Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e Ex vivo Os fibroblastos

Resumo

Perfil molecular de células de laser e microdissecados do estroma, modelos de cancro colorectal sintéticos engenharia de tecidos representa uma abordagem nova e manipulável para caracterizar e dissecar a biologia distinta na interface entre as células tumorais na frente invasiva e células estromais de cancro associado.

Resumo

Invadir o câncer colorretal células (CRC) adquiriram a capacidade de se libertar de suas células-irmãs, infiltrar o estroma, e remodelar a matriz extracelular (ECM). Caracterizando a biologia desse grupo fenotipicamente distintos de células pode melhorar substancialmente a nossa compreensão dos eventos iniciais durante a cascata metastática.

A invasão tumoral é um processo dinâmico, facilitado pela interacção bidireccional entre epitélio maligno e o estroma cancro associado. A fim de analisar as respostas específicas de células no interface estroma do tumor que se combinaram organotípicas de co-cultura e as técnicas de micro-dissecção de laser.

Modelos organotípicas, em que constituintes do estroma-chave, tais como fibroblastos são 3-dimentioanally co-cultivados com células epiteliais cancerosas, são ferramentas experimentais altamente manipuláveis ​​que permitem invasão e interações câncer-estroma a serem estudados em quase phcondições ysiological.

Laser microdissection (LMD) é uma técnica que implica a dissecção cirúrgica e extração de vários estratos dentro do tecido do tumor, com nível de precisão mícron.

Ao combinar estas técnicas com perfil genômico, transcriptomic e epigenética pretendemos desenvolver uma compreensão mais profunda das características moleculares de invadir as células do tumor e tecido circundante do estroma, e ao fazê-lo, potencialmente revelar novos biomarcadores e oportunidades para o desenvolvimento de drogas no CRC.

Introdução

Organotípicas co-culturas são modelos que ajudam na reconstrução do microambiente do tumor in vivo em 3-dimensões justapondo células epiteliais malignas e as células do estroma em um gel de colágeno contendo essenciais componentes da matriz extracelular ^1-3 engenharia de tecidos. Principalmente concebido como um método de medir a invasão do tumor, organotypics reduzir a dependência em modelos animais in vivo, e evitar os problemas de outras técnicas in vitro tais como ensaios de Transwell, em que as células invasoras são forçados artificialmente em um estado de dispersão ^mono-2-4. A inclusão de células estromais nestes modelos, tais como fibroblastos, reflecte o papel fundamental do microambiente do tumor na regulação da invasão maligna e metástase ^3-4, no entanto, a heterogeneidade fenotipica do estroma é de tal modo que, a fim de maximizar a relevância fisiológica de organotípicas modelos, específica do órgão, anatomicamente precisos ex vivofibroblastos devem ser incluídos na medida do possível ^3,6.

Organotypics são uma plataforma versátil para estudar as interações entre células tumorais e estromais e são cada vez mais utilizados em novas maneiras de examinar o impacto sobre a invasão do tumor de inibidores químicos e alterações no gene alvo ^7,8. Estudar a margem de tumor invasivo é uma perspectiva particularmente emocionante. Em modelos organotípicas, cancro colorectal estabelecido (CRC) linhas celulares produzem tipicamente uma camada epitelial bem estratificada, e em secção transversal, as células que adquiriram a capacidade de invasão da matriz extracelular (ECM) são facilmente discerníveis. À luz da heterogeneidade de micro-topográfico estabelecido de tumor e do tumor associado células estromais in vivo, extraindo estas células utilizando microdissecção laser e estudá-los de forma isolada, pode revelar percepções biológicas importantes sobre a origem da metástase do cancro colo-rectal e de como ela pode ser mais eficiente segmentado. Eun a seguinte metodologia, todos os pacientes que doaram amostras de tecido prestados consentimento informado, eo estudo foi aprovado pelo comitê de ética das instituições regionais de pesquisa.

