Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Resumo

As interações entre proteínas são fundamentais para todos os processos celulares. Usando bioluminescência Transferência de Energia de Ressonância, a interacção entre um par de proteínas podem ser monitoradas em células vivas e em tempo real. Além disso, os efeitos das mutações potencialmente patogénicos pode ser avaliada.

Resumo

Ensaios com base na transferência de Bioluminescência Resonance Energy (BRET) fornecer meios sensíveis e confiáveis ​​para monitorar as interações proteína-proteína em células vivas. BRET é a transferência não radiativa de energia a partir de uma enzima luciferase 'dador' para uma proteína fluorescente "aceitadora". Na configuração mais comum deste ensaio, o doador é Renilla reniformis luciferase eo receptor é uma proteína fluorescente amarela (YFP). Devido a eficiência de transferência de energia é fortemente dependente da distância, a observação do fenômeno BRET exige que o doador e receptor estar em estreita proximidade. Para se testar a interacção entre duas proteínas de interesse em células de mamíferos em cultura, uma proteína é expressa como uma fusão com a luciferase e a segunda forma de uma fusão com a YFP. Uma interação entre as duas proteínas de interesse podem levar o doador e receptor suficientemente perto para a transferência de energia para ocorrer. Em comparação com outras técnicas para a investigação de proteína-proteína eminterações, o ensaio BRET é sensível, requer pouca prática em tempo e alguns reagentes, e é capaz de detectar as interações que são fracos, transitórios, ou dependente do ambiente bioquímico encontrado dentro de uma célula viva. É, portanto, uma abordagem ideal para confirmar interacções putativos sugeridos pela proteómica estudos de levedura de dois híbridos ou de espectrometria de massa, e, além disso, é bem apropriado para as regiões de mapeamento interagindo, avaliando o efeito de modificações pós-traducionais sobre as interacções proteína-proteína, e avaliar o impacto das mutações identificadas no DNA do paciente.

Introdução

Ambos ligação clássica e de próxima geração analisa seqüenciamento de doenças humanas estão revelando a relevância clínica de proteínas envolvidas em uma variedade de caminhos biológicos. É muitas vezes o caso de que, antes da sua identificação, em tais estudos, verificou-se pouca ou nenhuma investigação do papel biológico destas proteínas. Uma via proveitosa para começar a explorar a função biológica de uma proteína de interesse é o de identificar quais outras proteínas que interagem com o seu contexto na fisiológico. Caracterizando redes moleculares desta forma fornece insights sobre os caminhos biológicos subjacentes ao fenótipo humano.

Protocolo

1. Criação de plasmídeos

1. Subclonar os ADNc para cada uma das proteínas de interesse em ambos os vectores płuc e pYFP, ​​utilizando técnicas de biologia molecular convencionais (Figura 1). Para protocolos detalhados ver Green et al ^13.
2. Sequência de todas as construções para verificar que as proteínas de interesse são em moldura com a sequência de Luc / YFP sem intervenientes codões de paragem.
3. Realizar ensaios funcionais, tal como desejado para confirmar que as proteínas de fusão retêm a actividade biológica. No caso apresentado a localização subcelular de proteínas de fusão YFP foi determinado por mi....

Resultados

O princípio do ensaio BRET é ilustrada na Figura 2. A configuração do ensaio usado ao longo das experiências aqui apresentadas é descrito na Figura 3. A detecção de um sinal de BRET forte a partir de células transfectadas com uma proteína de fusão de luciferase-YFP confirmou que a transferência de energia foi observável nesta configuração experimental (Figura 4).

Nossa pesquisa centra-se no papel da família FOXP de repressores transcricionai.......

Discussão

O design das construções de expressão de proteínas de fusão é um passo crítico na criação do ensaio BRET. Nas experiências aqui apresentadas, as proteínas de interesse foram fundidos com o terminal C da luciferase ou YFP. Também é possível, e pode ser necessário, para fundir as proteínas para o N-terminal de luciferase / YFP. Para algumas proteínas, fusões só podem ser aceites em qualquer N-ou C-terminal, a fim de evitar a ruptura da estrutura e função de proteínas. Além disso, para as proteínas transmembranares, em que.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nanodrop 8000	Nanodrop		Qualquer espectrofotômetro capaz de ler absorbâncias a 260 nm será adequado. Determinar a massa molecular do plasmídeo é crucial para calcular as quantidades de DNA a serem usadas em misturas de transfecção.
Placas de 96 micropoços, fundo plano, branco	Greiner Bio One	655098	As placas brancas reduzem a diafonia entre os poços e maximizam a sensibilidade da detecção de luminescência. Os poços de fundo transparente permitem o monitoramento da densidade celular. As placas devem ser adequadas para cultura de células. Se estiver usando um luminômetro de leitura superior, a tampa da placa deve ser retirada.
Leitor de placas F200Pro infinito com software de controle	TECAN		Use os filtros 'Azul 1' e 'Verde 1' para medição de luminescência e os conjuntos de filtros e espelho dicóico para GFP para medição de fluorescência. Qualquer leitor de placa de leitura superior com capacidade de medir luminescência e fluorescência de duas cores é adequado.
pLuc, pYFP, plasmídeo de controle positivo	N/A	N/A	Plasmídeos disponíveis nos autores mediante solicitação.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Plasmídeo de enchimento para equilização da massa de DNA em misturas de transfecção. Qualquer plasmídeo sem um promotor eucariótico seria adequado.
Células HEK293	ECACC	85120602	Outras linhagens celulares que transfectam com eficiência razoável podem ser adequadas.
DMEM, glicose alta, com vermelho de fenol	Gibco	41966	Este é o meio usado para cultivar células HEK293. Quente em 37 > C banho-maria antes de usar. Se estiver usando uma linha celular diferente, substitua o meio de crescimento descrito aqui por um meio específico da linha celular.
DMEM, glicose alta, sem vermelho de fenol (meio de diluição do substrato)	Gibco	21063	Este é o meio de diluição do substrato usado para diluição do substrato de luciferase (EnduRen), pois não contém vermelho de fenol, o que reduz a sensibilidade do ensaio. Contém HEPES para manter o pH correto durante as medições de luminescência enquanto as células estão fora da incubadora de CO2. Quente em 37 > C banho-maria antes de usar.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM é usado para diluição do reagente de transfecção GeneJuice. Outros meios sem soro também seriam adequados. Aqueça à temperatura ambiente antes de usar.
Soro fetal bovino	Gibco	10270	Para suplementação de meios de cultura celular na concentração de 10% v/v.
Reagente de transfecção GeneJuice	Novagen	70967	Se estiver usando uma linha celular diferente de HEK293, pode ser necessário ajustar a proporção de reagente de transfecção Genejuice para DNA nas misturas de transfecção. Outros reagentes de transfecção podem ser usados. Se estiver usando um reagente de transfecção alternativo, pode ser necessário otimizar a quantidade de DNA usada nas misturas de transfecção com base nas instruções do fabricante.
DMSO	Sigma	D2650	Use DMSO estéril adequado para cultura de tecidos.
Substrato de células vivas EnduRen	Promega	E6481	Reconstitui EnduRen a 34 mg / ml em DMSO. Após a diluição de EnduRen em meio de cultura, pode formar-se um precipitado. Isso não interferirá no ensaio. Loja reconstituída EnduRen em -20 & C e evite vários ciclos de congelamento e descongelamento. Certifique-se de que o EnduRen reconstituído esteja completamente descongelado antes de diluí-lo em meio de cultura.