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Artigo de método

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a

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DOI:

10.3791/51506

⸱

31 de agosto de 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A patogênese do HIV-1 é definida tanto pelas características virais quanto pelos fatores genéticos do hospedeiro. Aqui descrevemos um método robusto que permite medições reprodutíveis para avaliar o impacto da variação da sequência do gene gag na capacidade de replicação in vitro do vírus.

Resumo

O efeito protetor de muitos alelos HLA classe I na patogênese do HIV-1 e na progressão da doença é, em parte, atribuído à sua capacidade de atingir porções conservadas do genoma do HIV-1 que escapam com dificuldade. Alterações de sequência atribuídas à pressão imunológica celular surgem em todo o genoma durante a infecção e, se encontradas em regiões conservadas do genoma, como Gag, podem afetar a capacidade do vírus de se replicar in vitro. A transmissão de polimorfismos ligados ao HLA em Gag para receptores incompatíveis com HLA tem sido associada a cargas virais de ponto de ajuste reduzidas. Nossa hipótese pode ser devido a uma capacidade reduzida de replicação do vírus. Aqui apresentamos um novo método para avaliar a replicação in vitro do HIV-1 influenciada pelo gene gag isolado de pontos de tempo agudos de zambianos infectados pelo subtipo C. Este método usa clonagem baseada em enzima de restrição para inserir o gene gag em um esqueleto proviral comum do HIV-1 subtipo C, MJ4. Isso o torna mais apropriado para o estudo de sequências do subtipo C do que os métodos anteriores baseados em recombinação que avaliaram a replicação in vitro de sequências gag-pro derivadas cronicamente. No entanto, o protocolo pode ser prontamente modificado para estudos de vírus de outros subtipos. Além disso, este protocolo detalha um método robusto e reprodutível para avaliar a capacidade de replicação dos vírus quiméricos Gag-MJ4 em uma linhagem de células T baseada em CEM. Este método foi utilizado para o estudo de vírus quiméricos Gag-MJ4 derivados de 149 zambianos infectados agudamente do subtipo C e permitiu a identificação de resíduos em Gag que afetam a replicação. Mais importante, a implementação dessa técnica facilitou uma compreensão mais profunda de como a replicação viral define parâmetros da patogênese precoce do HIV-1, como carga viral de ponto de ajuste e declínio longitudinal de células T CD4 +.

Introdução

Determinar o host e as características virais que influenciam HIV-1 patogênese e progressão da doença é fundamental para o desenho racional de vacina. A resposta imune celular é um componente chave da resposta imunitária humana a infecção por HIV-1. Os linfócitos T citotóxicos (CTL) são necessários para o controle inicial da viremia aguda, e permitir que o host para estabelecer um estado de equilíbrio (set point) da carga viral 1,2. Depleção Experimental destas células efectoras resulta na perda de controlo viral 3,4. Apesar disso, escapar mutações surgem dentro do genoma viral que subverter reconhecimento CTL de células infectadas por vírus 5-9.

Certos alelos HLA têm sido associados com baixas cargas virais e mais lenta a progressão da doença, incluindo o B * 57, B * 27, B * 81 10-15. Parte do benefício de protecção de alelos de HLA de classe I pode ser atribuída ao facto de que eles têm como alvo regiões funcionalmente restritas do genoma, tais como gage seleccionar a presença de mutações de escape que diminuem a capacidade do vírus se replicar in vitro 16-21. Apesar de fuga do sistema imune celular é benéfica para o vírus no contexto da classe I de HLA de selecção de alelos, o efeito de tais mutações podem ter consequências diferenciais para o hospedeiro durante a transmissão para um indivíduo de HLA desemparelhado 22,23. Portanto, compreender os efeitos de mutações de escape transmissíveis associadas ao HLA sobre a capacidade de replicação viral será importante para promover nossa compreensão de início de HIV-1 patogênese.

