Method Article

A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

DOI:

10.3791/51474

⸱

September 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, Los Angeles, 2Department of Aerospace and Mechanical Engineering, University of Notre Dame, 3Molecular Imaging Center, University of Southern California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós demonstramos um ensaio baseado em microfluídica para medir a escala de tempo para que as células de trânsito através de uma seqüência de constrições em escala mícron.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós detalhe do desenho, fabrico e utilização de um dispositivo de microfluidos para avaliar a capacidade de deformação de um grande número de células individuais de uma maneira eficiente. Tipicamente, os dados de 10 ~ 2 células pode ser adquirida num experimento 1 hr. Um programa automatizado de análise de imagem permite que a análise pós-experimento eficiente de dados de imagem, permitindo o processamento a ser completa dentro de algumas horas. Nossa geometria do dispositivo é único na medida em que as células têm de se deformar através de uma série de constrições escala mícron, permitindo assim a deformação inicial e dependente do tempo de relaxamento de células individuais a serem ensaiadas. A aplicabilidade deste método para leucemia promielocítica humana (HL-60) células é demonstrada. Células Conduzindo a deformar através constrições micro-escala, utilizando fluxo orientado a pressão, observamos que promielocítica humana (HL-60) células ocluir momentaneamente a primeira constrição por um período médio de 9,3 ms antes passaging mais rapidamente através da constrição posterioríons com um tempo de trânsito médio de 4,0 ms por constrição. Por outro lado, todo-trans-retinóico tratadas com ácido (tipo neutrófilos) células HL-60 ocluir a primeira constrição para apenas 4,3 ms antes passaging através das constrições subsequentes com um tempo de trânsito mediana de 3,3 ms. Este método pode fornecer insights sobre a natureza viscoelástica de células e, finalmente, revelar as origens moleculares desse comportamento.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alterações na forma de células são críticas em muitos contextos biológicos. Por exemplo, hemácias e leucócitos deformar através dos capilares, que são menores do que seu próprio diâmetro 1. Em metástase, as células cancerosas deve deformar-se através de aberturas estreitas intersticiais, bem como vasos tortuosos e redes linfáticos para semear em sites secundários 2. Para investigar o comportamento físico das células individuais, dispositivos microfluídicos apresentar uma plataforma ideal que pode ser personalizado para estudar uma série de comportamentos de células, incluindo a sua capacidade de migrar através de aberturas estreitas 3 e deformar passivamente através constrições em escala mícron 3- 9. PDMS (polidimetilsiloxano) dispositivos microfluídicos são opticamente transparentes, permitindo deformações celulares para ser visualizado através de microscopia de luz e analisados ​​utilizando ferramentas básicas de processamento de imagem. Além disso, as matrizes de constrições pode ser definido com precisão, permitindo a análise de várias células simultaneamente com umrendimento que excede muitas técnicas existentes 10,11.

Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para deformabilidade celular usando o dispositivo micro 'celular Deformer' PDMS sondagem. O dispositivo é projetado de modo que as células passagem por constrições seqüenciais; esta geometria é comum em contextos fisiológicos, tais como o leito capilar pulmonar 12. Para medir a capacidade de deformação das células, tempo de trânsito fornece uma métrica conveniente que seja facilmente medido, como o tempo necessário para uma célula individual de trânsito através de uma única 4,6 constrição. Para manter uma queda de pressão constante através dos canais de constrição durante o trânsito celular, usamos o fluxo orientado a pressão. Nosso protocolo inclui instruções detalhadas sobre o desenho e fabricação do dispositivo, a operação do dispositivo accionado por pressão de fluxo, e a preparação de células de imagiologia, assim como o processamento de imagens para medir o tempo para as células para se deformar através de uma série de constrições. Nós incluímosambos os projetos de dispositivos e código de processamento de dados como arquivos de visão suplementar. Como um exemplo representativo de dados, que mostra o tempo de trânsito das células através de uma série de constrições como uma função do número de constrições subculturas. Análise da escala de tempo para que as células de trânsito que constrições estreitas de um dispositivo de microfluidos pode revelar as diferenças na capacidade de deformação de uma variedade de tipos de células 4,5,13. O dispositivo demonstrado aqui examina exclusivamente trânsito célula através de uma série de constrições escala mícron; este projeto emula o caminho tortuoso que as células experiência em circulação e também permite sondar características físicas adicionais de células, tais como tempo de relaxamento.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Microfluidic Dispositivo Projeto

NOTA: O projeto do dispositivo tem quatro regiões funcionais básicos: porta de entrada, filtro celular, matriz constrição, e porta de saída (Figura 1). A concepção geral pode ser aplicada a uma grande variedade de tipos de células, com ajustamentos menores dimensões. Desde que aqui estão algumas recomendações de projeto básico, juntamente com os parâmetros do dispositivo que são eficazes para a seleção de ambas as células primárias e imortalizadas.

