Artigo de método

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a In vitro Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus

DOI:

10.3791/51506

⸱

31 de agosto de 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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A patogênese do HIV-1 é definida tanto pelas características virais quanto pelos fatores genéticos do hospedeiro. Aqui descrevemos um método robusto que permite medições reprodutíveis para avaliar o impacto da variação da sequência do gene gag na capacidade de replicação in vitro do vírus.

Resumo

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O efeito protetor de muitos alelos HLA classe I na patogênese do HIV-1 e na progressão da doença é, em parte, atribuído à sua capacidade de atingir porções conservadas do genoma do HIV-1 que escapam com dificuldade. Alterações de sequência atribuídas à pressão imunológica celular surgem em todo o genoma durante a infecção e, se encontradas em regiões conservadas do genoma, como Gag, podem afetar a capacidade do vírus de se replicar in vitro. A transmissão de polimorfismos ligados ao HLA em Gag para receptores incompatíveis com HLA tem sido associada a cargas virais de ponto de ajuste reduzidas. Nossa hipótese pode ser devido a uma capacidade reduzida de replicação do vírus. Aqui apresentamos um novo método para avaliar a replicação in vitro do HIV-1 influenciada pelo gene gag isolado de pontos de tempo agudos de zambianos infectados pelo subtipo C. Este método usa clonagem baseada em enzima de restrição para inserir o gene gag em um esqueleto proviral comum do HIV-1 subtipo C, MJ4. Isso o torna mais apropriado para o estudo de sequências do subtipo C do que os métodos anteriores baseados em recombinação que avaliaram a replicação in vitro de sequências gag-pro derivadas cronicamente. No entanto, o protocolo pode ser prontamente modificado para estudos de vírus de outros subtipos. Além disso, este protocolo detalha um método robusto e reprodutível para avaliar a capacidade de replicação dos vírus quiméricos Gag-MJ4 em uma linhagem de células T baseada em CEM. Este método foi utilizado para o estudo de vírus quiméricos Gag-MJ4 derivados de 149 zambianos infectados agudamente do subtipo C e permitiu a identificação de resíduos em Gag que afetam a replicação. Mais importante, a implementação dessa técnica facilitou uma compreensão mais profunda de como a replicação viral define parâmetros da patogênese precoce do HIV-1, como carga viral de ponto de ajuste e declínio longitudinal de células T CD4 +.

Introdução

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Determinar o host e as características virais que influenciam HIV-1 patogênese e progressão da doença é fundamental para o desenho racional de vacina. A resposta imune celular é um componente chave da resposta imunitária humana a infecção por HIV-1. Os linfócitos T citotóxicos (CTL) são necessários para o controle inicial da viremia aguda, e permitir que o host para estabelecer um estado de equilíbrio (set point) da carga viral 1,2. Depleção Experimental destas células efectoras resulta na perda de controlo viral 3,4. Apesar disso, escapar mutações surgem dentro do genoma viral que subverter reconhecimento CTL de células infectadas por vírus

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Protocolo

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1 Ampliação do HIV-1 gag Gene de Infected, Congelado Plasma

  1. Extrair o RNA viral a partir de 140 ul descongeladas HIV-1 no plasma infectado usando um kit de extração.
    1. Sempre que possível, proceder imediatamente a síntese de cDNA após a extração do RNA como RNA viral unfrozen produz os melhores resultados de amplificação. Se possível, configure PCR master mix para a primeira rodada de amplificação de DNA e armazenar a 4 ° C antes da extração do RNA viral.
  2. Reverse-transcrever de cDNA a partir de RNA e amplificam produtos de ADN na primeira rodada utilizando transcriptase reversa e uma polimerase de ADN termoestável, em um....

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Resultados

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A fim de executar corretamente este protocolo, o que cria um plasmídeo proviral capaz de montar totalmente funcionais, infecciosas quimeras Gag-MJ4, deve ser tomado muito cuidado para gerar os amplicons PCR adequados. Determinar se a PCR tem gerado o amplicon mordaça de tamanho adequado é fundamental. Os produtos devem estar dentro de 100 pares de bases (pb) do fragmento amplificado de aproximadamente 1700 pb apresentado na Figura 1A. O comprimento exacto deste fragmento irão variar de acordo c.......

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Discussão

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Devido à extensão e natureza técnica deste protocolo, há várias etapas que são fundamentais tanto para a construção bem sucedida de plasmídeos quiméricos Gag-MJ4, bem como para a quantificação da capacidade de replicação viral. Embora a estratégia de clonagem baseado enzima de restrição para a introdução de genes gag estrangeira em MJ4 descritas neste protocolo tem inúmeras vantagens sobre os métodos baseados recombinação utilizados anteriormente, o protocolo pode ser tecnicamente difícil, se as etapas críticas.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Os investigadores agradecem a todos os voluntários na Zâmbia que participaram deste estudo e a todos os funcionários do Projeto de Pesquisa de HIV Zambia Emory em Lusaka que tornaram este estudo possível. Os investigadores gostariam de agradecer a Jon Allen, Smita Chavan e Mackenzie Hurlston pela assistência técnica e gerenciamento de amostras. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Mark Brockman por suas discussões e generosa doação das células GXR25.