Embora muito progresso tem sido feito para identificar e caracterizar os defeitos da aptidão de mutações de escape individuais associados a HLA de classe específico I alelos 24-29, que ocorre naturalmente isolados HIV-1 têm pegadas únicas e complexas de polimorfismos HLA-associado, provavelmente decorrente do HLA pressão imune mediada de diferentes origens imunogenéticas 30. Em apanálise revious, Goepfert et al. mostraram que a acumulação de mutações associados a HLA-nas sequências derivadas de Gag transmitidos 88 zambianos agudamente infectadas foi associada com uma redução no ponto de ajuste da carga viral 31. Isto sugeriu que a transmissão de mutações de escape nocivos, especificamente em Gag, para os receptores de HLA desemparelhado fornece um benefício clínico, e pode ser atenuada devido à replicação viral. Seguindo em frente, é imperativo para estudar como as combinações de polimorfismos da mordaça complexa dentro isolados que ocorrem naturalmente trabalhar em conjunto para definir as características do vírus transmitido como a capacidade de replicação, e como replicação precoce pode por sua vez afetar HIV-1 e parâmetros clínicos em estágio final patogênese.

Brockman et al. Demonstrou pela primeira vez uma ligação entre a capacidade de replicação seqüências gag-pro do isolado durante a infecção fase crônica e carga viral, tanto subtipo C e infecções B32-35. A abordagem experimental apresentadas nesses estudos, embora adequado para analisar a capacidade de replicação in vitro de sequências derivadas de indivíduos cronicamente infectados, tem algumas ressalvas técnicas e limitações que torna o estudo HIV-1 capacidade de replicação no subtipo C indivíduos infectados de forma aguda difícil. Este método baseia-se na recombinação de seqüências de PCR amplificados com base populacional para o subtipo B NL4-3 pró-vírus, o que derivou em parte de LAV, um laboratório adaptado estoque de vírus 36. Geração de vírus foi realizada por co-transfecção de uma linha de células T baseia-CEM 37 com amplicões PCR digerido e delta-gag-pro NL4-3 ADN. Este método exige o crescimento de vírus durante um período de semanas a meses, distorcendo potencialmente, a natureza do material de vírus recuperado em relação aos quasiespie viral in vivo, e, portanto, altera a medição da capacidade de replicação in vitro. Este método ié mais adequado para o estudo indivíduos cronicamente infectadas, quando seleciona eficazmente para o vírus com a mais elevada capacidade de replicação, e onde a clonagem numerosas variantes virais diferentes a partir de um grande número de indivíduos cronicamente infectados é bastante trabalhoso e, por conseguinte, não é viável. No entanto, dentro de um indivíduo com infecção aguda, há geralmente 1-2 variantes presente e eliminando assim o risco de distorcer a natureza da ação do vírus recuperado, através in vitro pressões de seleção, permite uma avaliação mais precisa da capacidade de replicação em vitro. Em segundo lugar, este método requer sequências gag-pro subtipo C recombinação em um subtipo B espinha dorsal derivadas, e pode apresentar desvios incompatibilidade backbone para a análise. Devido a essas limitações, um grande número de sequências devem ser analisados ​​a fim de superar quaisquer potenciais vieses introduzidos.

Aqui nós descrevemos um apro experimental alternativaada apropriado para estudar as sequências derivadas do subtipo C indivíduos com infecção aguda. Nós usamos uma estratégia de clonagem com base de enzima de restrição para introduzir o gene gag derivada de pontos agudos tempo infecção de indivíduos infectados pelo HIV-1 do subtipo C no esqueleto proviral subtipo C, MJ4. O uso de MJ4 como uma espinha dorsal comum, no qual para clonar genes gag é crucial para a análise das sequências derivadas do subtipo C. MJ4 é derivado de um isolado primário 38, e, portanto, seria menos provável a introdução de viés devido ao subtipo incompatibilidade entre o backbone e gene gag. Além disso, a abordagem de clonagem de enzima à base de restrição permite a proviral constrói a ser transfectada directamente em células 293T, e para a recuperação de um estoque de vírus clonal idêntica à sequência gag clonada.

O método apresentado a seguir é um método de alto rendimento para avaliar a capacidade de replicação do subtipo C derivado Gag-MJ4vírus quiméricos. A transfecção para células 293T é simples e recuperação de vírus tem apenas três dias. Em capacidade de replicação in vitro é ensaiada na mesma linha de células T baseia-CEM CCR5 criado por Brockman et al. 37, mas usando modificações do protocolo importantes necessárias para a replicação de sucesso do subtipo C MJ4 vírus quiméricos. O uso de uma linha de células T apropriado, em vez de PBMC permite um grande número de vírus do subtipo C-MJ4 quimérica para ser testado com o ensaio de alta reprodutibilidade. Finalmente, usando um ensaio de transcriptase reversa radiomarcado para quantificação do vírus no sobrenadante é mais rentável do que usar p24 disponível comercialmente kits ELISA. Ele também dá uma maior amplitude dinâmica, o que foi importante para a detecção de ambos os vírus mal e altamente replicar dentro do mesmo ensaio e para detectar diferenças sutis na replicação entre os isolados.