  1. Seleccione a largura dos canais de constrição da matriz (Figura 1B) ser de aproximadamente 30-50% do diâmetro médio de célula; esta constrição-célula de tamanho resultados em relação deformação celular significativa, mas o entupimento mínima. Dado um tipo de célula que não tenha sido previamente testado, é prudente para projetar uma variedade de larguras de constrição de ~ 30-50% do diâmetro celular para encontrar a largura ideal. Tal como acontece com muitos tipos de dispositivos microfluídicos, mais de 120 moldes de mestre do dispositivo pode ser modelado em um pecadogle bolacha de silício de 4 polegadas, permitindo uma variedade de diferentes modelos de dispositivos de ser fabricado num processo de fabricação.
  2. Seleccione a altura do canal de ser, pelo menos, 50% do diâmetro da célula; isto assegura a célula está confinada em duas dimensões. Para evitar o colapso do canal durante a ligação, certifique-se que a relação de aspecto de canal nada menos que 1:10 é (altura: largura) em todo o dispositivo. Para os canais que devem ultrapassar esta relação de aspecto, adicionar mensagens de apoio para evitar o colapso. Mensagens de apoio Espaço, a uma distância que é pelo menos duas vezes o diâmetro da célula, para não impedir o fluxo de células.
  3. Incluir um filtro para as portas de entrada para remover detritos e desagregar grupos de células (Figura 1B). Ajustar o tamanho e espaçamento das mensagens de filtro de modo a que a distância que separa os dois postes é aproximadamente igual a um diâmetro da célula.
    NOTA: O limite inferior de tamanho recurso é definido pela resolução com que a máscara de litografia é impresso. Certifique-se que todos os recursos estão dentro dos resolução limite especificado pelo fornecedor máscara.

2. Suprimentos e Preparação

NOTA: Antes de iniciar qualquer experimento, os seguintes itens devem estar preparados. Um esquemática de toda a configuração é dado na Figura 1.

  1. Fabricar o mestre dispositivo utilizando técnicas padrão para micromachining litográfica 14,15. Verificar a altura das características padronizadas utilizando um perfilómetro.
    NOTA: Enquanto mestres podem ser facilmente fabricado em uma instalação de sala limpa, alguns laboratórios desenvolveram métodos de litografia de baixo custo para uso em um ambiente semi-limpo 16,17.
  2. Prepare a fonte de ar de fluxo accionado por pressão, utilizando um tanque de ar comprimido e a sequência de reguladores de ar e acessórios (Figura 1A).
    1. Configurar um tanque de alimentação de ar e regulador manual.
      Observação: Uma composição de 5% de CO 2 em ar mantém um ambiente semelhante como uma cultura de células incubato típicor, mas outras misturas de gases que pode também ser utilizado.
    2. Configure um regulador de pressão controlada eletronicamente em linha com o regulador manual. Use um conversor eletro-pneumático para regular e manter uma queda de pressão estável ao longo dos canais, com flutuações de pressão de menos de 2 kPa. Use o código simples escrito em LabVIEW (Informações Complementares) para introduzir a pressão desejada.
      NOTA: O conversor electro-pneumático usa um ciclo de feedback interno para regular a pressão de saída da válvula, para corresponder à pressão indicada através do dispositivo de microfluidos.
    3. Configurar uma câmara pressurizada para dirigir o fluxo da suspensão de células. Montar uma câmara de suspensão de células de citómetro de fluxo padrão de um tubo e uma tampa maquinada que cria uma vedação estanque à pressão sobre o tubo.
      NOTA: A tampa da câmara de pressão contém dois orifícios: uma entrada que liga o reservatório de ar comprimido e uma saída através da qual as células de fluxo a partir da câmara sob pressão no interior do dispositivo (Figure 2).
  3. Configure um microscópio invertido equipado com uma câmara que tem uma taxa de aquisição de pelo menos 100 frames por segundo para capturar imagens das células que fluem através da matriz constrição. Interface com a câmera com uma placa de captura de vídeo e um computador.
  4. Prepara-se uma solução do tensioactivo de 10% w / w de Pluronic F-127 em tampão fosfato salino (PBS) como a adição de uma pequena quantidade de solução de F127 para o meio celular vai ajudar a minimizar a adesão das células às paredes PDMS. Para preparar a solução de F127, vortex e aquece-se suavemente a 37 ° C para dissolver o F127. Antes do uso, passar a solução através de um filtro de seringa de 0,2 um e armazenar à temperatura ambiente. Preparar a solução de tensoactivo antes de vórtice e filtragem irá gerar bolhas que persistem durante mais de 24 horas.