Este estudo foi financiado pelo R01 AI64060 e R37 AI51231 (EH) e pela International AIDS Vaccine Initiative. Este trabalho foi possível em parte graças ao generoso apoio do povo americano por....

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Materiais

Reagentes de Ensaio de Quantificação de Transcriptase Reversa

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PCR Reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNACustomOligo 25 nmol, dessalinização padrão
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTCTGCTTGCCCA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Água livre de nucleaseFisherSH30538FSFabricado pela Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 Tubos de Tira, Azul (Tampa Plana)DaiggerEF3647BX
SuperScript III sistema RT-PCR de uma etapaLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA polimeraseFisherF-549L
PCR Nucleotide MistureRoche4638956001
Agarose, alta resistência em gelFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb DNA ladderFisherPRG5711Fabricado pela Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV Gel e Sistema de limpeza PCRPromegaA9282
Lâminas de barbear,Fisher12-640Fabricado pela Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Microbiology & Reagentes de clonagem
LB Agar, MillerFisherBP1425-2
LB Caldo, LennoxFisherBP1427-2
Placas de Petri de poliestireno estéreis 100 x 15 mmFisher08-757-12
Sal de ampicilina sódicaSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Tubos de polipropileno de fundo redondoBD Biosciences
Endonuclease de restrição deNew England BioLabsR0564L
Endonuclease de restrição de BclINew England BioLabsR0160L
Endonuclease de restrição de HpaINew England BioLabsR0105L
T4 DNA Ligase, 5 U/μ lCélulasRoche 10799009001
JM109, >108 cfu/μ gPromegaL2001
Sistema de minipreparação de plasmídeo PureYieldPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Transiluminador de luz azulInvitrogenG6600
Microfuge 18 centrífugaBeckman Coulter367160
Reagentes de cultura de células
Limpador / desinfetante de ampiloFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWR PAE2311Fabricado pela Promega
Brometo de hexadimetrina (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Placas Costar, 6 poços, planasFisher07-200-83Fabricadas pela Corning Life
Placas Costar, 24 poços, planasFisher07-200-84Fabricadas pela Corning Life
Placas Costar, 96 poços, redondasFisher07-200-95Fabricado pela Corning Life
Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2Fisher10-126-37
Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm2Fisher10-126-34Fabricado pela Corning Life
Conical Tubes, 50 ml, tampa azulFisher14-432-22Fabricado pela BD Biosciences
Tubos cônicos, 15 ml, tampa azulFisher14-959-70CFabricado pela BD Biosciences
Tripsina-EDTAFisherMT25052CIFabricado pela Mediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penicilina/ Estreptomicina/Glutamina, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS com magnésio e cálcio, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS sem magnésio e cálcioLife Technologies/Invitrogen20012-050
Tubos Sarstedt, cores sortidasSarstedt72.694.996
Bandejas de reservatório para Multicanal, 55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Microplaca tratada com cultura de tecidos de fundo em V transparente Corning 96 Fisher07-200-96Fabricado pela Corning Life
HEPES, solução tampão de 1 mLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, Definido, 500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941fabricado pela Promega
Glutaraldeído, Grau II, 25% em H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M Solução de cloreto de magnésioSigma-AldrichM1028-100ML
Solução de formaldeído, para biologia molecular, 36,5%Sigma-AldrichF8775-500ML
Potássio hexacianoferrato(II) trihidratadoSigma-AldrichP9387-100G
Hexacianoferrato de potássio(III)Centrífuga Sigma-AldrichP8131-100G
Allegra X15-RBeckman Coulter392932
TC10 MicroscópioBio-Rad1450001
VistaVisionVWR
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0Life Technologies/Invitrogen15568025Deve ser ajustado para pH 7.8 com KOH
2 M Cloreto de potássio (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAjustar para solução 1 M
0.5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Ácido poliadenílico (Poly rA) sal de potássio Midland Reagent Co.P-3001
Oligo d(T) primerLife Technologies/Invitrogen18418-012
Ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, Tela de Fósforo de Super Resolução, PequenoPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermowell (M) PolicarbonatoFisher07-200-245Fabricado pela Corning Life
Fita de vedação de alumínio de microplaca de 96 poços Corning, não estérilFisher07-200-684Fabricado pela Corning Life
DE-81 papel de troca aniônicaWhatman3658-915
Citrato trissódico di-hidratadoSigma-AldrichS1804-1KG
Cloreto de sódioFisherS671-3
de autorradiografiaFisherFB-CA-810
Cyclone armazenamento de tela de phoshporPackard
de um gume 352059 HpaI competentes Contador de células automatizado invertido <td colspan="4"> Modelo de placa de 96 poços

Referências

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  1. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
  2. Koup, R. A., et al.

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Etiquetas

HIV 1 Replication CapacityGag MJ4 Chimeric VirusesRestriction Enzyme CloningSubtype C HIV 1CEM Based T Cell LineRadio Labeled Reverse Transcriptase AssayViral Stock TiteringNested RT PCR AmplificationBCL One Restriction DigestionGXR25 Cell Infection

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