Protocolo

1. Estabelecimento de culturas primárias de fibroblastos de cólon explantes

1. Obtenção de amostras de tecido de mucosa de cólon normal humano directamente a partir da sala de operações cirúrgicas, e suspender em 7-10 ml de PBS suplementado com 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,25 ng / mL de Fungizone.
2. No laboratório, colocar a amostra no centro de um 10 cm de prato de cultura de tecidos e lava-se 3 vezes com PBS / Pen-strep / Fungizone. Não aspirar após a lavagem final.
3. Com fórceps estéreis e bisturi, cortar o tecido em pequenos pedaços (cerca de 2 mm) e colocar cada peça no centro de uma cruz desenhada com a lâmina de bisturi em uma placa de 12 poços. Balance o bisturi suavemente sobre o tecido para permitir que ele aderir.
4. Cultura das amostras em 750 ul de meio de crescimento de fibroblastos básico (DMEM suplementado com 20% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 292 ng / ml de L-glutamina), que deve submerge o tecido sem permitir que flutue. Evite perturbar a placa ao longo dos próximos 5 dias, exceto para re-alimentação a cada 2 dias.
5. Ao longo dos 5 dias seguintes fibroblastos começam a crescer lentamente para fora a partir da borda do tecido. Em cerca de sete dias, este será mais visível. Após cerca de 3-4 semanas, e se existem suficientes fibroblastos crescem para fora, adicionar 750 ul de tripsina a cada poço. Depois de células têm destacado (o que pode demorar 5-10 min), piscina e transferir para um frasco de cultura de tecidos T-25.

2. Organotípicas Preparação

Preparação do fibroblasto impregnado em gel organotípica:

1. Prepara-se uma suspensão de células de fibroblasto, contendo 5 x 10 ⁵ células por organotípicas em DMEM suplementado com FCS a 10% e 292 ug / ml de L-Glutamina.
2. Completar os géis organotípicas no gelo, nas seguintes proporções:
   • 7 volumes de Rat-Tail Colágeno: Matrigel mistura (1:1)
   • 1 volume de filtrado 10x DMEM
   • 1 volume de FCS
   • Um volume de suspensão de células de fibroblasto, contendo 5 x 10 ⁵ fibroblastos
     Para 9 géis (1 ml por gel) preparar 10 ml e misture com cuidado para evitar bolhas.
3. Adicionar 1 ml a cada poço de uma placa de 24 poços e incubar durante 1 hora a 37 ° C em uma atmosfera húmida para permitir que os geles para definir. Depois de 1 hora adicionar 1 mL de DMEM (FCS a 10%) / Glut no topo dos géis e retornar para a incubadora durante a noite.
4. No dia seguinte, o meio aspirado a partir do topo do gel e da placa 1 ml de meio contendo 5 x 10 ⁵ células epiteliais CRC.

Preparação de folhas de nylon revestido de gel:

5. Prepare-se estéril, folhas de nylon autoclavados medindo 1,5 cm x 1,5 cm, com antecedência.
6. Utilizando fórceps estéreis, colocar o número requerido de folhas de nylon em uma placa de cultura de 10 centímetros (geralmente quatro folhas de nylon podem ser acomodados por prato).
7. Make up gel no gelo na seguinte ordem (250 mL total devolume é necessário por folha de nylon):
   • 7 volumes de Rat-Tail Colágeno
   • 1 volume de filtrado 10x DMEM
   • 1 volume de FCS
   • 1 volume de DMEM 10% de FCS / Glut
8. Se a solução é amarela, neutralizar por adição de 0,1 M de NaOH em 50 mL alíquotas até a solução torna-se rosa.
9. Adicionar 250 ul desta solução para cada uma das folhas de nylon e incubar a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO ₂ durante 30 min para permitir que o gel para definir.
10. Perfazer solução de glutaraldeído a 1% em PBS. Adicionam-se 10 ml a cada 10 centímetros placa de cultura, uma vez que o gel se definir e incubar a 4 ° C durante 1 hora.
11. Folhas de nylon de lavagem 3x em PBS 1x e em DMEM (FCS a 10%) / Glu e incubar durante a noite em DMEM / Glu a 4 ° C.

