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Artigo de método

MALDI por espectrometria de massa de imagens de Investigação de metabólitos em

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⸱

DOI:

10.3791/51434

⸱

5 de março de 2014

 , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin- Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin- Madison

Neste artigo

Resumo

Imagiologia por espectrometria de massa (MSI) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para descobrir e identificar várias espécies químicas em tecidos intactos, preservando os compostos em seus ambientes nativos, que pode fornecer novos insights sobre processos biológicos. Aqui um método MSI desenvolvido para a análise de moléculas pequenas é descrito.

Resumo

A maioria das técnicas utilizadas para estudar moléculas pequenas, tais como fármacos ou metabolitos endógenos, empregam extractos de tecidos que requerem a homogeneização do tecido de interesse, que poderia, potencialmente, causar alterações nas vias metabólicas em estudo 1. Imagiologia por espectrometria de massa (MSI) é uma poderosa ferramenta analítica que pode fornecer informação espacial dos analitos dentro fatias intactas de amostras de tecidos biológicos 1-5. Esta técnica tem sido amplamente utilizado para o estudo de vários tipos de compostos, incluindo proteínas, péptidos, lípidos, e moléculas pequenas, tais como metabolitos endógenos. Com matriz assistida por laser de dessorção / ionização (MALDI)-MSI, distribuições espaciais de vários metabolitos podem ser detectados simultaneamente. Aqui, um método desenvolvido especificamente para a realização de experimentos de metabolômica MSI não segmentados em raízes leguminosas e nódulos radiculares é apresentado o que poderia revelar insights sobre os processos biológicos que ocorrem. Ométodo aqui apresentado mostra um fluxo de trabalho típico MSI, desde a preparação da amostra para aquisição de imagem, e centra-se na etapa de aplicação da matriz, o que demonstra várias técnicas de aplicação da matriz que são úteis para a detecção de pequenas moléculas. Uma vez que as imagens são geradas MS, a análise e identificação de metabolitos de interesse é discutido e demonstrado. O fluxo de trabalho padrão apresentado aqui pode ser facilmente modificada para diferentes tipos de tecidos, espécies moleculares e instrumentação.

Introdução

O crescente campo da metabolômica tem muitas aplicações biológicas importantes, incluindo a descoberta de biomarcadores, decifrando vias metabólicas em plantas e outros sistemas biológicos, e toxicologia profiling 4,6-10. Um grande desafio técnico ao estudar sistemas biológicos é estudar caminhos metabolômica, sem perturbar-los 11. MALDI-MSI permite a análise direta de tecidos intactos que permite a detecção sensível de analitos em órgãos individuais 12,13 e até células individuais 14,15.

A preparação da amostra é um passo crucial na produção de imagens espectrais de massa reprodutíveis e confiáveis. A qualidade das imagens depende muito de fatores, tais como a incorporação de tecido médio, espessura de corte, matriz MALDI, e técnica de aplicação da matriz. Para aplicações de imagem, a espessura do corte ideal é a largura de uma célula (8-20 mM, dependendo do tipo de amostra). MALDI requer a deposição de um composto orgânico, a cristalinae composto de matriz, tipicamente um ácido fraco, por exemplo para auxiliar a ablação analito e ionização. 16 matrizes diferentes proporcionam diferentes intensidades de sinal, os iões interferentes, e eficiências de ionização de diferentes classes de compostos.

A técnica de aplicação de matriz, também desempenha um papel na qualidade das imagens de espectro de massa e de diferentes técnicas são apropriadas para diferentes classes de analitos. Três métodos de aplicação da matriz são apresentadas neste protocolo: airbrush, pulverizador automático e sublimação. Aplicação matriz spray tem sido amplamente utilizado em imagiologia de MALDI. A vantagem da aplicação de spray matriz é de que é relativamente rápido e fácil. No entanto, a qualidade da aplicação matriz spray depende em grande medida da perícia do utilizador e tende a ser menos reprodutível e causar a difusão dos analitos, especialmente as pequenas moléculas de 17. Sistemas de pulverização automáticos tem mecânica semelhante ao aerógrafo aplicação da matriz, mas have foi desenvolvido para remover a variabilidade observada com aplicação manual de spray, fazendo a pulverização mais reprodutível. Este método pode às vezes ser mais demorado do que a aplicação da matriz aerógrafo tradicional. Ambos aerógrafo manual e sistemas de pulverização automáticos são métodos de aplicação de matriz à base de solvente. A sublimação é uma técnica de aplicação de matriz seca que está a tornar-se cada vez mais popular para a imagem do espectro de massa de metabolitos e pequenas moléculas, pois reduz a difusão do analito, no entanto, falta-lhe o solvente necessária para extrair e observar os compostos de massa mais elevados 18.

