Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Os fibroblastos

Resumo

Perfil molecular de células de laser e microdissecados do estroma, modelos de cancro colorectal sintéticos engenharia de tecidos representa uma abordagem nova e manipulável para caracterizar e dissecar a biologia distinta na interface entre as células tumorais na frente invasiva e células estromais de cancro associado.

Resumo

Invadir o câncer colorretal células (CRC) adquiriram a capacidade de se libertar de suas células-irmãs, infiltrar o estroma, e remodelar a matriz extracelular (ECM). Caracterizando a biologia desse grupo fenotipicamente distintos de células pode melhorar substancialmente a nossa compreensão dos eventos iniciais durante a cascata metastática.

A invasão tumoral é um processo dinâmico, facilitado pela interacção bidireccional entre epitélio maligno e o estroma cancro associado. A fim de analisar as respostas específicas de células no interface estroma do tumor que se combinaram organotípicas de co-cultura e as técnicas de micro-dissecção de laser.

Modelos organotípicas, em que constituintes do estroma-chave, tais como fibroblastos são 3-dimentioanally co-cultivados com células epiteliais cancerosas, são ferramentas experimentais altamente manipuláveis ​​que permitem invasão e interações câncer-estroma a serem estudados em quase phcondições ysiological.

Laser microdissection (LMD) é uma técnica que implica a dissecção cirúrgica e extração de vários estratos dentro do tecido do tumor, com nível de precisão mícron.

Ao combinar estas técnicas com perfil genômico, transcriptomic e epigenética pretendemos desenvolver uma compreensão mais profunda das características moleculares de invadir as células do tumor e tecido circundante do estroma, e ao fazê-lo, potencialmente revelar novos biomarcadores e oportunidades para o desenvolvimento de drogas no CRC.

Introdução

Organotípicas co-culturas são modelos que ajudam na reconstrução do microambiente do tumor in vivo em 3-dimensões justapondo células epiteliais malignas e as células do estroma em um gel de colágeno contendo essenciais componentes da matriz extracelular ^1-3 engenharia de tecidos. Principalmente concebido como um método de medir a invasão do tumor, organotypics reduzir a dependência em modelos animais in vivo, e evitar os problemas de outras técnicas in vitro tais como ensaios de Transwell, em que as células invasoras são forçados artificialmente em um estado de dispersão ^mono-2-4. A inclusão de células estromais nestes....

Protocolo

1. Estabelecimento de culturas primárias de fibroblastos de cólon explantes

1. Obtenção de amostras de tecido de mucosa de cólon normal humano directamente a partir da sala de operações cirúrgicas, e suspender em 7-10 ml de PBS suplementado com 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,25 ng / mL de Fungizone.
2. No laboratório, colocar a amostra no centro de um 10 cm de prato de cultura de tecidos e lava-se 3 vezes com PBS / Pen-strep / Fungizone. Não aspirar após a lavagem final.
3. Com fórceps estéreis e bisturi, cortar o tecido em pequenos pedaços (cerca de 2 mm) e colocar cada peça no centro de uma cruz desenhada c....

Resultados

Temos aplicado o método de cima para várias combinações de linhas celulares de CRC e células estromais. Um exemplo apresentado aqui é linhagens de células SW480 epitelial CRC com ex vivo fibroblastos humanos primários do cólon. 3-dimensional co-culturas são construídas (Figura 1), e submetido a microscopia de captura laser de microdissecção (Figura 2), e analisados ​​por microRNA (miRNA) perfis (Figura 3) para a comparação destes pequenos RNAs de expressão dife.......

Discussão

Aqui nós descrevemos um método para isolar e caracterizar especificamente as células tumorais que tenham adquirido a capacidade de invadir o estroma associado câncer durante os primeiros estágios da progressão metastática em um 3-dimensional construção de co-cultura de células epiteliais e estromais.

Modelos de co-cultura composto por células epiteliais CRC justapostos com um estroma sintético contendo ex vivo fibroblastos cólon humanos foram usados ​​para estudar a invasão CRC em 3.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linhas celulares de câncer colorretal - exemplo mostrado SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Colágeno	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Membrana de nylon	Merck Millipore	VVLP01300
Grade de metal	The Mesh Company	WSS20-A4
themeshcompany.com Laser plataforma de microdissecação	Leica Microsystems	Leica AS LMD
Lâminas montadas em membrana	Dispositivos
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025

moleculares