Artigo de método

Avaliação da função vascular em pacientes com doença renal crônica

DOI:

10.3791/51478

⸱

16 de junho de 2014

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1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

Neste artigo

Resumo

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O grau de disfunção vascular e contribuindo mecanismos fisiológicos podem ser avaliados em pacientes com doença renal crônica através da medição do fluxo-mediada dilatação da artéria braquial, a velocidade da onda de pulso da aorta, e expressão da proteína de célula endotelial vascular.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pacientes com doença renal crônica (DRC) tem aumentado significativamente o risco de doença cardiovascular (DCV) em comparação com a população em geral, e isso é apenas parcialmente explicada por fatores de risco para DCV tradicionais. A disfunção vascular é um importante fator de risco não-tradicional, caracterizada por disfunção endotelial vascular (mais comumente avaliadas como deficientes endotélio-dependente dilatação [EDD]) e enrijecimento das grandes artérias elásticas. Embora existam várias técnicas para avaliar EDD e rigidez artéria elástica grande, o são mais comumente usado dilatação fluxo-mediada da artéria braquial (FMD BA) e velocidade da onda de pulso da aorta (aPWV), respectivamente. Ambas as medidas não invasivas de disfunção vascular são preditores independentes de eventos cardiovasculares futuros em pacientes com e sem doença renal. Os pacientes com DRC demonstrar tanto prejudicada FMD BA, e aumentou aPWV. Embora os mecanismos exatos pelos quais a disfunção vascular desenLops na DRC são completamente compreendidos, aumento do estresse oxidativo e conseqüente redução de óxido nítrico (NO) biodisponibilidade são importantes contribuintes. Alterações celulares no stress oxidativo pode ser avaliada através da recolha de células endoteliais vasculares a partir da veia antecubital e medição da expressão de marcadores de proteína de stress oxidativo por imunofluorescência. Nós fornecemos aqui uma discussão destes métodos para medir a febre aftosa BA, aPWV e expressão da proteína de célula endotelial vascular.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A doença renal crônica (DRC) é um importante problema de saúde pública que atinge proporções epidêmicas, afetando ~ 11,5% da população nos Estados Unidos sozinho 1. O risco de morte cardiovascular ou um evento cardiovascular em pacientes com doença renal crônica é significativamente maior em comparação com a população em geral 2-4. Embora os pacientes com DRC apresentam uma alta prevalência de fatores de risco cardiovascular tradicionais, isso só explica parte do seu aumento da incidência de doenças cardiovasculares (DCV) 5. A disfunção vascular é um importante fator de risco cardiovascular não tradicional ganhando crescente reconhecimento no campo da nefrologia 6-9.

Enquanto muitas mudanças provavelmente contribuem para o desenvolvimento de disfunção arterial, entre aqueles de maior preocupação é o desenvolvimento de disfunção endotelial vascular, mais comumente avaliado como auditivos dilatação dependente do endotélio (EDD), e endurecimento da large artérias elásticas 10. Existem várias técnicas para avaliar EDD e rigidez artéria elástica grande, mas o mais comumente utilizados são a dilatação da artéria braquial mediada pelo fluxo FMD BA e velocidade da onda de pulso da aorta (aPWV), respectivamente. Outra técnica comumente usada para avaliar EDD está medindo antebraço resposta do fluxo sanguíneo para agentes farmacológicos tais como a acetilcolina, utilizando oclusão venosa pletismografia 11,12. No entanto, esta metodologia requer cateterização da artéria braquial, que é mais invasivo do que a febre aftosa BA e pode ser contra-indicado em pacientes com DRC. Uma técnica alternativa para avaliar a rigidez arterial é medir a complacência arterial local (o inverso da rigidez) da artéria carótida, embora isso não seja tão amplamente utilizado ou validado com desfechos clínicos como aPWV 13.

Os pacientes com DRC demonstrar tanto prejudicada FMD BA 14-16 e aumento da velocidade da onda de pulso da aorta-aPWV 13,17,18, mesmo antes de precisar de diálise. É importante do ponto de vista clínico, essas duas medidas não invasivas de disfunção vascular são preditores independentes de eventos cardiovasculares e mortalidade, tanto em pacientes com DRC 19-21, bem como em outras populações 22-26. Estas técnicas podem ser aplicadas ao estudo de várias populações de risco de DCV, incluindo pacientes com DRC.