3. fabricação de dispositivos microfluídicos

  1. Fabricar bloco de PDMS com canais microfluídicos.
    1. Mix PDMS completamente umta proporção de 1:10 (w / w) do agente de cura à base.
    2. Despeje a mistura sobre o mestre dispositivo (Passo 2.1). Degas em uma redoma de vidro com vácuo aplicado até que as bolhas aprisionadas desaparecer, ou por cerca de 10-20 min.
      Nota: Após este tempo, podem ainda existir bolhas na interface ar-PDMS, o que é normal; estes normalmente dissipar durante o cozimento. É mais importante para garantir que não existem remanescentes bolhas adjacentes aos canais.
    3. Coza no dispositivo desgaseificada a 65 ° C durante 4 h. Para evitar que os canais entre em colapso, o dispositivo de cozer durante a noite para reticular mais os PDMS para um dispositivo com um maior módulo de elasticidade que é mais resistente ao colapso do canal. No entanto, nota que se estendeu de cozimento também embrittles os PDMS e pode levar a fissuras quando perfurando (Passo 3.3).
  2. Remover dispositivos microfluídicos do molde mestre. Corte dispositivos microfluídicos individuais fora do bloco de PDMS com uma lâmina de barbear e remover o dispositivo do mastroer. Comece tirando delicadamente um canto do dispositivo; descamação lento e suave, ao contrário de levantamento do bloco de PDMS para cima, reduz a tensão em ambos os PDMS e o mestre.
  3. Faça furos no dispositivo de PDMS para criar portas de conexão para acesso entre a tubulação e microcanais. Criar buracos usando um punção de biópsia e perfurar a partir do lado do canal através do lado exterior do dispositivo.
    NOTA: A biópsia por punção com diâmetro 0,75 milímetros cria buracos que a interface perfeitamente com polieteretercetona (PEEK) tubulação (diâmetro externo = 1/32 "ou 0,79 milímetros) ou tubos de polietileno (PE-20, diâmetro externo = 0,043" ou 1,09 milímetros ). Use um anel de luz para ajudar a visualizar buracos em dispositivos com canais rasos 18. Certifique-se o punção biópsia é nítida; após o uso repetido de ponta embota eo soco biópsia deve ser descartado e substituído.
  4. Lavar o dispositivo PDMS com isopropanol (grau HPLC) para remover a poeira e nela pedaços de PDMS. Verifique se ofuros são livre de detritos, direcionando um fluxo constante de isopropanol puro a partir de um frasco de pressão através dos orifícios. Seque com ar filtrado. Após a limpeza, coloque os blocos de PDMS com canais enfrentam-se em uma placa de Petri limpa para manter a limpeza do dispositivo. Se necessário, dispositivos de armazenamento de desta forma até que a ligação.
  5. Limpe o substrato de vidro por lavagem com metanol (grau HPLC), seque com ar filtrado, e coloque em um 200 ° C fogão para 5-10 min para garantir o copo está completamente limpo e seco antes do tratamento de plasma.
    NOTA: O substrato de vidro forma o fundo de cada canal. Tipicamente, uma lâmina de vidro é suficiente, uma vez que uma objectiva 10X ou 20X é ideal para imagiologia de múltiplos canais em paralelo. Para uma maior resolução de imagem, ligar o dispositivo a uma lamela (# 1.5 espessura).
  6. Ligar o dispositivo de PDMS ao substrato de vidro.
    1. Plasma de oxigénio tratar lado do canal do bloco de PDMS e um lado de uma lâmina de vidro.
      NOTA: Wom uma unidade de descarga de mão, utilizar um tempo de tratamento de 1 minuto, mas optimizar o tempo de tratamento para cada aparelho de plasma de oxigénio.
    2. Coloque o lado do canal do PDMS no topo do lado tratado do vidro imediatamente após o tratamento.
    3. Segure com uma leve pressão para ~ 10 segundos para promover a ligação. Asse todo o dispositivo a uma temperatura elevada (60-80 ° C) durante pelo menos 15 minutos para melhorar a força de ligação.