Em conclusão, o método aqui apresentado tem permitidoo estudo aprofundado da capacidade de replicação das sequências derivadas de gag do HIV-1 subtipo C com infecção aguda indivíduos da Zâmbia, e como está escrito, também poderia ser expandido para estudar outro subtipo C infectados populações. Observou-se um alto grau de variação nas capacidades de replicação entre os diferentes isolados da mordaça. Além disso, fomos capazes de mostrar uma associação estatística entre a capacidade de replicação do Gag transmitida e carga viral do ponto de ajuste, bem como com CD4 + declínio ao longo de um período de três anos 39. Esses resultados destacam a importância de se estudar as características virais como transmissíveis, como a capacidade de replicação, interagir com o sistema imune do hospedeiro para influenciar patogênese durante a infecção inicial e será fundamental para o desenvolvimento de intervenções vacina eficaz, bem como o tratamento.

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Protocolo

1 Ampliação do HIV-1 gag Gene de Infected, Congelado Plasma

  1. Extrair o RNA viral a partir de 140 ul descongeladas HIV-1 no plasma infectado usando um kit de extração.
    1. Sempre que possível, proceder imediatamente a síntese de cDNA após a extração do RNA como RNA viral unfrozen produz os melhores resultados de amplificação. Se possível, configure PCR master mix para a primeira rodada de amplificação de DNA e armazenar a 4 ° C antes da extração do RNA viral.
  2. Reverse-transcrever de cDNA a partir de RNA e amplificam produtos de ADN na primeira rodada utilizando transcriptase reversa e uma polimerase de ADN termoestável, em um único passo de RT-PCR.
    1. Tome RNA de freezer -80 ° C (se o congelamento foi necessário) e brevemente descongelar à temperatura ambiente, em seguida, colocar em bloco frio. Transferência de 5 ul de ARN para cada tubo de PCR contendo 45 ul de mistura principal para dar um volume final de 50 ul. Imediatamente coloque restantes amostras de RNA em freezer -80 ° C.
    2. Depois de um enzima édded para a primeira ronda de PCR master mix (Tabela 1A), alíquota de 45 ul a cada tubo de paredes finas, a amplificação por PCR para o número de reacções desejadas. Certifique-se de usar tubos de PCR com tampas individuais e não tira as tampas para garantir a contaminação cruzada mínima entre as amostras. Inserir os tubos de PCR num bloco frio para proteger o modelo sensível à temperatura e de RNA enzima RT. Nota: As amostras devem ser executados em triplicado, a fim de provar adequadamente os quasispecies virais. Também é importante utilizar um produto com uma enzima polimerase de DNA de alta fidelidade, a fim de minimizar a incorporação errada por PCR introduzido. Por favor, consulte a lista de reagentes para o produto recomendado.
    3. Depois de molde de ARN foi adicionado a todos os tubos de ensaio, tubos de transferência de PCR para a amplificação num termociclador utilizando o programa ciclador descrita na Tabela 1B. Nota: O produto de amplificação este vai ser utilizado em uma segunda ronda de PCR aninhada.
  3. Realize um se aninhadoscond-ronda de amplificação de PCR, utilizando-se 1 ul da primeira ronda de amplificação de PCR (1,2), como o modelo de DNA.
    1. Aliquota 49 ul de segunda ronda de PCR master mix (Tabela 2A) a cada tubo de PCR de paredes finas, para a série de reacções desejadas. Transferir 1 ul da primeira ronda de PCR para a amplificação de cada tubo de reacção para se obter um volume final de 50 ul. Nota: Isto irá servir DNA como molde para a amplificação da segunda rodada. Também é importante utilizar uma polimerase de DNA com capacidades muito alta fidelidade e de revisão, a fim de minimizar a incorporação errada por PCR introduzido. Por favor, consulte a lista de reagentes para o produto recomendado.
    2. Transferir segunda rodada PCR mix reação ao termociclador e executar o programa descrito na Tabela 2B. Nota: Após a conclusão do programa, os produtos desta reacção irá ser executado em um gel de agarose para confirmar a produção de produto.
  4. Adicionar 3 ul de corante de carregamento de 5x 5 & #181; l da segunda ronda de volume de reacção de 50 ul e executar a 120 V num gel de agarose a 1%-TAE contendo um corante de ADN fluorescente à luz ultravioleta até bandas são resolvidos. Visualizar as bandas de 1,6 kb em um iluminador de luz azul (ver Figura 1A).
  5. Executar o volume de reacção de 45 ul restante num gel de agarose a 1%-TAE contendo um corante de ADN, e excisar as bandas apropriadas com uma lâmina de barbear limpa.
    1. Extrair DNA a partir da fatia de gel utilizando um kit de purificação em gel, eluição em água isenta de nuclease, combinam três reacções positivas por indivíduo, e congelar o produto a -20 ° C para uso posterior.

