são úteis para a detecção de pequenas moléculas. Uma vez que as imagens são geradas MS, a análise e identificação de metabolitos de interesse é discutido e demonstrado. O fluxo de trabalho padrão apresentado aqui pode ser facilmente modificada para diferentes tipos de tecidos, espécies moleculares e instrumentação.
Introdução
O crescente campo da metabolômica tem muitas aplicações biológicas importantes, incluindo a descoberta de biomarcadores, decifrando vias metabólicas em plantas e outros sistemas biológicos, e toxicologia profiling 4,6-10. Um grande desafio técnico ao estudar sistemas biológicos é estudar caminhos metabolômica, sem perturbar-los 11. MALDI-MSI permite a análise direta de tecidos intactos que permite a detecção sensível de analitos em órgãos individuais 12,13 e até células individuais 14,15.
A preparação da amostra é um passo crucial na produção de imagens espectrais de massa reprodutíveis e confiá....
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Protocolo
1. Instrumentação
- MALDI-TOF/TOF MSI. Use um espectrômetro de massa equipados com uma fonte MALDI para análise de moléculas pequenas (ver Tabela de Materiais / Equipamentos). Realizar aquisições no modo íon positivo ou negativo, dependendo dos analitos de interesse. Especifique um intervalo de massa de interesse e recolher 500 tiros de laser / local em 50 mM intervalos em ambas as dimensões X e Y em toda a superfície da amostra para gerar imagens de íons. A largura de varredura eo número de disparos de laser pode ser ajustado para se obter maior resolução espacial e intensidade máxima do sinal, respectivamente. Use picos matriz DHB ou padrões inter....
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Resultados
Uma visão geral experimental da MSI é mostrado na Figura 1. No início da experiência, a preparação da amostra é um passo crítico. Nódulos são cortados a partir da raiz da planta e incorporado em gelatina. O tecido deve ser achatadas contra o copo criostato, sem bolhas, enquanto ele está sendo congelado, o que irá garantir o alinhamento mais fácil e adequada do tecido enquanto ele está sendo seccionado. Quando o tecido está a ser cortado, é importante para cortar o tecido com a espessura adequada, demasi.......
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Discussão
Como discutido acima, a preparação da amostra é a etapa mais importante no fluxo de trabalho MSI. A incorporação do tecido de forma desigual causará o corte ser difícil ou não ser possível, em alguns casos. O tamanho da seção e tempo de equilíbrio adequado são fundamentais para a manutenção da integridade do tecido e evitando dobrar e lágrimas. Selecção da matriz e da técnica de aplicação vai desempenhar um papel importante na determinação dos tipos de analitos a serem detectados, a resolução espacial, e a reprodutibili.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Jean-Michel Ané no Departamento de Agronomia da UW-Madison para fornecer amostras truncatula Medicago. Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento da National Science Foundation (NSF) concessão CHE-0.957.784, a Graduate School da Universidade de Wisconsin ea Fundação Alumni Research Wisconsin (WARF) e programa Romnes Faculdade Bolsa de Investigação (a LL). EG reconhece um NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Gelatina | Difco | 214340 | calor para dissolver |
| Criostato- HM 550 | Lâminas | 956564A | |
| Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (largura x comprimento x espessura) | |
| Matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | acoplado com recipiente de aço de 75 ml |
| Sistema de pulverização de matriz automática - TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX. TMSP. H021-U | Instruções específicas de inicialização e desligamento serão dadas quando o instrumento for instalado |
| Aparelho de sublimação | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Bomba de vácuo- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Pressão final = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | Um exemplo de "software específico do vendedor" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | Instrumento MALDI de alta resolução para medições de massa precisas |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Instrumento LC-MS de alta resolução para medições de massa precisas |
Referências
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217....
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Reimpressões e permissões