Os mecanismos exatos pelos quais a disfunção arterial desenvolve na DRC são completamente compreendida; No entanto, o óxido nítrico reduzida (NO) a biodisponibilidade é um contribuinte crítico 27-30 e um mecanismo comum de ambos auditivos EDD e aumento da rigidez arterial 10,31. Em DRC, estresse oxidativo é aumentada e contribui para a redução da biodisponibilidade 32-34. O estresse oxidativo é definido como biodisponibilidade excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) em relação às defesas antioxidantes. Estímulos fisiológicos, including sinalização inflamatória, promover sistemas de enzimas oxidantes para produzir ROS, incluindo ânion superóxido (O 2 ● -) (por exemplo, a enzima oxidante NADPH oxidase.) 35. A produção de superóxido leva a um reduz a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO).

Prejudicada biodisponibilidade por sua vez pode contribuir para o desenvolvimento da DRC, como a disfunção endotelial é um preditor independente de CKD incidente 36. Isto é consistente com os dados de animal, indicando que a inibição da eNOS induz hipertensão (sistêmica e glomerular), isquemia glomerular, glomeruloesclerose, e túbulo-intersticial lesão 37. De fato, redução da biodisponibilidade parece ser necessário para o desenvolvimento e progressão da doença renal experimental que imita a doença humana, sugerindo um papel fundamental para a disfunção endotelial em CKD humano 38,39.

Os marcadores de estresse oxidativo vascular pode ser avaliada em vascular células endoteliais coletadas de sujeitos da pesquisa, usando uma técnica originalmente desenvolvida por Colombo et al. 40 e modificado Seals et al 41-43. Usando 2 estéreis J-fios, as células são recolhidas a partir da veia antecubital, recuperadas, fixadas e depois positivamente identificado como as células endoteliais e analisados ​​para a expressão de proteínas de interesse utilizando a imunofluorescência.

Nós fornecemos aqui uma discussão sobre essa metodologia que pode ser utilizada para a) medida FMD BA; b) medir aPWV; c) medir a expressão de proteínas da célula endotelial vascular de marcadores de estresse oxidativo. O foco está em pacientes com DRC, não necessitando de diálise crônica.

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Protocolo

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Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional Múltipla Colorado (COMIRB).

1. Preparação para a sessão de testes

  1. Os participantes devem seguir estas restrições para medições mais precisas: 12 hr rápido de alimentos e cafeína, 12 hr contenção de exercício, 12 hr restrição de fumar, se,> 4 contenção meia-vida aplicável a partir de medicamentos, se possível (pode não ser viável em um população, tais como pacientes com DRC), e as mulheres na pré-menopausa deve ser testada em dias 1-7 do ciclo menstrual para minimizar influências hormonais.
  2. Preparar 500 ml do tampão de dissociação por adição de 2 ml de 0,5 M ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,05 g de heparina (180 unidades USP / mg), e 2,5 g de albumina de soro bovino a 476,8 ml de tampão fosfato salino (PBS) a pH de 7,4. Este pode ser armazenado a 4 ° C durante vários meses.
  3. Ligue ultra-som, computador, ea hemodinâmica não-invasivaWorkstation (NIHem, equipamentos de rigidez arterial). Conecte os cabos a saída de ultra-som para a caixa de gatilho a onda R computador.