2. Preparando amplicons da mordaça para Clonagem de Introdução dos sítios de restrição necessários

  1. Amplificar a repetição longa terminal (LTR) / porção de 5 'UTR do plasmídeo MJ4 (ver Tabela 3).
  2. Visualize produtos 1.3 kb PCR em iluminador, impostos especiais de consumo amplicons positivos, gel purificar e congelar como anteriormentedescrito (1.4,1.5; ver Figura 1B).
  3. Criar fundido MJ4 LTR- amplicões gag através de "splicing sobreposição de extensão de" PCR (ver Tabela 4).
  4. Visualize, consumo, purificar, e congelar os amplicons 3,2 kb como em 1.4,1.5 (ver Figura 1C).

3. Clonagem Amplified mordaça genes no MJ4, o subtipo C, Clone Molecular Infecciosas

  1. Digerir 1,5 ug de MJ4 plasmídeo e 1,5 ^ g de produto purificado LTR- gag PCR com o Bell (metilação sensíveis) com endonuclease de restrição de 1,5 h a 50 ° C (ver Tabela 5A).
  2. Adicionar 1 ml de NgoMIV para a reacção de digestão e incubar a 37 ° C durante 1 hora.
  3. Adicione corante 5x a restrição digerir reações e electroforese lentamente o volume total em um gel de agarose 1%-TAE contendo uma mancha gel DNA durante 1-2 horas a 100 V. Visualize, consumo, e purificar bandas indicadas para clonagem como anteriormente described (ver Figura 2).
  4. Prepare reacções de ligação usando purificada inserção gag LTR- e DNA vetor MJ4 em um 3: 1 Insira a relação vetor. Incubar reacções de ligação durante a noite a 4 ° C (ver Tabela 5B).
  5. Transformar JM109 bactérias quimicamente competentes com produtos de ligação e espalhadas em placas de agar LB com 100 ug / ml de ampicilina e crescimento a 30 ° C durante 22 + h.
    1. Descongele JM109 células competentes no gelo por 15 min. Rotular 1,5 ml microtubos e frio no gelo.
    2. Aliquota 50-100 ul de células JM109 de pré-arrefecida de 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Adicionar 2,5-5 ul de reacção de ligação para as células JM109, sacudindo tubo levemente para misturar e devolver imediatamente em gelo. Incubar as células competentes com produto de ligação em gelo durante 30 min.
    3. O choque térmico 1,5 ml microtubos contendo células competentes JM109 e reacção de ligação C num bloco de calor a 42 ° C durante 45 seg e retornam ao gelo durante pelo menos 3 min.
    4. Adicionar 50 ul de meio SOC a cada tubo de microcentrífuga e a placa inteira para a reacção de transformação de temperatura ambiente de LB-agar suplementadas com placas de 100 ug / ml de ampicilina.
    5. Placas de transferência para um 30 ° C incubadora e deixe por 20 horas, ou até que as colônias são claramente formado.
  6. Escolha colónias isoladas e crescer em 4 ml de LB com 100 ug / ml de ampicilina a 30 ° C durante 22 + h.
  7. Girar as culturas a 3200 xg durante 15 minutos, deitar fora o caldo, e extrai-se o DNA de plasmídeo.
  8. Para confirmar a clonagem de fidelidade, cortar o ADN miniprep com NgoMIV e enzimas de restrição Hpal numa dupla digestão a 37 ° C durante 2 horas. Analise em 1% de gel de agarose-TAE (ver Tabela 5C).
  9. Sequência da região de inserção do LTR-gag de cada plasmídeo utilizando os seguintes iniciadores: GagInnerF1, GagF2, Rev. 1, rev3, e GagR6 (Tabela 6) para confirmar a identidade de sequência.
  10. Compare as sequências clonadas obtidas com as sequências população derIVED do amplicão purificada inicial de 1.5.1. Nota: É importante avaliar a capacidade de replicação em última análise, de dois clones independentes, a fim de assegurar que qualquer fenótipo de replicação in vitro não são devidos a erros de backbone introduzidas durante o processo de clonagem.

