Este artigo em vídeo descreve um método in vitro modificado para examinar o papel dos hormônios, citocinas e/ou fatores de crescimento na condução da invasão de células cancerígenas.
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Artigo de método
A modificação
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O soro sangüíneo serve como um chemoattractant para o qual as células cancerosas migrar e invadir, facilitando a sua intravasation em microvasos. No entanto, as moléculas de reais para o qual as células migram permanecem ainda desconhecidos. Este ensaio de invasão modificado tem sido desenvolvido para identificar alvos que conduzem a migração celular e invasão. Esta técnica compara o índice de invasão sob três condições para determinar se uma hormona específica, o factor de crescimento ou citoquina desempenha um papel na mediação do potencial invasivo de uma célula de cancro. Estas condições incluem i) soro de bovino fetal normal (FBS), ii) separado com carvão activado FBS (CS-FBS), que remove as hormonas, factores de crescimento e citoquinas e iii) CS-FBS + molécula (designada por "X"). Uma alteração significativa na invasão de células com CS-FBS em comparação com FBS, indica o envolvimento de hormonas, citoquinas ou factores de crescimento na mediação da mudança. Moléculas individuais podem então ser adicionado de volta ao CS-FBS para testar a sua capacidade de reverso ou resgatar o fenótipo invasão. Além disso, dois ou mais factores podem ser combinados para avaliar o efeito aditivo ou sinérgico de múltiplas moléculas de condução ou inibir a invasão. Em geral, este método permite ao investigador para determinar se hormonas, citoquinas, e / ou os factores de crescimento desempenham um papel na invasão de células por servir como quimioatractores ou inibidores de invasão para um tipo particular de célula de cancro ou um mutante específico. Através da identificação de agentes quimioatractivos e inibidores específicos, este ensaio de invasão modificado pode ajudar a elucidar as vias de sinalização que dirigem a invasão de células de cancro.
Introdução
Um ensaio de invasão novo foi desenvolvido com o objectivo de identificar o envolvimento de hormonas específicas, citoquinas e / ou factores de crescimento como quimioatractores na invasão de células de cancro. A capacidade de células tumorais para invadir através da matriz extracelular (ECM) é uma característica marcante do fenótipo metastático 1-3. Invasão câmaras têm sido amplamente utilizados como ferramentas in vitro para estudar a invasão de células do cancro e da migração e pode proporcionar conhecimento sobre os mecanismos de invasão de tumores in vivo e metástase. As câmaras consistem em pastilhas cilíndricas de cultura de células aninhados dentro dos poços de placas de cultura de células. As partes inferiores das inserções são semi-permeáveis de poliestireno ou de policarbonato de tamanho de poro das membranas definidos.
No ensaio de invasão padrão, as células são semeadas sobre a membrana de inserção com meio isento de soro e colocadas em poços de cultura de células que são preenchidos com quimioatractores soro ou soro semelhante a set-se uma força quimioatratante. Isto dirige as células de força para mover através da membrana semi-permeável (migração) ou, em alternativa, através de um revestimento de matriz extracelular (invasão), que pode, então, ser marcadas utilizando corantes convencionais para detectar e quantificar o número de células. O número de células é então normalizados de acordo com a extensão da migração e invasão em uma linha de células não-invasiva. Este método permite que um investigador para avaliar o potencial invasivo de diferentes tipos de células sob uma variedade de condições, incluindo as manipulações genéticas.
Hormonas, citocinas e factores de crescimento são componentes críticos de soro e estão cada vez mais a ser mostrado para ser associado com a condução do fenótipo invasivo 4. No entanto, a natureza, função e especificidade destas moléculas de soro quimioatratantes na mediação invasão ainda permanecem ainda desconhecidos. O desafio continua a determinar os fatores específicos em chemoattractants soro ou soro-like são responsáveis pela conduçãoinvasão de células de cancro, bem como as moléculas que podem inibir o processo de invasão. Neste relatório, nós descrevemos uma metodologia para avaliar o potencial envolvimento de hormônios, citocinas e / ou fatores de crescimento presentes no soro, como moléculas de condução quimioatração e invasão das células cancerosas.
