Todos os modelos de metástase espontânea do carcinoma de células renais (RCC), a progressão da doença podem ser utilizados para avaliar os tratamentos em um ambiente clinicamente relevante. Este protocolo demonstra procedimentos diferentes para a implantação de células tumorais renal ortotópico, nefrectomia adequada, e, finalmente, apresenta um guia de necropsia para avaliação visual e bioluminescente de carga metastático e localização.
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Artigo de método
Modelagem espontânea metastático carcinoma de células renais (mRCC) em ratos após nefrectomia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um dos desafios chave para melhorar o teste de novas terapias experimentais em carcinoma de células renais (CCR) é o desenvolvimento de modelos que recapitulam fielmente evolução precoce e tardia da fase da doença metastática. Modelos de implantação do tumor típicos utilizar implantação do tumor primário ectópica ou ortotópico, mas poucos incluem doença metastática espontânea sistêmica que imita o ambiente clínico. Este protocolo descreve os principais passos para desenvolver RCC progressão da doença estágios semelhantes aos pacientes. Primeiro, ela usa um mouse linha de células tumorais altamente metastático em um modelo singênico para mostrar a implantação de células tumorais ortotópico. Os métodos incluem a implantação superficial e interna para o espaço sub-capsular com células combinadas com matrigel a evitar fugas e disseminação precoce. Em seguida, ele descreve os procedimentos para a excisão do rolamento de tumor de rim (nefrectomia), com crítica cuidados pré e pós-cirúrgico mouse. Finalmente, descreve as etapas necessárias para monitorar e avaliarmicro e macro-evolução da doença metastática, incluindo a imagem de bioluminescência também fornece um guia de necropsia visual detalhada para marcar distribuição da doença sistêmica. O objetivo desta descrição protocolo é facilitar o uso generalizado de modelos RCC metastático clinicamente relevantes para melhorar o valor preditivo do futuro teste terapêutico.
Introdução
A causa principal de mortalidade em pacientes com carcinoma de células renais (RCC) é a doença metastática sistémica que ocorre normalmente depois da remoção cirúrgica de um tumor primário em crescimento nos rins. No entanto, muito poucos modelos de tumores pré-clínicos que avaliaram terapêutica experimental em ratos incluem doença metastática, e menos ainda recapitular fielmente os estágios clínicos de crescimento localizado, cirurgia e iniciação micro-metástases espontânea e progressão 1-3. Esta diferença nos testes tornou-se cada vez mais importante na avaliação de novas terapias como às vezes impressionantes efeitos anti-tumorais observados em modelos ....
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Protocolo
1. Rim ortotópico Implantação do Tumor
- Cultura de Células
- Antes da implantação ortotópico, cultivar células do rato RENCA LUC como uma monocamada a 75% de confluência.
- Seguindo tripsinização e re-suspensão em 5% de FBS contendo meio, as células de centrifugação a 1.000 rpm, 4 ° C durante 5 minutos, repetindo três vezes para lavar em PBS. Em seguida, voltar a suspender as células em meio isento de soro para uma concentração de 5 x 10 4 RENCA LUC / 5 meios livres de soro ul.
Nota: Dependendo da variante, ou linha celular utilizada, as células podem ser ressuspendidas numa proporção de matrigel e ....
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Resultados
Figura 1A mostra um esquema que define os procedimentos detalhados neste resumo protocolo. Vários fatores importantes devem ser considerados para cada etapa. Por exemplo, no Passo 1 que mostra dois métodos para a implantação de células de tumor sub-capsular para o rim. As células tumorais podem ser implantados no espaço sub-capsular com um pequeno branco-bolha confirmando a colocação localizada de células com fugas impedido por remoção cuidadosa da agulha e limpando o excesso de escape de fluidos
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Discussão
O objectivo deste protocolo é o de avaliar a doença metastática espontâneo clinicamente relevantes usando um modelo do rato tumor singênico para descrever técnicas de implantação / ressecção. Actualmente, a maioria dos estudos pré-clínicos de novas terapêuticas experimentais avaliando não incluir o estudo de doença metastática e apenas poucos recapitulam as fases de crescimento do tumor primário, a ressecção cirúrgica, e eventual metástase espontânea. Até o momento, modelos de ratos geneticamente modificados (GEMMs) ger.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Somos gratos ao laboratório do Dr. Robert S. Kerbel (University of Toronto, Instituto de Pesquisa Sunnybrook, Toronto, Canadá) para obter ajuda técnica e experiência no desenvolvimento deste processo. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Sandra Sexton eo Roswell Park Departamento de Recursos Animais de Laboratório do Instituto do Câncer. Este trabalho foi apoiado por um prêmio da Fundação Aliança Roswell Park (para JMLE).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM-glicose alta com Pyr. E L-Glutamina | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0,25% Tripsina EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS sem Cálcio & Magnésio | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | deve ser mantido no gelo |
| Lágrimas artificiais-lubrificante pomada oftálmica | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Aparador de bolso para animais de estimação | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Cotonete com álcool | VWR | 326895 | |
| Cotonete de solução Betadine | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors retos, sem corte - lâminas de 25 mm - 4.5" | Cirúrgica Southpointe | RS-5982 | |
| , serrilhada, curvada, 10 cm de comprimento | Kent scientific | INS15915 | precisa de dois desses |
| 10 µ l Seringa Hamilton | 7635-01 | ||
| 30 G, 45 graus, agulha RN | Hamilton | 7803-07 | |
| Aplicador estéril com ponta de algodão | VWR | 10805-144 | |
| Kit de cautério de alta temperatura | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 revestido Vicryl, agulha de corte convencional | Ethicon | J834 | |
| Aplicador de clipe Reflex para clipes de 7 mm | Kent scientific | INS500343 | |
| Clips Reflex, 7 mm, não estéril | Kent scientific | INS500344 | |
| Pinça de removência, 12 cm de comprimento | Kent scientific | INS500347 | |
| 0,9% Cloreto de sódio | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorfina 0,01 mg/ml | |||
| 25 G Agulha de 5/8" | VWR | BD305122 | |
| Seringa de 1 ml sem agulha | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferina | Gold Biotecnologia | LUCK-1G |
Referências
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H.
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Reimpressões e permissões