4. Geração e Titulação de replicação competentes gag-MJ4 quiméricos Vírus

  1. Gerar a replicação do vírus competente através da transfecção 1,5 pg do DNA de miniprep MJ4 plasmídeo quimérico em células 293T utilizando um proporção de 4: 1 de Fugene HD tal como descrito por Prince e ai 39.
  2. Título colhidas stocks de vírus nas células MZ-bl conforme descrito abaixo e em Prince et al 39.
    1. Placa TZM-bl as células 24 h antes da infecção com o vírus, de modo a ter uma monocamada confluente de células de 30-40% no dia seguinte. Esta geralmente pode ser conseguido através da adição de 5 x 10 4 células, num volume total de 800 ul por poço de uma placa de 24 poços.
    2. Após a adição de células ao poço, mova suavemente a placa de 24 cavidades para a frente e para trás, em seguida, para os lados, a fim de distribuir de forma eficaz as células. Nunca redemoinho - isto irá resultar em células que se acumulam no centro da placa.
    3. No dia seguinte, preparar 1% de FBS em DMEM; este vai ser utilizado para diluir o DEAE-dextrano e para diluir estoques de vírus. Banco de DEAE-dextrano é de 10 mg / ml ou de 125x, e uma concentração final de 80 ug / ml ou 1 x é desejada.
    4. Retire estoque de vírus a ser testado a partir de -80 ° C e colocar no congelador agitador descongelar à temperatura ambiente.
    5. Usando uma pipeta de canais múltiplos, serialmente dilua stocks de vírus em cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços tratados com placa de tampa. Este é um protocolo de diluição de 3 vezes. Consulte a Tabela 7 para o esquema de diluição.
    6. Remova a mídia da semeadas placas de 24 poços TZM-bl usando um aspirador a vácuo tomando cuidado para não perturbar a monocamada de células. Apenas remova a mídia de uma placa de 24 poços de cada vez para que as células fazemnão secar.
    7. Adicionar 150 ul de 1x a DEAE-dextrano + 1% de FBS em mistura de DMEM a cada poço com uma pipeta de 1000 ul. Não use repita pipeta pois isso atrapalha a monocamada.
    8. Adicionar 150 ul de cada diluição do vírus para o poço apropriado. Adicionar vírus para o centro do poço e agitar suavemente para distribuir uniformemente o vírus através da monocamada de células. Incubar as células infectadas durante 2 horas numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO 2.
    9. Após a incubação de 2 h, adicionar 0,5 ml de 10% de FBS em DMEM a cada poço e as placas retornar para uma incubadora para 48 horas adicionais.
    10. Após 48 horas, as células devem ser 100% confluente. MJ4 porque é um vírus competente para replicação, haverá alguma morte celular, mas isto é de se esperar.
    11. Remova a mídia de cada bem e adicione 400 mL / poço de solução (ver Tabela 8A para a receita) de fixação. Fixar apenas uma placa de cada vez. Adicionar solução de fixação, utilizando uma pipeta de 1000 mL, e deixar repousar durante 5 min atemperatura ambiente.
    12. Remova a solução de fixação e lavar 3x com PBS com Ca 2 + / Mg 2 +. Use uma garrafa de esguicho de adicionar suavemente PBS ao lado do poço para evitar perturbar a monocamada. Após a terceira lavagem, seque placa seca em papel absorvente.
    13. Adicionar 400 ul / poço de solução de coloração (ver Tabela 8B por receita) para cada poço da placa de 24 poços, e incuba-se a 37 ° C durante pelo menos 2 horas. Períodos de incubação mais longos são aceitáveis, mas os tempos de incubação deve ser mantido consistente entre experimentos titulação.
    14. Lavar 2x com PBS com Ca 2 + / Mg 2 + e marcar para a infecção, ou adicione PBS e armazenar a 4 ° C para a pontuação mais tarde. As placas podem ser mantidas a 4 ° C durante até quatro dias, desde que a monocamada é mantido hidratado.
    15. Para marcar a infecção, usar um marcador permanente para dividir as cavidades da placa de 24 poços em quadrantes. Contagem de todas as células azuis dentro de um campo de visão, utilizando uma ampliação total de 200x, uma vez emcada um dos quatro quadrantes de um poço.
    16. Calcule unidades infecciosas por mL, como se segue: [(# células azuis / 4) x 67] / (ul de vírus adicionado) = IU / mL. Consulte a Tabela 8C para o volume em ul de vírus a cada poço. Média de vários poços junto; Os números devem ser relativamente semelhante para uma titulação exata.

