Isolamento de ARN a partir de pequenas não-codificante de Soro Humano

Resumo

Este protocolo descreve um método para extrair pequenos RNAs de soro humano. Temos utilizado este método para isolar microRNAs de soro câncer para uso em matrizes de DNA e também singleplex PCR quantitativo. O protocolo utiliza fenol e tiocianato de guanidina reagentes com modificações para produzir RNA de alta qualidade.

Resumo

A análise do ARN e a sua expressão é uma característica comum em muitos laboratórios. De importância é o surgimento de pequenos RNAs como microRNAs, que são encontradas em células de mamíferos. Estes pequenos RNAs são genes reguladores potentes que controlam as vias vitais como crescimento, desenvolvimento e morte e muito interesse tem sido direcionada para a sua expressão em fluidos corporais. Isto é devido à sua desregulação em doenças humanas como câncer e sua potencial aplicação como marcadores biológicos. No entanto, a análise da expressão de miARN no soro pode ser problemático. Na maioria dos casos, a quantidade de soro é limitante e soro contém baixas quantidades de ARN total, da qual os pequenos RNAs constituem apenas 0,4-0,5% ^1. Assim, o isolamento de quantidades suficientes de ARN de qualidade a partir de soro é um grande desafio para os investigadores hoje. Neste documento técnico, demonstramos um método que utiliza apenas 400 mL de soro humano para obter RNA suficiente tanto para matrizes de DNA ou análise de qPCR. A umdvantages deste método são sua simplicidade e capacidade para produzir RNA de alta qualidade. Ele não requer colunas especializadas para purificação de pequenos RNAs e utiliza reagentes gerais e hardware encontrados em laboratórios comuns. O nosso método utiliza uma fase de bloqueio do gel para eliminar a contaminação com fenol e, ao mesmo tempo obtendo-se o RNA de alta qualidade. Apresentamos também um passo adicional para remover mais contaminantes durante a fase de isolamento. Este protocolo é muito eficaz no isolamento de rendimentos de ARN total de até 100 ng / mL de soro, mas também podem ser adaptadas para outros tecidos biológicos.

Introdução

Nos últimos anos, tem havido um esforço crescente para descobrir novos biomarcadores para a detecção precoce de doenças humanas. Muita atenção tem sido focada no uso de pequenos RNAs como microRNAs ² (miRNAs ou RIM) como potenciais marcadores. Estes pequenos RNAs são encontradas nos fluidos corporais, tais como soro e estudos têm demonstrado que são resistentes à degradação e são estáveis ​​ao longo de um intervalo de variação das condições ambientais ^3. Dadas estas características miRNAs, soro ou circulantes são o biomarcador ideal ^{4, 5.} Atualmente, existem duas abordagens principais para o isolamento de RNA pequeno a partir de fluidos biológicos. A primeira abordagem utiliza tecnologia baseada em coluna para ligar e eluir os pequenos RNAs ^6, enquanto a segunda abordagem utiliza o protocolo de longa data com fenol e guanidina tiocianato reagentes ^7. Nós desenvolvemos um protocolo livre de coluna simples, eficaz para isolar pequenos RNAs de soro humano. O ARN isolado é imediatamentediatamente utilizável em aplicações a jusante, incluindo arranjos de oligonucleotídeos de DNA e RNA seqüenciamento.

Este protocolo foi desenvolvido porque fomos confrontados com vários problemas ao usar métodos baseados em fenol para isolar RNA do soro. A abordagem tradicional Chomczynski é freqüentemente usado na maioria dos laboratórios com uma gama de reagentes disponíveis da maioria dos fornecedores comerciais. No entanto, considerando a sua utilização generalizada, directrizes rigorosas não foram desenvolvidos para produzir consistentemente RNA de alta qualidade a partir de fluidos corporais, em particular sangue ou soro.

Os problemas comuns associados com o isolamento de RNA a partir do soro incluem rendimentos baixos de RNA e contaminação com os reagentes utilizados durante o isolamento, em particular fenol. Nossa abordagem elimina esses contaminantes fenol para fornecer RNA de alta qualidade para a análise a jusante, como PCR quantitativo (qPCR) e RNA seqüenciamento. Nós testamos ainda este RNA em matrizes de miRNA.

Protocolo

Nota: as amostras de soro humano de pacientes saudáveis ​​ou pacientes com câncer foram obtidos com o consentimento informado no âmbito de protocolos éticos humanos aprovados do Royal Prince Alfred Hospital Sydney (número protocolo X10-0016 e HREC/10/RPAH/24) e da Universidade de Tecnologia, Sydney. As amostras de soro foram coletadas de pacientes antes da cirurgia de vários hospitais Sydney e colocados em armazenamento a -80 ° C.