Neste protocolo modificado proposto, carvão remoção é utilizado para remover hormonas, citocinas e factores de crescimento a partir de 2% de soro fetal bovino (FBS) para gerar 2% de carvão despojado de FBS (CS-FBS). Ambos 2% de FBS e 2% de CS-FBS são utilizados como agentes para ajustar-se a força quimioatratante para conduzir a invasão de células do cancro. Utilizando a 2% de CS-FBS como um agente quimioatratante em comparação com o normal 2% de FBS proporciona vários benefícios, incluindo em primeiro lugar, e mais importante ainda, a possibilidade de estudar o fenótipo de invasão do cancro no reduzido / relativa ausência de hormonas, citoquinas e factores de crescimento. Ele também permite que o investigador para avaliar se a remoção coletiva de hormônios, fatores de crescimento, e cytokines provoca um aumento ou uma diminuição no índice invasivo. O ensaio é concebido para, em seguida, determinar se a adição de um componente individual, designada como "X" pode inibir, aumento, diminuição, ou restaurar o índice invasivo para o seu valor original (ver Figuras 2 e 3). Embora esta metodologia é específico para alcançar os níveis fisiológicos de o componente que é removido a partir do soro durante a remoção do carvão vegetal, deve também notar-se que o carvão de decapagem pode também afectar vias de transdução de sinal. Por exemplo, foi relatado que o carvão de decapagem pode diminuir a actividade da fosfatase alcalina de células osteoprogenitoras e induzem adipogénese por meio de redução de activadores MAPK 5. Meios de carvão despojado estão disponíveis comercialmente e são baseados no protocolo delineado que combina com carvão dextrano e incubadas com soro fetal bovino O / N 6.
Este ensaio foi desenvolvido em respoNSE a um resultado relatado por Zucker et al. 7 Os autores demonstraram que um fenótipo mutante afetando a comunicação junção gap demonstrou um aumento no índice de invasão ao migrar em direção a mídia com o normal FBS 2%. Este aumento foi eliminado, com a substituição do soro separado com carvão activado. A partir deste resultado, os autores concluíram que essa migração afetados mutante em direção a uma molécula lipofílica (mais especificamente, um hormônio, fator de crescimento, ou citocina) 7. É bem conhecido que as hormonas, factores de crescimento e citoquinas medeiam a sinalização de vias envolvidas na promoção de tumores e invasão 4. Assim, é importante para os investigadores científicos para determinar o factor de (s) a conduzir à invasão tumoral das suas células cancerosas particulares ou mutantes sob estudo. O ensaio é concebido para tratar o papel de componentes individuais na sua concentração fisiológica conforme determinado de acordo com a diferença entre a concentração do componente &# 8220; X "em SBF normal e o CS-FBS. Através do desenvolvimento deste ensaio, os investigadores podem ter mais conhecimento da via invasiva específica que regule seu sistema.
As hormonas, factores de crescimento e citocinas têm sido muitas vezes classificadas como promotores de tumor 8. Alguns destes factores tais como EGF são usados como fontes directas para quimioatractores em câmaras de invasão 9. Assim, parece provável que estes representam os principais componentes do soro que a invasão tumoral direta. Este protocolo propõe um método simples, mas significativa, a modificação do ensaio de invasão in vitro convencional, que permite que um investigador para avaliar o envolvimento das hormonas, factores de crescimento, citocinas e na mediação do potencial invasivo das células cancerosas. No entanto, o ensaio é concebido para proporcionar o investigador com uma resposta quanto ao facto de o processo será eficaz para o seu estudo em um passo inicial na análise, de modo a não usar o tempo precioso e recursos se for considerado desnecessário. Este método usa CS-FBS e baseia-se na discrição investigadores como para que as moléculas de prosseguir como chumbo candidatos que potencialmente medeiam invasão da célula cancerosa. Os resultados destas análises devem provar ser úteis na identificação de componentes do soro que servem como quimioatractores ou inibidores para a linha de células particular ou mutante a ser estudada. Além disso, esta abordagem pode ajudar a identificar o investigador principais vias de sinalização ou promover ou inibir a invasão de células de cancro; assim direcionando projeto futuro de drogas.