5 Preparação de Meios de Cultura e Propagação de GXR25 células in vitro Ensaio Replication

  1. Prepare RPMI completo (cRPMI) para a propagação de células GXR25. NOTA: É extremamente importante para a cultura de células GXR25 pelo menos 4 meses antes das experiências de replicação previstas (ver Tabela 9).
  2. Células divididas 1:10 duas vezes por semana e manter a densidade de células entre 1 x 05-02 outubro x 10 6 células / ml.

6. na replicação in vitro de Gag-MJ4 Quimeras em GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Células

  1. Um dia antes do infection, dividir as células a uma concentração entre 2-3 x 10 5 células / ml de modo a que eles estão em crescimento logarítmico, no dia da infecção.
  2. No dia da infecção, remover stocks de vírus a partir de -80 ° C e descongelamento congelador. Calcula-se o volume de vírus necessária de cada unidade com base no UI / mL título de ensaio de células TZM-bl, a fim de infectar 5 x 10 5 GXR25 células com uma multiplicidade de infecção de 0,05, utilizando a fórmula:
    Volume de vírus para a infecção (pi) = 1 mL / X UI x 0,05 x 500.000
    NOTA: Nós escolhemos um MOI de 0,05 como isso resulta em uma fase logarítmica de crescimento para todos os vírus que nós testamos. É importante a realização de experiências iniciais, a fim de determinar a MOI óptima para capturar o crescimento logarítmica para o vírus a ser testado.
  3. Dilui-se o vírus em cRPMI a um volume de 100 ul (de forma a alcançar uma MOI de 0,05) e adicionar a um poço de uma cultura de tecido de fundo em V de 96 poços tratados placa. Nota: Inclua um positive controlo (WT MJ4 infectada) e um negativo (células infectadas simuladas) em cada conjunto de experiências de replicação. Configure a placa de tal forma que todas as outras coluna está em branco para limitar a contaminação cruzada entre os poços. O controlo positivo é imperativo, uma vez que será mais tarde utilizada como um padrão para normalizar as pistas de replicação, os quais são uma medida da taxa de replicação de experiências em replicado.
  4. Contagem de células GXR25 utilizando um contador de células automatizado. Calcula-se o número de células necessário no total de todas as infecções (5 x 5 x 10 # infecções). Alíquota do volume necessário para um tubo de 50 ml e centrífuga para sedimentar as células. Sempre calcular para 25% mais infecções do que o necessário.
  5. Mídia Aspirar cuidadosamente e ressuspender em cRPMI a uma concentração de 5 x 10 5 células / 100 mL.
  6. Células de pipeta em uma calha estéril e misture bem. Usando uma pipeta de multi-canal, adicionar 100 ml de células em cada poço da placa de 96 poços contendo vírus diluído. Mix completamente.
  7. Adicionar 2 ml de solução de 5 mg / ml (100x) de polibreno a cada poço e as células misturar completamente.
  8. Incubar a 37 ° C na incubadora de cultura de tecido com 5% de CO 2 durante 3 h.
  9. A fim de lavar as células infectadas, centrífuga placa de 96 poços de fundo em V para sedimentar as células. Em seguida, remove cuidadosamente 150 ul do meio e substituir com 150 ul de fresco cRPMI sem perturbar o sedimento celular. Repita mais duas vezes (incluindo a centrifugação) para suficientemente lave as células.
  10. Após a última centrifugação e adição de 150 ul de cRPMI, ressuspender o sedimento de células com uma pipeta de canais múltiplos e adicionar toda a mistura de células / vírus (cerca de 200 ul) de cada poço a 800 ul independentemente de cRPMI em uma cavidade de um tecido de 24 poços placa de cultura.
  11. Colocar a placa de 5% de CO 2 de tecido de cultura incubadora a 37 ° C.
  12. A cada dois dias, remover 100 ml de sobrenadante a partir da superfície do poço de cultura e transferidos para um poço de 96 Lplaca -bottom e armazenamento congelado a -80 ° C até à execução do ensaio de quantificação do vírus. NOTA: arranjo cuidadosa do sobrenadante em placas de 96 poços irá permitir a transferência de uma pipeta multi-canal de sobrenadantes de culturas durante a quantificação por meio de um virião da transcriptase reversa (RT) de ensaio marcado radioactivamente. Cada placa deve conter amostras de um padrão de infecção, a fim de normalizar variações entre as placas no ensaio de RT de leitura.
  13. Após a remoção de cada amostra de 100 ul, células divididas 1: 2 por células completamente ressuspensão e remoção de metade do volume remanescente (450 mL). Restaurar o volume inicial (1 ml) através da adição de 550 ul de cRPMI fresco a cada poço.