1. Pequeno Isolamento de ARN a partir de Soro

O RNA total foi preparado a partir de soro humano, utilizando uma versão modificada do protocolo LS Tri-Reagent RT.

1. Descongelar amostra de soro congelado em gelo e, em seguida, transferir 400 ul do soro descongeladas recentemente para um tubo de microcentrífuga rotulado.
2. Diluir o soro com 100 uL de RNase livre _H2O e adicionar proteinase K numa concentração de 1 mg / ml.
3. Incubar a 37 ° C durante 20 min para permitir a digestão de proteínas por proteinase K.
4. To assegurar a solubilização completa, adicionar 1,5 vezes o seu volume de Tri-Reagent RT LS e 100 uL de 4-bromoanisole.
5. Resumidamente inverter o homogeneizado, efectuar trabalho repetitivo de 5 seg e transferir para um tubo de 2 mL pesado Phase Lock rotulado.
6. Girar o homogeneizado a 12.000 x g durante 20 min a 4 ° C.
7. Decantar cuidadosamente, pelo menos, 1 ml da solução aquosa resultante para um tubo de ADN LoBind fresco. A interfase orgânico e deve ser preso debaixo do gel branco do tubo Phase Lock.
8. Adicionar 5,0 mL de glicogénio (5 mg / ml) e 500 mL de isopropanol a 100% para a solução aquosa, misturar por inversão, e incubar O / N à temperatura de -20 ° C.
9. Na sequência S / N de incubação, centrifuga a amostra durante 20 min a 12.000 x g numa centrífuga a 4 ° C.
10. Descartar o sobrenadante transparente e realizar uma rotação de "flash" durante 2 min a 16.000 x g numa centrífuga a 4 ° C.
11. Retire cuidadosamente o sol clarouição em torno do sedimento utilizando uma pipeta.
12. Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se a 10000 × g durante 10 min. Decantar a solução de lavagem e repita o passo de lavagem.

2. ARN ressuspensão em Solução

1. Ressuspender o sedimento em 10 ml de RNase livre _H2O, garantindo a pelete estar completamente dissolvido. Para assegurar que o RNA está completamente solubilizado, a amostra pode ser aquecida a 55 ° C durante 5 min. Durante este tempo, a mistura da amostra com pipetagem repetida. Para um rendimento total de ARN mais elevado, reunir duas preparações de RNA a partir do mesmo paciente.
2. Quantificar o ARN ressuspendido utilizando um espectrofotómetro de UV-Vis e avaliar a qualidade do RNA utilizando um 2100 Bioanalyzer. Armazenar as amostras de ARN reunidas a -80 ° C para utilização em aplicações a jusante.

Resultados

A Figura 1 representa um espectro típico de UV / Vis de RNA isolado a partir do soro. A partir deste perfil, observamos contaminação de proteína a 280 nm com fenol e contaminantes orgânicos, tanto a 270 nm e 230 nm, respectivamente. Resíduo de tiocianato de guanidina foi também observado a 260 nm. Para reduzir os contaminantes, uma série de passos de optimização foram feitas com o processo RT-LS Tri-Reagent padrão. Nós adicionados 5 mg / mL de glicogénio para aumentar tanto o rendimento total do RNA e r...

Discussão

A população de microRNAs constitui cerca de 0,4-0,5% do ARN total encontrada no soro. Além disso, há também um alto teor de proteína encontrada em soro humano. Para melhorar o RNA e reduzir a proteína e fenol contamina modificámos a abordagem tradicional Chomczynski ⁹ com a adição de várias etapas.

O RNA total foi isolado a partir de soro, usando o padrão de Tri-Reagent RT-LS (Centro de Investigação Molecular), no entanto, quando executados no nosso laboratório, este método produz...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Center, EUA	TR 118
Livre de RNase H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinase K	Finnzymes, Finlândia	EO0491
Tubo Heavy Phase Lock	5PRIME	2302830	com capacidade de 2 ml
	Eppendorf	0030 108.078	1,5 ml capacidade
Glicogênio	Invitrogen, EUA	10814-010	5 mg/ml
de isopropanol de grau de RNA	Sigma Aldrich, EUA	I9516	Centrífuga 100%
refrigerada	John Morris
Nanodrop UV-Vis espectrofotômetro	Thermo Fisher Scientific, EUA
Etanol de grau de RNA	Sigma Aldrich, EUA	E7023	70%
Bioanalisador Agilent 2100	Agilent, EUA