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Protocolo
1. Prepare os diferentes meios de comunicação e componentes adicionais
- Antes de testar, preparar meio consistindo de DMEM ou outros meios especificados com a adição de ambos os normais de FBS, carvão despojado de FBS, ou carvão despojado de FBS mais o componente a ser testado. Note-se que vários componentes podem ser testados em cada experiência.
- Pesar e diluir as hormonas, factores de crescimento ou citocinas de forma adequada para ser dissolvidos no soro carvão despojado na concentração fisiológica.
2. Prepare a matriz de colágeno on Ice
- Prepare a 2 ml de colagénio I matriz de 2,2 mg / ml, adicionando as seguintes componentes filtradas estéreis em gelo: 200 ul 10x PBS (pH 7,4), 5,4 mL de NaOH 1 N, 600 uL de dupla H2O destilada e 1,2 ml de colagénio I (a 3,63 mg / ml).
- Mantenha solução de colágeno I em gelo até que esteja pronto para a chapa.
3. Prepare Plates Migração / Invasão para Ensaio
- Para cada linha celular a ser testada, utilizar uma placa da câmara de 24 poços na qual 12-poços contêm inserções. Use os mais 12 poços que não contêm inserções para adicionar a mídia quimioatractivas e transferindo as inserções para o arranjo experimental.
NOTA: A matriz de colagénio em placas com uma membrana de polietileno teraftalato (PET) e de 8 um de tamanho de poro é óptima para as linhas de células de usar aqui. No entanto, uma matriz de matrigel, em placas pré-revestidas também podem ser substituídos com a diminuição do tamanho dos poros de acordo com a linha celular a ser investigado. - Identificam a placa, usando três poços por condição a ser analisados (FBS migração, migração CS-FBS, invasão FBS, e invasão CS-FBS, bem como FBS-migração para um controle, linha de células não-invasiva). Ensaio de migração por circulação através de uma membrana de poros em PET, e invasão por ensaio de movimento através de uma matriz de colagénio ou de matrigel e, em seguida, através de poros na membrana. Use diferentes marcadores de cor para cada condição para uma célulaid no processo de revestimento.
4. Dispense a Matrix Invasion
- Cuidadosamente pipeta 75 ul da solução de matriz de colagénio nas inserções para ser utilizado para ensaios de invasão. Tenha cuidado para evitar bolhas. Dispersar as bolhas, aplicando uma ponta de pipeta invertido para a superfície.
- Transferir a placa com as inserções revestidas com colagénio a uma temperatura de 37 ° C e 5% de CO2 durante 30 min para permitir que o gel solidifique.
5. Placa as células sobre a membrana ou Invasion Matrix
- Enquanto isso, Tripsinizar as células e adicionar meios com 10% de FBS. Células giram a 200 xg por 5 min em uma centrífuga de bancada e lavar 3x em meio livre de soro.
- Ressuspender em meio livre de soro. Contagem de células com um hemocitômetro ou contador de fotos automática. Adicionar meio isento de soro para uma concentração final de 5 x 10 4 células / ml.
- Quando a matriz de colágeno tem solidificado (após 30 min), adicione 700 mL de mídia com qualquer2% de FBS ou definidos carvão despojado-FBS a cada poço. Dos 12 pastilhas por placa:
- 3 inserções têm colágeno e poços com media + 2% FBS
- 3 inserções têm colágeno e poços com media + 2% CS-FBS
- 3 inserções não têm colágeno e poços com media + 2% FBS
- 3 inserções não têm colágeno e poços com media + 2% CS-FBS
- Utilizar placas adicionais, dependendo do número de factores a ser testado e com um controlo de colagénio sem correspondente a cada condição.
- Adicionar suspensão de células para as inserções em 5 x 10 4 células / ml, chapeamento de 500 células mL por inserir em todas as inserções de migração e invasão.