2. Coleta e Processamento de células do endotélio vascular

  1. Uma enfermeira ou médico treinado realiza a coleta (passos 2,2-2,5, 2,7) e pesquisador coleta e processa os fios (passos 2.6, 2,8-2,19)
  2. Prepare o site antecubital com um anti-séptico tópico, aplicar um torniquete, localizar veia e canular com um 18 G cateter. Coloque um adaptador heplock no final da IV.
  3. Calçar luvas estéreis e colocar cortinas fenestrados estéreis sobre o site.
  4. Coloque 2 J-fios nas cortinas. Puxar o arco do "J" para desenrolar o "J" forma de dois fios.
  5. Destampar o heplock e alimentar J-fio na veia com aproximadamente 8 cm. Empurre para trás e para a frente várias vezes antes de retirar o fio. Evite sangue bruto no fio.
  6. Use o alicate para cortar os fios para que eles se encaixam em umTubo de 50 ml contendo ~ 30 mL de tampão de dissociação
  7. Repita o passo 2.5 para segundo fio.
  8. Repita o passo 2.6 para segundo fio. Retornar tubo para laboratório molhado.
  9. Apertar os fios com um par de pinças e segurar os fios no interior do tubo, mas por cima da solução. Por 10 minutos, use uma pipeta motorizada para coletar várias vezes o buffer de dissociação do tubo de 50 ml e liberá-lo para que ele corre para baixo do comprimento dos fios para enxaguar e vibrar os fios, em seguida, sacudi o excesso de fluido dos fios para dentro do tubo.
  10. Centrifugar durante 7 minutos a 400 xg e 4 ° C.
  11. Prepare a solução de formaldeído em papel alumínio coberto tubo através da combinação de 100 ml de solução de formaldeído + 900 ml de PBS.
  12. Lentamente remova o tubo de centrífuga, ligar a bomba de vácuo, coloque uma ponteira na extremidade do tubo de sucção e deixar ~ 400 ml no tubo, limpando fora o resto, sem perturbar o sedimento.
  13. Cubra com papel alumínio e pipeta solução de formaldeído 1 ml emo tubo para fixar a amostra. Não ressuspender. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  14. Prepare 8 lâminas por meio de rotulagem com o assunto e informações visita de estudo e elaboração de um oval em cada slide com uma caneta pap.
  15. Adicionar 15 ml de PBS, ressuspender, e centrifuga-se durante 5 min a 400 xg e 4 ° C.
  16. Repita o passo 2.15, adicione 12 ml de PBS, ressuspender, e centrifugar por 6 min a 400 xg e 4 ° C.
  17. Lentamente remova o tubo de centrífuga, ligar a bomba de vácuo, coloque uma ponteira na extremidade do tubo de sucção e deixar ~ 2 ml no tubo, limpando fora o resto, sem perturbar o sedimento.
  18. Ressuspender e pipeta uniformemente entre as 8 lâminas nas áreas ovais.
  19. Coloque em estufa a 37 ° C durante 5 horas e, em seguida, armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para análise (amostras estará bem por muitos anos).

3. Avaliação da febre aftosa BA e aPWV

  1. Tenha investigação mudança assunto em calções descartáveis ​​e têm him / sua supina mentira em um, não ofuscante, clima controlado sala silenciosa.
  2. Coloque o número apropriado de ECG para o ultra-som específico e dispositivo de rigidez arterial (este procedimento usa o não-invasiva hemodinâmica Workstation [NIHem] para medir a rigidez arterial, que requer 4 eletrodos) e manguito de pressão arterial no assunto.
  3. Após 20 min, começam as leituras de pressão sanguínea. Realizar pelo menos 3, e repetir até que as medições estão dentro de 5 mmHg, descansando 2 minutos entre cada leitura.
  4. Comece tonometria pela palpação do pulso da artéria braquial e colocar o tonômetro de gravar formas de onda braquial usando o programa de software.
  5. Repita o procedimento para as artérias radiais, femorais e carótidas.
  6. Meça a distância de cada um desses sites de entalhe supersternal usando uma fita métrica (braquial, radial e carótida) e governante custom / paquímetro (femoral).
  7. Calcule carótida-braquial, carótida-radial e carotídeo-femoral (aPWV), utilizando o programa de software.
  8. Lugarantebraço manguito de pressão sanguínea apenas distal ao olécrano e registro de pelo menos 10 ciclos cardíacos de imagens de ultrassom da artéria braquial de base e medições da velocidade do fluxo sanguíneo, com um software vascular definir o modo para disparar. Um braço mecânico pode ser utilizado para segurar a sonda de ultra-sons, se desejado.
  9. Inflar antebraço manguito de pressão arterial a 250 mmHg e começar timer. Instrua participante a permanecer muito quieto.
  10. Comece a velocidades de gravação com um conjunto de software vascular modo para acionar quando o cronômetro lê 4:45. Desencadear a liberação do manguito às 5:00 e mudar o ultra-som para gravar imagens em modo B (diâmetro) quando o relógio lê 05:10.
  11. Continuar a gravar até que o relógio lê 07:00.
  12. Grave pelo menos 10 ciclos cardíacos de imagens de ultrassom da artéria braquial de base com um software vascular definir o modo de desencadear.
  13. Tire a pressão arterial do sujeito. Se a pressão arterial sistólica> 100 mmHg, coloque 0,4 mg de nitroglicerina sublingual sob o assunto e# 39; s língua e começar timer, a menos que o paciente tem outra contraindicação.
  14. Começar a gravar B-mode (imagens de diâmetro), quando o relógio lê 03:00 com o software vascular definir o modo de desencadear.
  15. Parar a gravação quando o relógio lê 08:00.
  16. Monitor de pressão arterial até que ele retorne à linha de base