Levantando géis organotípicas para grades de aço para invasão:

12. Pré-preparar grades andaimes dobrando chapas de aço inoxidável em uma formação tripé. Autoclave antes do uso.
13. Use uma pinça esterilizada em etanol para colocar uma grade de aço em cada poço de uma placa de seis bem.
14. Colocar uma folha de nylon revestido com gel de colagénio com o lado superior, em cada grelha.
15. Transferir cuidadosamente os géis organotípicas da placa de 24 cavidades para a folha de nylon levantadas usando uma espátula esterilizada em etanol.
16. Encher o poço de DMEM com 10% de FCS / Glut suplementado com FCS a 10% até que a folha de nylon está em contacto com o suporte, mas não submersa. Certifique-se que o meio não toca o gel organotípica.
17. Incubar durante 14 dias a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO _2, substituindo mídia a cada 2 dias.

3. Organotípicas Fixation

1. Remover todo organotípica incluindo folha de nylon bem e coloque em película aderente.
2. Bisseccione organotípica e folha de nylon com um bisturi descartável limpo e corrigir as duas metades em formol por 24 horas à temperatura ambiente.
3. Substitua formaldeído com 70% ethanol depois de 24 horas e deixe durante a noite antes da inclusão em parafina, corte e coloração.

4. Laser Microdissecção da margem invasiva

1. Secção de 10 um de espessura para uma membrana de lâminas montado.
2. Retire a parafina seções aplicando xileno por 1 min, em seguida, retire xileno e corrigir em etanol 75% por mais 1 min.
3. Remover etanol e mancha com 0,125% solução Cresyl Violeta por 1 min. Cresyl Violeta destaca células epiteliais e permite fácil discriminação do estroma.
4. Retirar violeta de cresilo e aplicar etanol a 100% durante mais 1 min antes da lavagem com etanol a 100%. Deixar as lâminas de ar seco por 30 min.
5. Conduzir microdissecção a laser usando plataforma escolhida (por exemplo, o sistema Leica AS).
6. Coloque a lâmina de vidro com a parte manchada para ser microdissectados a face para baixo no palco microscópio.
7. Montar um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml na cassete de recolha e adicionar 50 ul detampão de lise celular (por exemplo, DNA, RNA ou proteína de tampão de lise) na tampa na qual o tecido microdissecção irá recolher.
8. Sob visão direta, utilize o joystick para identificar tecido de interesse, e usando a interface do software, anotar a seção de produtos orgânicos manchado, com destaque para as células a serem microdissectados na frente de invasão tumoral.
9. Instrua o laser para o fogo, que deve tanto cortar a seção de destaque e impulsionar o tecido microdissecção na tampa do tubo de microcentrífuga.
10. Uma vez que o material tenha sido recolhida suficiente, ejectar a cassete de recolha, a fechar o tubo de microcentrífuga e girar suavemente para desenhar o tampão de lise para o fundo do tubo.
11. Coloque as amostras em gelo até microdissection está completa. Processe as amostras por um método adequado para extrair a substância a analisar de interesse.

Resultados

Temos aplicado o método de cima para várias combinações de linhas celulares de CRC e células estromais. Um exemplo apresentado aqui é linhagens de células SW480 epitelial CRC com ex vivo fibroblastos humanos primários do cólon. 3-dimensional co-culturas são construídas (Figura 1), e submetido a microscopia de captura laser de microdissecção (Figura 2), e analisados ​​por microRNA (miRNA) perfis (Figura 3) para a comparação destes pequenos RNAs de expressão dife...

Discussão

Aqui nós descrevemos um método para isolar e caracterizar especificamente as células tumorais que tenham adquirido a capacidade de invadir o estroma associado câncer durante os primeiros estágios da progressão metastática em um 3-dimensional construção de co-cultura de células epiteliais e estromais.

Modelos de co-cultura composto por células epiteliais CRC justapostos com um estroma sintético contendo ex vivo fibroblastos cólon humanos foram usados ​​para estudar a invasão CRC em 3...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linhas celulares de câncer colorretal - exemplo mostrado SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Colágeno	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Membrana de nylon	Merck Millipore	VVLP01300
Grade de metal	The Mesh Company	WSS20-A4
themeshcompany.com Laser plataforma de microdissecação	Leica Microsystems	Leica AS LMD
Lâminas montadas em membrana	Dispositivos
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025