Confiante identificação de metabólitos normalmente requer medições de massa precisas para obter identificações putativos seguidos de massa em tandem (MS / MS) experimentos para validação, com espectros MS / MS que estão sendo comparados com os padrões, a literatura, ou espectros teórico. Neste protocolo de alta resolução (massa potência de 60.000 a m ​​/ z de 400 a resolução), a cromatografia líquida (LC)-MS está acoplado a MALDI-MSI obter tanto informações espaciais e identificações confiantes de metabolitos endógenos, usando Medicago truncatula raízes e nódulos de raiz como o sistema biológico. Experimentos MS / MS pode ser realizada diretamente sobre o tecido com MALDI-MSI ou em extratos de tecidos com LC-MS e usado para a validação das identificações de metabólitos.

Este protocolo fornece um método simples para mapear metabolitos endógenos em M. truncatula, que pode ser adaptado e aplicado a MSI de moléculas pequenas em vários tipos de tecidos e sistemas biológicos.

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Protocolo

1. Instrumentação

  1. MALDI-TOF/TOF MSI. Use um espectrômetro de massa equipados com uma fonte MALDI para análise de moléculas pequenas (ver Tabela de Materiais / Equipamentos). Realizar aquisições no modo íon positivo ou negativo, dependendo dos analitos de interesse. Especifique um intervalo de massa de interesse e recolher 500 tiros de laser / local em 50 mM intervalos em ambas as dimensões X e Y em toda a superfície da amostra para gerar imagens de íons. A largura de varredura eo número de disparos de laser pode ser ajustado para se obter maior resolução espacial e intensidade máxima do sinal, respectivamente. Use picos matriz DHB ou padrões internos aplicados ao slide ou directamente ao tecido a calibrar o espectro de massa.
  2. Alta resolução LC-MS. (Ver Tabela de Materiais / Equipamentos) extractos da amostra correr com LC-MS usando fase reversa (RP) LC com uma coluna C-18, ou fase normal (NP) com uma coluna HILIC dependendo dos analitos de interesse. Use fases móveis egradientes como apropriadas para o tipo de amostra específica. Realizar aquisições em modos de iões positivos ou negativos, dependendo do tipo de amostra.

2. Preparação Tissue

  1. Apare o nódulo da raiz da planta, deixando 3-4 mm de raiz ligados ao nódulo.
  2. Imediatamente após a dissecação, fórceps para posicionar o tecido em um copo de criostato e cobrir com gelatina (100 mg / ml em água desionizada). É essencial para o tecido a ser preso ao fundo do copo, sem bolhas de ar.
  3. Flash congelar o tecido colocando-o copo num banho de gelo seco / etanol até que a gelatina endureça e torna-se opaco. Armazenar as amostras a -80 ° C até à sua utilização.
  4. Retirar amostras do freezer -80 ° C, cortar o copo criostato plástico e corte o excesso de gelatina. Monte o tecido incorporado ao mandril criostato com uma quantidade do tamanho de dez centavos de temperatura de corte ideal (OCT) de mídia, apesar de não deixar a outubro tocar no tecido. Coloque em criostatocaixa até as solidifica outubro.
  5. Permitir que o chuck e gelatina para equilibrar na caixa de criostato (set para -20 ou -25 ° C) por aproximadamente 15 min.
  6. Utilizar o criostato (ver Tabela de Materiais / Equipment) para a secção de tecido de aproximadamente a espessura de uma célula (8-20 mM, dependendo do tipo de tecido) e descongelamento montar cada fatia sobre o vidro ITO revestido por aquecimento da parte de trás (não ITO revestido lado) de uma lâmina de vidro ITO revestido na parte de trás da sua mão. Coloque o lado ITO revestido do slide aquecido perto da fatia tecido congelado e permitir que a fatia de ficar para o slide. Colocar as seções juntos no slide irá proporcionar um melhor alinhamento durante MSI.