4. Preparando Human Umbilical Vein células endoteliais (HUVEC) Controle de Slides

  1. Crescer HUVECs a passagem 5-6 e ~ 80% de confluência.
  2. Tripsinizar com 3 ml de tripsina ou o que for necessário para o prato / balão.
  3. Neutraliza-se a tripsina utilizando um volume igual de solução de tripsina de neutralização.
  4. Centrifugar a 200 xg durante ~ 5 min e remover a tripsina e solução neutralizante por vácuo.
  5. Ressuspender em ~ 10 ml de PBS para lavagem.
  6. Centrifugar a 200 xg ~ 5 min. Remover PBS.
  7. Remover PBS e corrigir em 1800 mL PBS + 200 mL de formaldeído.
  8. Ressuspender em PBS (~ 10 ml).
  9. Centrifugar a 200 xg ~5 min. Remover PBS, ressuspender em um volume adequado para adicionar ~ 200 mL por slide.
  10. Armazenar slides em -80 ° C até que esteja pronto para análise (amostras estará bem por muitos anos).

5. Coloração das células endoteliais vasculares

  1. Tome lâminas de -80 ° C freezer e espere 5 minutos à temperatura ambiente (este procedimento é para um lote de 10 slides, incluindo um controle HUVEC slide).
  2. Limpe o excesso de água com uma tarefa delicada limpar (não toque centro de slide).
  3. Re-hidratar os slides adicionando alterado PBS a cada slide e deixá-los por 10 min.
  4. Enquanto os slides estão de pé, preparar 5% de soro de burro e outras soluções.
    1. Prepare 5% de soro de burro pela adição de 300 ml de soro burro para 5.700 l de alteração PBS (a um pH de 7,4) para até 10 lâminas (aumentar essa quantidade para mais).
    2. Dilui-se o anticorpo primário de interesse em 1000 ul de 5% de soro. Por exemplo, nitrotirosina e NADPHoxidase (1:300 e 1:1.500) poderiam ser utilizados como marcadores de estresse oxidativo.
    3. Prepare AF568 secundário diluindo 5 ul de AF568 a 1.500 μll de 5% de soro.
    4. Prepare caderina VE diluindo 2 ul de caderina VE de 1000 ul de 5% de soro.
    5. Prepare AF488 diluindo 5 ul de caderina VE de 1000 ul de 5% de soro.
    6. Mantenha AF568, VE caderina e AF488 em folha através de todo o processo e, em seguida, colocar no balancim em 4 ° C geladeira enquanto prepara slides.
  5. Após 10 min de reidratação, lâminas secas com uma tarefa delicada wipe.
  6. Adicionam-se 5% de soro de burro, durante 60 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico.
  7. Descarte o filme plástico e parafina lâminas secas com uma tarefa delicada wipe. Não lavar. Adicionar anticorpo primário durante 60 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurara cobertura completa do produto químico.
  8. Descarte o filme parafina plástico, lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho e mergulhar em colunas de slides para 5 min. Enquanto as lâminas são de imersão, movê-los em uma sala escura. Trabalhar no escuro para todas as etapas restantes.
  9. Lâminas secas com Kimwipes, adicionar AF568 (anticorpo secundário), durante 45 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. Cubra da luz.
  10. Descarte o filme parafina plástico no recipiente de resíduos de risco biológico. Lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho, e em seguida, mergulhe em colunas por 5 min.
  11. Lâminas secas com Kimwipes, em seguida, adicioná-caderina VE durante 60 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. Cubra da luz.
  12. Descarte o filme parafina plástico no recipiente de resíduos de risco biológico. Lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho, e em seguida, mergulhe em colunas por 5 min.
  13. Lâminas secos comuma tarefa delicada limpar, adicionar AF488 durante 30 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. Cubra da luz.
  14. Descarte o filme parafina plástico no recipiente de resíduos de risco biológico. Lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho, e em seguida, mergulhe em colunas por 5 min.
  15. Lâminas secos com uma tarefa delicada limpar e deixar as lâminas para secar por 20 min. Cubra da luz.
  16. Adicione uma gota só de fluoroshield meio de montagem com 4 ', cloridrato de 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) para cada slide e cubra cada um com uma lamela.
  17. Colocar as lâminas em 4 ° C geladeira coberto com papel alumínio. Imagem deve ser concluído no prazo de 48 horas.