4. Deformação células através de canais constrição

  1. Inspeccionar o dispositivo de microfluidos sob um microscópio. Certifique-se de que os canais não são recolhidos ou quebrado e que ambos os orifícios de entrada e de saída, ligar diretamente para os canais de dispositivo usando uma objectiva de baixa potência (10x). Designar dispositivos defeituosos, marcando a superfície do PDMS com uma lâmina de barbear e não usá-los para experiências.
  2. Preparar as amostras de cultura de células a ser ensaiadas. Células de cultura, usando condições padrão.
    1. Fou exemplo, cultura de células HL-60 em meio RPMI-1640 suplementado com solução de penicilina-estreptomicina a 1% e 10% de soro fetal bovino em 5% de CO2 numa estufa a 37 ° C.
    2. Para as células aderentes, colhê-los por tripsinização e ressuspender em meio de crescimento fresco. Use um protocolo de tripsinização padrão; por exemplo, adicionar ~ 0,5 ml de tripsina a um frasco de 25 cm 2, a área de cultura, e ressuspender em ~ 30 mL de meio fresco. Diferenciar células HL-60 em células do tipo de neutrófilos pelo ácido all-trans retinóico (ATRA), a uma concentração final de 5 mM por 1 x 10 5 células / ml como previamente descrito 19,20.
    3. Centrifugar as células a 300 xg durante 3 minutos, cuidadosamente aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com a densidade final adequada em meio de cultura fresco com 0,1% v / v de F-127.
  3. Contar as células usando um contador Coulter, hemocitômetro, ou citometria de fluxo. Ajustar a suspensão de células para uma densidade de 1 × 10 6 a 5 X 10 6 células / ml. Uma vez que a densidade da suspensão é ajustado, aproximadamente, com suplemento de 0,1% v / v de F-127.
    NOTA: A densidade celular e a concentração de surfactante podem precisar de ser modificado em função dos sistemas de células específicas; Tabela 1 fornece um registo de concentrações usadas anteriormente e de células F-127 para os diferentes tipos de células.
  4. Coloque suspensão de células em um citômetro de fluxo tubo e conectar-se à tampa de pressão. Antes de ligar a tubagem para o dispositivo de microfluidos, ajustar a pressão para cerca de 14-21 kPa e lavar a suspensão de células até que emerge a partir da ponta do tubo. Isso vai ajudar a minimizar bolhas de ar na tubulação e dispositivo.
  5. Inserir a extremidade do tubo contendo a suspensão de células para dentro da entrada do dispositivo. Se o dispositivo estiver ligado a uma lamela, colocar o dispositivo sobre uma superfície plana, sólida, tal como a platina do microscópio antes de ligar a tubagem; a lamela é frágil e pode quebrar o contrário.
  6. Coloque um pedaço de tubo into orifício de saída e encaminhá-lo para um tubo vazio para a recolha de resíduos, tal como um tubo Falcon de vazio para o lado gravado de platina do microscópio. Para consistência na resistência fluídica global do dispositivo entre experiências, assegurar que o tubo de entrada e saída são do mesmo diâmetro e, aproximadamente, o mesmo comprimento para cada experimento.
  7. Suavemente rampa até a pressão a cerca de 28 kPa ou até que as células fluem através dos canais. Posicionar o dispositivo de modo que os múltiplos canais está no campo de visão e são perpendiculares à parte inferior do ecrã. Se a câmera é limitada pelo tamanho dos dados, adquirir vários vídeos para gerar um número suficiente de pontos de dados independentes. Ajuste a taxa necessária para a saída de dados desejado quadro. Para capturar mudanças na forma celular, use alta velocidade de imagens em 300 frames por segundo (fps); para medir o tempo de passagem de células, use as taxas de frame de aproximadamente 100 fps.

Análise de Dados 5.