- Incubar as células durante 22 h a 37 ° C.
6. quantificar o número de Migração e invadir as células
- Configure coloração de poços utilizando fixador metanol, eosina, e hemotoxilina, em poços separados.
- Use cotonetes de algodão para remover as células e matriz de cada cavidade.Rrepeat com segunda aplicação swab para cada poço.
- Com uma pinça, mergulhar cada inserção 5 vezes durante 1 segundo para cada uma das três soluções em sucessão.
- Permitir inserções para secar S / N.
- Ou i) remover filtros com um bisturi, cortando com cuidado em torno das bordas e montar em um slide com lamela e imersão em óleo, ou ii) permitir que as inserções para secar O / N invertido e usar as inserções diretamente para microscopia.
- No dia seguinte, ver slides ou inserções sob um microscópio com objetiva de 20x e levar 5 imagens de diferentes regiões do filtro. Para melhorar a consistência, tome 4 campos externos e um centro.
- Contar as células de todas as condições utilizando o software ImageJ e aplicam-se às fórmulas abaixo.
- Determinar a invasão por cento da seguinte forma:
A média de # de células invasoras através de colágeno I inserir = a
A média de # de células que migram através de inserção de controle = b
Invasão% = (a / b) * 100 - Determinar o Índice de Invasão em 2% de FBS como se segue:
% Invasão de células a ser ensaiado (em 2% de FBS) c =
% Invasão de controle de células não-invasivos em (2% FBS) = d
Índice de invasão (FBS) = (c / d) - Determinar o Índice de Invasão em 2% de CS-FBS como se segue:
% Invasão de células a ser ensaiado (em 2% de CS-FBS) = e
% Invasão de controle de células não-invasivos em (2% CS-FBS) = f
Índice de invasão (CS-FBS) = (E / F)
7. Repita protocolo experimental comparando Charcoal-despojado FBS para FBS Charcoal-despojado + X n com múltiplos fatores combinados
- Repetir o procedimento várias vezes como necessário, utilizando componentes diferentes para "X" ou uma combinação de componentes.
- Aplicar os cálculos para determinar a contribuição de cada fator "X" para os efeitos da migração e invasão.
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Resultados
O índice de invasão é calculada para cada condição de acordo com a normalização de uma linha de células não-invasiva. Para as nossas experiências, que use a linha celular de melanoma 1205Lu e variantes estabelecido linhas celulares estáveis como nossas linhas invasivos, bem como a variante não invasiva pré-malignas, WM793 a partir do qual as células foram derivadas 1205Lu 10, que serve como um controlo lógico. Nós também utilizar colagénio I, tal como a matriz de invasão porque é que o componente primário d...
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Discussão
Metástase tumoral é um processo de múltiplos passos. As células devem romper a membrana basal, em intravasate ou do sistema linfático ou microvasos sanguíneos, na qual são transportadas para locais distantes. As células tumorais e, em seguida, de extravasamento em colonizar um macrometástase 12. Progressão através do epitélio para o mesenquimal (EMT), invasão tumoral e metástase tenha sido reforçada por hormônios esteróides 13,14, fatores de crescimento de 15-18, 19-21 e citocinas. Estas...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem as fontes de financiamento da D'Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Inserções de controle BioCoat com 8.0 e micro; m Membrana PET | Corning | 354578 | 12 em cada uma das duas placas de 24 poços. PET = polietileno teraftalato |
| Colágeno I, cauda de rato | Corning | 354236 | Fonte = tendão de cauda de rato, pureza = 90% |
| Fixador; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Fixador à base de metanol, hematoxilina/eosina |
| Soro fetal bovino | Life Technologies | 16000 | Designado como FBS |
| Soro fetal bovino descascado com carvão | vegetal Life Technologies | 12676 | Designado como CS-FBS |
| Soro fetal bovino | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designado como FBS |
| Soro bovino fetal descascado | carvão vegetal Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | designado como CS-FBS |
Referências
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201(2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
