Artigo de método

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

DOI:

10.3791/51446

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27 de agosto de 2014

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1LENS - European Laboratory for Non-linear Spectroscopy, University of Florence, 2Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 3Department of Biology, University of Florence, 4Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 5National Institute of Optics-National Research Council, Italy, 6International Center of Computational Neurophotonics

Neste artigo

Resumo

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Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.

Resumo

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O artigo descreve a combinação de pinças ópticas e detecção de fluorescência de molécula única para o estudo da interação proteína-DNA. O método oferece a oportunidade de investigar as interações que ocorrem em solução (evitando assim problemas devido a superfícies próximas como em outros métodos de molécula única), controlando a extensão do DNA e rastreando a dinâmica da interação em função dos parâmetros mecânicos e da sequência de DNA. Os métodos para estabelecer o aprisionamento óptico bem-sucedido e a localização nanométrica de moléculas únicas são ilustrados. Ilustramos as condições experimentais que permitem o estudo da interação do repressor de lactose (lacI), marcado com Atto532, com uma molécula de DNA contendo sequências alvo específicas (operadores) para ligação ao LacI. O método permite a observação de interações específicas nos operadores, bem como a difusão unidimensional da proteína durante o processo de busca de alvos. O método é amplamente aplicável ao estudo das interações proteína-DNA, mas também a motores moleculares, onde o controle da tensão aplicada ao polímero da trilha parceira (por exemplo, actina ou microtúbulos) é desejável.

Introdução

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Molécula única (SM) técnicas têm muito desenvolvido ao longo dos últimos 30 anos para responder à necessidade de superar algumas das limitações dos tradicionais, as medições da solução a granel 1-3. A manipulação de moléculas biológicas únicas criou a oportunidade para medir as propriedades mecânicas de biopolímeros 4 e controlar as propriedades mecânicas da proteína-proteína 5 e interacções proteína-ADN 6,7. Detecção de fluorescência SM, por outro lado, representa uma ferramenta extremamente versátil para estudar a actividade da proteína in vitro e in vivo, conduzindo a possibilidade de localizar e rastrear as mol....

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Protocolo

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1 Pinças Ópticas instalação com nanômetro Estabilidade

A configuração experimental deve fornecer duas pinças ópticas com apontando estabilidade a nível nanométrico e intensidade flutuações do laser de aprisionamento abaixo de 1%. Combinação dessas condições vai garantir estabilidade nanômetros do haltere sob tensão normal (1 PN - algumas dezenas de pn), rigidez armadilha (0,1 PN / nm) e largura de banda de medição (taxa de aquisição de imagem de 20 seg -1). Um esquema da montagem experimental é mostrada na Figura 1.

  1. Projeto pinças ópticas e de construção 15,17:
    1. Monte o aparato exp....

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Resultados

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Em uma experiência positiva, uma (ou mais) proteínas marcadas passam por ligação / desligação de difusão e / ou unidimensional ao longo da molécula de DNA (Figura 3A). A localização de proteínas ao longo da molécula de ADN permite a quantificação dos parâmetros cinéticos, como uma função da sequência de ADN. Quando são aplicadas as condições do tampão que causam a difusão 1E, é possível seguir trajectórias de proteína, e determinar, por exemplo, o coeficiente de difusão D 1E.

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Discussão

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Na última década, as técnicas simples de manipulação de imagem e de moléculas houve um grande progresso em termos de resolução espacial e temporal. A combinação das técnicas de manipulação de imagem e está na base de poderosos instrumentos que agora permitem o controlo das condições mecânicas de um único polímero biológico, tal como ADN, ARN ou filamentos do citoesqueleto, a localização e simultânea de proteínas individuais de interagir com o mesmo polímero . Controlando as condições mecânicas do polímero de presa é de .......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos Gijs wuite, Erwin JG Peterman, e Peter Gross para ajudar com a microfluídica e Alessia Tempestini para obter ajuda com a preparação da amostra. Esta pesquisa foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de subvenção n ° 284464 e do Ministério da Educação italiano, Universidade e Pesquisa FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro em Ricerca 2013 RBFR13V4M2, e no âmbito da Projeto Nanomax Flagship.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Isoladores elastoméricosNewportNewdampEscolha o elastômero Newdamp apropriado, dependendo do peso do microscópio e das frequências de ressonância
Isolador ópticoÓptica para pesquisaIO-3-YAG-VHP
Laser Nd:YAG, comprimento de onda de 1.064 nmEspectro-FísicaMillennia IR
Defletores acústico-ópticos (AODs)A& A optoeletrônicoDTS-XY 250
Direct Digital SynthesizersAnalog Devices
Detector de quadrante fotodiodosOSI optoeletrônicaSPOT-15-YAG
DIO e placa FPGANational InstrumentsNI-PCI-7830R
Lâmpada halógenaSchottKL 1500 LCD
CondensadorOlympusU-AAC 1.4NA Objetiva Aplanat Apchromat
NikonCFI Plan Apochromat 60x 1.2NA imersão
532 nm laserCoherentSapphire
CCD 200X e 2000XHamamatsu XC-ST70 CE
CCD multiplicado por elétronsHamamatsu C9100-13
Platina Piezo com precisão nmPhysik InstrumenteP-527.2CL 
Filtro de EmissãoChroma Technologies600/100m
Contas de Sílica (1.54 mm)Bangs LaboratoriesSS04N/5303
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma AldrichB4287
Acetato de pentilo Sigma Aldrich46022Líquido e vapor inflamáveis (No 1272/2008)
NitroceluloseSigma AldrichN8267-5EASólido inflamável  (n.o 1272/2008)
Bloco de calorMPM Instruments SrlM502-HBDcom 2 blocos removíveis; pré-aquecido a 120 & C
NanoPort montaUpchurch Scientific Inc.N-333
 Upchurch Scientific Inc.1535
Suporte metálico caseiro para a montagem do reservatório de pressão da câmara de fluxo feito de
2,5 mlTerumoSS 02LZ1
Válvulas de corte Upchurch Científica, Inc.P-732
Conexões sem flange Upchurch Científica, Inc.LT-111
 Upchurch Científica, Inc.1549
Duas válvulas solenóides controladas por computadorClippard, Cincinnati, EUAET-2-H-M5
Transdutor de pressãoDruck LTDPTX 1400
biotina-14-dCTP Life Technologies19518-018
Terminal desoxinucleotidil Transferase (TdT)ThermoscientificEP0161
ATTO532 maleimidaSigma Aldrich68499
N,N-dimetilformamida (DMF) Sigma Aldrich227056Líquido Combustível, Nocivo pela absorção pela pele. Irritante Teratógeno. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; Pág. 201; Pág. 261; Pág. 280; Pág. 305; Pág. 351; Pág. 338; P311
Cloridrato de tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP) Sigma AldrichC4706
L-Glutationa reduzida (GSH)Sigma AldrichG4251Toxicidade aguda, Oral (Categoria 5), H303
Amicon Ultra-15, Membrana PLQK Ultracel-PL, 10  Concentradores de spin de corte kDaMerck MilliporeUFC901024
grânulos de poliestireno revestidos com estreptavidina 1,87 µ mSpherotech, Inc.SVP-15-5
em águaTubulação de polieteretercetona seringas de ponta de trava Luer de Plexiglass Tubo de etileno propileno fluorado

Referências

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  1. Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
  2. Tinoco, I., Gonzalez, R. L.

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