  1. Abra o arquivo de mastroer_script.m (Downloadable Arquivo Suplementar) e execute o programa.
  2. Selecione o primeiro vídeo a ser analisado a partir da janela do Windows Explorer que aparece. Especifique a taxa de quadros para o vídeo selecionado e pressione enter.
    NOTA: A figura aparecerá solicitando que o usuário selecione uma janela de recorte retangular para o primeiro vídeo.
  3. Escolher a uma janela que engloba todos os canais da esquerda para a direita e intersecta os canais imediatamente acima da primeira lâmpada da matriz de canais, na parte superior e na parte inferior (figura 3).
  4. Selecione as regiões de constrição da imagem recortada. Preste atenção especial para manter uma distância de pixel fixo entre a parte superior e inferior fronteira janela para cada vídeo selecionado.
    NOTA: A borda superior da janela especifica a constrição de nível superior ea borda inferior da janela especifica a constrição na extremidade inferior (Figura 4); constrições intermédias são aproximadas a partir desta entrada do usuário. Em seguida, o algoritmo mostra as segmentation das células para os primeiros 50 quadros de vídeo cada (Figura 5).
  5. Monitorar a imagem da parte superior esquerda (Figura 5A) perto para determinar se o algoritmo for exacta localização de células; uma imagem binarizada é sobreposto sobre o video fonte para demonstrar a localização das células identificadas.
    NOTA: As diferentes janelas, (Figuras 5B-5D) são para o diagnóstico de código e demonstrar os quadros de vídeo após as operações de processamento de imagem específicos.
  6. Selecione o próximo vídeo a ser processado a partir da janela do Windows Explorer.
    NOTA: O algoritmo irá repetir os passos de 5,2-5,5 para cada vídeo selecionado.
  7. Selecione cancelar uma vez todos os vídeos desejados foram adicionadas através da janela do Windows Explorer para instruir a função que a lista de vídeo está completa.
    NOTA: O algoritmo irá executar as operações restantes, sem intervenção do usuário. Isso levará cerca de 1-2 horas, dependendo do número de vídeos processados ​​e pe computadorrformance. Após a conclusão, o algoritmo irá produzir um histograma dos dados de tempo de trânsito e salvar os dados no diretório como um arquivo .mat MATLAB e um arquivo xls Microsoft Excel.

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Results

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Para investigar a capacidade de deformação dos diferentes tipos de células, as células de leucemia mielóide humana (HL-60), as células diferenciadas de neutrófilos, linfócitos, células de rato e de linhas de células de cancro humano do ovário (OVCAR8, HEYA8) são avaliadas utilizando a técnica de microfluidos 'celular Deformer'. Os resultados representativos para o tempo de trânsito das células HL-60 e do tipo de neutrófilos células HL-60 mostra a escala de tempo para uma única célula de trânsito através de uma série de ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós fornecemos um procedimento experimental abrangente para analisar a deformação das células que transitam através dos canais microfluídicos constricted usando fluxo orientado a pressão. Um script MATLAB permite o processamento automático de dados (Material complementar); uma versão atualizada do código é mantida ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Mais amplamente, as técnicas aqui apresentadas podem ser adaptadas em muitos ensaios microfluídicos basea...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer Lloyd Ung para entrada construtiva nas primeiras versões dessa técnica, o Dr. Jeremy Agresti para dicas de design da tampa de pressão, e Dr. Dongping Qi por sua ajuda na fabricação da tampa de pressão. Somos gratos aos laboratórios de M. Teitell e P. Gunaratne para fornecer uma variedade de amostras de células para testes. Somos gratos à Fundação Nacional de Ciências (Prémio Carreira DBI-1254185), o Comprehensive Cancer Center da UCLA Jonsson, ea UCLA Clinical and Translational Science Institute para apoiar este trabalho.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Surfactante de Copolímero em Bloco Pluronic F-127 Fisher Scientific 8409400Produzido pela BASF, também disponível através da base Sigma
PDMS e reticuladorEssex BrownellDC-184-1.1Produto comumente chamado de Sylgard 184 Elastômero
Unidade de descarga de plasma de oxigênioEnerconDyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0,75 mm)Ted Pella, Inc.15072
Virola Fingertight, 1/32"Upchurch ScientificUP-F-113
Conexão Fingertight III, 10-32Upchurch ScientificUP-F-300X
Tubulação de polieteretercetona (PEEK), diâmetro externo = 1/32"ou 0.79 mmTubulação deTPK.515-25M
, 0.043" ou 1.09 mmBecton Dickinson427406
Regulador de pressãoTubo de poliuretano Airgas ou Praxair
, 5/32" ODMcMaster Carr5648K284
Conexões Push-to-connectMcMaster Carr5111K91
Conversor Eletropneumático de Tensão para Pressão (E/P)OmegaIP413-020
16 bits, 250 kS/S, 80 Entradas Analógicas DAQ MultifuncionalNational InstrumentsNI PCI 6225-779295-01
Terminal de Parafuso de Bloco de Conector AnalógicoNational InstrumentsSCB-68-776844-01
Software de Projeto de Sistema LabViewMATLAB da National Instruments
The MathWorks, Inc.O código MATLAB R2012arequer o cabo blindado da caixa de ferramentas de processamento de imagem
National InstrumentsSHC68-68
polietileno (PE-20) Valco Software

References

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