A aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos

Resumo

Tratamento de osteoblastos primários de rato com ácido retinóico produz uma população homogênea de células ramificadas que carregam características morfológicas e moleculares de osteócitos. O método supera a dificuldade de obtenção e manutenção de osteócitos primárias em cultura, e pode ser vantajosa para o estudo de células derivadas de modelos transgénicos.

Resumo

A necessidade de culturas osteócitos é bem conhecido para a comunidade de pesquisadores de osso; isolamento de osteócitos primário é difícil e produz números de celular de baixa. Portanto, o sistema celular mais extensamente utilizado é a linha de células MLO-Y4-osteócito semelhantes.

O método aqui descrito refere-se à utilização de ácido retinóico para gerar uma população de células homogéneas ramificadas com características morfológicas e osteócitos moleculares.

Após o isolamento de osteoblastos de calvárias de ratinho, o ácido all-trans retinóico (ATRA) é adicionado ao meio celular, e monitorização celular é conduzida por dia, sob um microscópio invertido. Primeiros alterações morfológicas são detectáveis ​​após 2 dias de tratamento e diferenciação está geralmente completa em 5 dias, com o desenvolvimento progressivo de dendrites, a perda da capacidade para produzir matriz extracelular, a infra-regulação de marcadores de osteoblastos e a sobre-regulação de moléculas específicas de osteócitos. conteúdo "> monitoramento de células diária é necessária devido à variabilidade inerente de pilhas, eo protocolo pode ser adaptado com variação mínima de células obtidas a partir de diferentes linhagens de camundongos e aplicadas a modelos transgênicos.

O método é fácil de realizar e não requerem instrumentação especial, que é altamente reprodutível, e rapidamente gera uma população osteócito madura em completa ausência de matriz extracelular, que permite a utilização destas células para aplicações biológicas ilimitadas.

Introdução

Osteócitos, o tipo de célula mais abundante do osso, são terminalmente diferenciados, células altamente ramificados profundamente situadas dentro do esqueleto. O corpo celular de osteócitos maduros estão contidas em lacunas de osso e têm diversas formas; osteócitos com corpos celulares alongados são encontrados no osso cortical, enquanto osteocytes arredondadas são mais freqüentes no osso trabecular ^1. Dendritos ramificados estender a partir do corpo celular e residem em pequenos canais chamados canalículos, formando uma intrincada rede que faz com que vários contatos não só com outros osteócitos, mas também com outros tipos de células do osso, medula ósse....

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a regulamentação em vigor da Europa em matéria de protecção dos animais utilizados para fins científicos e foram analisados ​​e aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Milão e Nacional.

1. Isolamento de osteoblastos primários

O método, com modificações menores, segue o procedimento descrito por Dodig et al ^14.

1. Prepare digerindo médio, por adição de 0,1% de colagenase P e 0,05% de tripsina (a partir de 2,5% de tripsina 10x, sem vermelho de fenol) com meio HBSS (Solução Salina Equilibrada de....

Resultados

Os resultados foram obtidos 5-10 experiências independentes.

Morfologia celular

AA / GP tratado pilhas têm características principalmente de paralelepípedos-like, característica dos osteoblastos maduros. Células ramificadas intercaladas (conforme indicado pelas setas vermelhas na Figura 1A) pode ser encontrado, o que provavelmente representa cerca de osteócitos.

Com o tratamento com ATRA, as células começam rapidamente visu.......

Discussão

Nos últimos anos, o osteócito emergiu como a célula mais central do osso. Avanços da pesquisa são progressivamente revelando um número de propriedades osteócitos anteriormente insuspeitas ou não comprovadas, que são de enorme valor para a concepção de novos e melhores tratamentos para uma variedade de doenças ósseas. No entanto, a investigação de biologia osteócito tem vindo a sofrer de disponibilidade limitada de modelos in vitro de tal forma que os osteoblastos têm sido utilizados como substitutos de células .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagenase P	Roche Applied Science	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	Pré-aquecer a 37 ° C antes
de usar Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Pré-aquecer a 37 ° C antes
de usar FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Estreptomicina/Penicilina	Sigma-Aldrich	P4333
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A4403
Glicerol 2-fosfato dissódico sal hidratado	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Proteja o ATRA da luz
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolva em PBS e filtre antes de usar. Sempre trabalhe sob uma capa química.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Pode ser adicionado ao anticorpo secundário
Vermelho de alizarina	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Ácido perclórico	Sigma-Aldrich	176745	Use com cautela (recomenda-se proteção para a pele e os olhos)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	Use com cautela (recomenda-se proteção para a pele e os olhos)
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Pinças Econômicas #7, pontas de 0,40 x 0,5 mm	World Precision Instruments	501981
Pinças Econômicas #4, pontas de 0,40 x 0,45 mm	World Precision Instruments	501978
Tesoura de dissecação, reta, curvada de 10 cm	World Precision Instruments	14394
Tesoura cirúrgica, 14 cm, reta, S/S	World Precision Instruments	501218
frascos de cultura	Corning	430168
placas de poço	Corning	3335
Thermanox lamínulas	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
Microscópio	Zeiss Apotome
Espectrômetro	Safas Xenius