Isotérmico medidas de calorimetria de titulação fluxo de calor liberado ou absorvido nas reações químicas. Este método pode ser usado para quantificar a enzima-catálise. Neste trabalho, o protocolo para a instalação instrumental, experiência em execução e análise de dados é geralmente descrito, e aplicada à caracterização de hidrólise enzimática de uréia por jack urease do feijão.
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Artigo de método
Hot Catálise Biológica: Calorimetria isotérmica de titulação para caracterizar reações enzimáticas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma técnica bem descrito que mede o calor liberado ou absorvido durante uma reação química, utilizando-o como uma sonda intrínseca para caracterizar praticamente todos os processos químicos. Hoje em dia, esta técnica é amplamente aplicada para determinar os parâmetros termodinâmicos de equilíbrio de ligação biomoleculares. Além disso, o ITC demonstrou ser capaz de medir directamente a cinética e os parâmetros termodinâmicos (cat K, K M, ÔH) de reacções enzimáticas, embora esta aplicação é ainda pouco explorados. Como as mudanças de calor ocorrer espontaneamente durante a catálise enzimática, a ITC não exige qualquer modificação ou rotulagem do sistema sob análise e pode ser realizada em solução. Além disso, o método tem pouca quantidade de material. Estas propriedades fazem com que uma ferramenta de valor inestimável ITC, poderosa e única para o estudo da cinética de enzimas em várias aplicações, tais como, por exemplo, a descoberta de medicamentos.
k cat e K M da hidrólise enzimática de uréia por Canavalia ensiformis (feijão de porco) urease. Cálculo da entalpia molar intrínseca (AH int) a reacção é realizada. Os valores assim obtidos são consistentes com os dados anteriores descritos na literatura, o que demonstra a fiabilidade do método.
Introdução
A determinação quantitativa de reações bioquímicas fornece insights sobre os processos biológicos a base da vida. Calorimetria oferece uma metodologia livre de etiqueta para caracterizar quantitativamente praticamente todas as reações químicas em solução. Esta técnica mede o calor libertado ou absorvido ao longo do tempo, e é, portanto, um sistema de detecção universal e uma metodologia muito conveniente para quantificar a quantidade de moléculas de reacção de ligação (ou seja, a termodinâmica), bem como para medir a velocidade da reacção (isto é, a cinética). Em particular, calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi adotado como método de escol....
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Protocolo
1. Amostras Preparar
- Prepare a 2 ml de solução de enzima, e de 0,5 ml de solução de substrato para cada ensaio experimental. Dilui-se as soluções de concentrados de enzima e substrato em soluções tampão com composição idêntica para minimizar o calor de diluição e mistura, durante a adição do substrato.
- Escolha das condições de buffer que forem adequadas para evitar alteração do pH durante o experimento. Por exemplo, HEPES 20 mM, pH 7, é adequada para medições em pH neutro.
NOTA: Se troca de prótons está envolvido, entalpias de protonação dos buffers usados devem ser considerados, porque eles afetam o AH medida da reação.....
- Escolha das condições de buffer que forem adequadas para evitar alteração do pH durante o experimento. Por exemplo, HEPES 20 mM, pH 7, é adequada para medições em pH neutro.
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Resultados
A urease (EC 3.5.1.5; ureia amidohidrolase) é uma enzima que contém níquel multisubunit encontrado em Archea, bactérias, plantas e eucariotas unicelulares. Esta proteína actua no último passo da mineralização do azoto orgânico, que catalisam a hidrólise de ureia em amónia e carbamato, o qual se decompõe espontaneamente para dar uma segunda molécula de amoníaco e bicarbonato (Equação 6) 12.
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Discussão
Significado do ITC para estudar a atividade enzimática em relação a métodos existentes
Para além das suas aplicações clássicas para estudar equilíbrio de ligação, calorimetria de titulação isotérmica oferece um método rápido e confiável para caracterizar as reacções enzimáticas em solução usando o calor de reacção como uma sonda, sem a necessidade de modificação do sistema ou rotulagem. Os parâmetros cinéticos de k cat e K M são geralm.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O fertilizante Produtos especializados Company (SFP) é reconhecida por fornecer os fundos necessários para este estudo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HEPES | Sigma | H3375 | dissolvendo-se em água e ajustando o pH com NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | dissolvendo-se em água e ajustando o pH com HCl |
| Di-hidrogenofosfato de sódio | Riedel-de-Haen | 4270 | dissolvendo-se em água |
| Fosfato de sódio dibásico | Riedel-de-Haen | 30427 | dissolvendo-se em água |
| Uréia | Sigma | U4128 | dissolvendo-se em água a 40 > Urease C |
| Canavalia ensiformis (tipo C-3) | Sigma | U0251 | dissolvendo-se em HEPES pH 7 a 20 mM e armazenada a -80 &graus; C |
| VP-ITC no instrumento Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | |
| VPViewer2000 1.30.00 no software de aquisição de dados Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | fornecido com o instrumento |
Referências
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
- Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetr....
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Reimpressões e permissões