3. Aplicação Matrix

  1. Aplicação Airbrush de MALDI Matrix
    1. Todos os procedimentos airbrush deve ser realizada numa hote.
    2. Limpe bem a solução do recipiente e bico aerógrafo (ver Tabela de Materiais / Equipamentos) com metanol eencher o recipiente com solução de solução de matriz DHB (150 mg / ml em 50% de TFA methanol/0.1% v / v).
    3. Segurar o spray de cerca de 35 cm da amostra e aplicar 10-15 camadas de matriz sobre a superfície da lâmina com uma duração de 10 segundos de pulverização de 30 s e o tempo de secagem entre cada demão.
    4. Limpe bem o aerógrafo novamente com metanol quando terminar para evitar o entupimento da solução matriz.
  2. Aplicação pulverizador automático de MALDI Matrix
    1. Siga as instruções de arranque fornecidos pelos fabricantes do sistema de pulverizador automático.
    2. Para MSI de metabolitos em nódulos de raiz, usando 40 mg / ml (em 50% de TFA methanol/0.1% v / v) como a matriz de DHB, ajustar a temperatura de ~ 80 ° C, a velocidade a 1.250 mm / min, velocidade de fluxo de 50 il / min, e o número de passagens para 24. Para melhor cobertura, recomenda-se rodar o bocal 90 ° e / ou deslocamento do bocal 1,5 mm entre cada passagem. Comece método pulverizador.
      Como um side nota, o sistema pulverizador particular usado aqui aquece o bocal para a mais rápida evaporação do solvente. À medida que o solvente se evapora, a concentração da matriz aumenta rapidamente. A matriz aplicada à amostra com o aerógrafo e do pulverizador automático têm concentrações comparáveis.
    3. Siga as instruções de desligamento fornecidos pelos fabricantes do sistema de pulverizador automático.
  3. Aplicação de sublimação de MALDI Matrix
    1. Pesar 300 mg DHB para o fundo da câmara de sublimação (ver Tabela de Materiais / Equipamento).
    2. Furar a lâmina de vidro para o dedo frio (porção superior da câmara de sublimação) com as secções de tecido virada para baixo com uma fita de dupla face, condutora. Cubra toda a parte de trás da lâmina com a fita dupla face, mesmo para condutividade, produzindo até mesmo deposição de matriz.
    3. Fixar as metades superior e inferior da câmara de sublimação juntamente com o grampo C. Ligar o vácuo e add gelo e água fria para a parte superior do reservatório.
    4. Coloque câmara de sublimação em uma manta de aquecimento, que está à temperatura ambiente.
    5. Ligue a bomba de vácuo. Espere 15 minutos e ligue a manta de aquecimento. A manta de aquecimento deve atingir cerca de 120 ° C ao longo de 10 min.
    6. Após 10 min, desligue o fogo, perto da válvula de vácuo (para o interior da câmara permanece sob vácuo) e desligue a bomba de vácuo.
    7. Permitir que a câmara de voltar à temperatura ambiente, abre a válvula de libertação da pressão de vácuo e remover a amostra. O tamanho da câmara de sublimação vai determinar a quantidade de matriz sublimado à lâmina de vidro. As câmaras de sublimação maiores (do tamanho de um copo de 400 ml) vai usar aproximadamente 300 mg de DHB, enquanto as câmaras mais pequenas (do tamanho de um copo de 150 ml) vai usar aproximadamente 100 mg de DHB e irá requerer o corte da lâmina de vidro, de modo que ele se encaixa na câmara.

4. Aquisição de Imagem

  1. Mark um padrão + em cada canto da amostra com uma caneta corretivo líquido WiteOut para ser usado como "ensinam pontos". Coloque a lâmina de vidro na placa de adaptador de slides MALDI e ter uma imagem óptica da amostra, utilizando um scanner.
  2. Configure um arquivo de aquisição de imagem, utilizando o software fornecido pela empresa de instrumentos com um tamanho de passo de varredura de 50 mm e um diâmetro de laser igual ou menor do que o tamanho do passo de varredura. Neste instrumento em particular, que a configuração mínima do laser dá um diâmetro de laser de cerca de 10 um e uma pequena configuração de laser tem um diâmetro de 40-50 ^ m.
  3. Carregar a imagem óptica para dentro do software e alinhar a placa com a imagem óptica.
  4. Calibrar o aparelho antes de iniciar a aquisição usando íons comuns matriz de fragmentação, normas internas, ou uma mistura de calibração.
  5. Especificar as áreas de tecido a ser analisado com a MSI, incluindo um local de matriz pura sobre a lâmina a ser usado como um "branco".
  6. Comece acquisition.