6. Imaging and Analysis of Vascular células endoteliais

  1. Prepare microscópio para a imagem células endoteliais coradas de acordo com especificações do microscópio específico. Um único técnico cego deve analisar qualquer proteína particular para um morcegoch de células.
  2. Digitalizar slides de forma sistemática. Identificar as células endoteliais por coloração positiva para o VE caderina e confirmar a integridade nuclear por coloração positiva para DAPI.
  3. Imagem 30 células por lâmina para análise posterior. Repita o procedimento para cada slide no lote manchado, incluindo a HUVEC.
  4. Analisar a intensidade da coloração do anticorpo primário de interesse usando um software de qualidade.
  5. Para minimizar o possível efeito de confusão de diferenças de intensidade de coloração entre diferentes sessões de coloração, os valores do relatório como razão da expressão da proteína nas células endoteliais recolhidos para o mesmo a expressão da proteína em HUVEC.

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Resultados

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FMD BA é quantificada como a variação de pico no diâmetro da artéria braquial seguinte hiperemia reactiva. Assim, o diâmetro em repouso é comparado com o diâmetro após o final de um período de 5 min manga de pressão arterial de oclusão (Figura 1). O painel A mostra uma imagem representativa de ultra-som da artéria braquial e Painel B mostra um gráfico da onda R mudança fechado em diâmetro de liberação do manguito de 2 min seguinte, obtida através de software disponível comercialmente. Como a ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obtenção de resultados precisos para a febre aftosa BA e aPWV requer a aquisição de imagens de ultra-som de alta qualidade e formas de onda de pressão, respectivamente. Central para isso é formação adequada e contínua ea utilização de cada técnica pelo operador 44. Além disso, é fundamental para controlar o maior número de variáveis ​​externas que possam influenciar os resultados como possível padronizar a sessão de testes (por exemplo, antes de 12 horas rápido, clima controlado quarto,

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a Nina Bispham por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (12POST11920023), eo NIH (K23DK088833, K23DK087859).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
J-wireSt. Jude4045842 por coleção
Shorts descartáveis (MediShorts)Quick Medical4507
Estação de trabalho hemodinâmica não invasiva (NIHem)Engenharia Cardiovascualr N/AInclui régua personalizada.  Um sistema alternativo é o Sphygmocor
UltrasoundGEModelo: Vivid7 DimensionUsamos um G.E., mas existem muitas empresas e modelos
Software vascular (Gerador de Imagens Vasculares) Aplicações de Imagens MédicasN/A
Caixa de gatilho R-waveAplicações de Imagens MédicasN/ASistema de
Inflação Rápida de ManguitoHokansonModelo: Hokanson E20
Manguito de pressão arterial no antebraçoHokansonN/Abexiga personalizada com bexiga de 6,5 x 34 cm 
HUVECsInvitrogrenC-015-5C
Soro de burroJackson017-000-121
Caneta de PapanicolauResearch Products International195505
VE CadherinAbcamab33168
AF568Life TechnologiesA11011depende das especificações do microscpe 
AF488Life TechnologiesA11034depende das especificações do microscpe 
Anticorpo nitrotirosinaAbcamab7048
NADPH oxidaseanticorpo Upstate07-001
DAPI VectorH-1200
Limpeza de tarefas delicadas (Kimwipe) Fisher Scientific06-666-A
Filme de parafina de plástico (parafilme) Fisher Scientific13-374-10
 OlympusModelo: FV1000 FCS/RICSexistem muitas opções 
Microscópio confocal

Referências

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