5. Geração de Imagem

  1. Abra o arquivo de imagem no software disponível comercialmente fornecido pelo fornecedor e extrair as imagens de íons. Outros softwares de código aberto está disponível para processamento de dados MSI 19.

6. Metabolite Identificação

  1. Selecione um m / z de interesse específico do espectro de massa usando o software específico do fornecedor (ver Tabela de Materiais / Equipamentos). Um objecto de análise pode ser distinguido de um ião de matriz quando um pico de analito é seleccionado a partir do espectro de massa e de iões de imagens são geradas especificamente localizada em secção de tecido.
  2. Gere uma lista de analitos de interesse e realizar experimentos MS / MS. Ver Tabela 1 e Tabela 2 em resultados representativos para listas de amostras de analitos.
  3. Realizar análise de LC-MS alvejado em um espectrômetro de massa de alta resolução (ou alta resolução MALDI-MS, se disponível) para obter resultados precisosmedições de massa dos analitos de interesse e também realizar LC-MS/MS dos analitos-alvo para obter padrões de fragmentação característico.
  4. Realize banco de dados em busca de determinar identificações putativos para os analitos alvo. Exemplos de bases de dados de metabólitos incluem: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG e HMDB.
  5. Para confirmar as identificações putativos de pesquisa de banco de dados de massa exata, coincidir com o MS / MS dos analitos direcionados para MS / MS espectros dos padrões, da literatura, e / ou software de previsão de fragmentação.

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Resultados

Uma visão geral experimental da MSI é mostrado na Figura 1. No início da experiência, a preparação da amostra é um passo crítico. Nódulos são cortados a partir da raiz da planta e incorporado em gelatina. O tecido deve ser achatadas contra o copo criostato, sem bolhas, enquanto ele está sendo congelado, o que irá garantir o alinhamento mais fácil e adequada do tecido enquanto ele está sendo seccionado. Quando o tecido está a ser cortado, é importante para cortar o tecido com a espessura adequada, demasi...

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Discussão

Como discutido acima, a preparação da amostra é a etapa mais importante no fluxo de trabalho MSI. A incorporação do tecido de forma desigual causará o corte ser difícil ou não ser possível, em alguns casos. O tamanho da seção e tempo de equilíbrio adequado são fundamentais para a manutenção da integridade do tecido e evitando dobrar e lágrimas. Selecção da matriz e da técnica de aplicação vai desempenhar um papel importante na determinação dos tipos de analitos a serem detectados, a resolução espacial, e a reprodutibili...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer o Dr. Jean-Michel Ané no Departamento de Agronomia da UW-Madison para fornecer amostras truncatula Medicago. Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento da National Science Foundation (NSF) concessão CHE-0.957.784, a Graduate School da Universidade de Wisconsin ea Fundação Alumni Research Wisconsin (WARF) e programa Romnes Faculdade Bolsa de Investigação (a LL). EG reconhece um NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GelatinaDifco214340calor para dissolver
Criostato- HM 550Lâminas956564A
 Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0.8 mm (largura x comprimento x espessura)
Matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) ICN BiomedicalsPI90033
AirbrushPaasche Airbrush CompanyTG-100Dacoplado com recipiente de aço de 75 ml
Sistema de pulverização de matriz automática - TM-SprayerHTX Technologies, LLCHTX. TMSP. H021-UInstruções específicas de inicialização e desligamento serão dadas quando o instrumento for instalado
Aparelho de sublimação Chemglass Life ScienceCG-3038-01
Bomba de vácuo- Alcatel 2008 AIdeal Vacuum ProductsP10976Pressão final = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics276601
FlexImagingBruker Daltonics269841Um exemplo de "software específico do vendedor"
MALDI LTQ OrbitrapThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMASZInstrumento MALDI de alta resolução para medições de massa precisas
Q ExactiveThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRInstrumento LC-MS de alta resolução para medições de massa precisas
de vidro revestidas com óxido de índio e estanho (ITO) da Thermo Scientific

Referências

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