7 Análise de transcriptase inversa (RT), em sobrenadantes de cultura celular

Protocolo adaptado a partir de Ostrowski et al 40.

  1. Configure capuz de segurança biológica em uma facilidade BSL-3 para uso com materiais radioativos.
    1. Coloque papel absorvente em hood e substituir aspirador para aspirador designado para uso radioativo. Nota: Todos os resíduos radioactivos devem ser eliminadas de acordo com as normas de segurança.
  2. Adicionar 1-2 ul de 10 mCi / ml de [α- 33 P] dTTP e 4 ul de 1 M de ditiotreitol (DTT) a cada alíquota de 1 ml de RT master mix (ver Tabela 10 e Ostrowski et al. 40).
  3. Misturar cuidadosamente cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de mistura principal RT, DTT, e [α- 33 P] dTTP com uma pipeta de 1000 ul e de transferência para uma calha de estéril.
  4. Distribuir 25 ul de mistura de RT marcado em cada cavidade de 96 poços de paredes finas placa de PCR. Nota: Incluir espaço para um controle positivo (infecção MJ4 WT) e controle negativo (infecção Mock).
  5. Adicionar 5 mL de cada sobrenadante para a placa de PCR contendo a mistura principal de RT.
  6. Selar placa de PCR com cobertura de folha adesiva e incuba-se durante 2 horas a 37 ° C num termociclador. Por razões de segurança, rinSE pontas de pipeta com Amphyl e dispor de dicas em pequeno recipiente contendo resíduos Amphyl, que serão posteriormente descartados em lixo radioativo.
  7. Após a incubação, fazer pequenos buracos na cobertura de folha usando uma pipeta de multi-canal de 200 ul. Nota: Se as pontas de pipeta tocar líquido no bem, troque dicas antes de passar para a próxima coluna ou linha.
  8. Mistura amostras transferência 5x e 5 ul de cada amostra para o papel de DE-81. Air secar 10 min.
  9. Blots Lavar 5X com 1x SSC (cloreto de sódio, citrato de sódio) e, em seguida 2x com etanol a 90% em 5 minutos por lavagem. Deixar secar ao ar.
    1. Colocar cada blot em um recipiente separado de lavagem, tais como uma caixa de armazenamento de sanduíche, adicionar tampão de lavagem suficiente (1x SSC ou 90% de EtOH) para cobrir blot, e agitar durante 5 min.
    2. Deitar fora tampão de lavagem em um recipiente e repita separado. Nota: Os primeiros 3 lavagens são considerados radioativo e deve ser descartado corretamente. As últimas duas lavagens podem ser eliminados regularmente.
  10. Depois de seco, o carroefully embrulhar blot em Saran e expor a um phosphoscreen numa cassete hermeticamente fechado durante a noite a temperatura ambiente.
  11. Analise phosphoscreens com um phosphorimager e quantificar transcritos radioactivas.
  12. Desenhe um círculo em torno de cada sinal radioativo usando software OptiQuant. Gráfico dos valores unitários de luz Digital (DLU) para gerar curvas de replicação.
  13. A fim de gerar escores de capacidade de replicação, os valores de log 10 DLU foram -transformed e pistas foram calculados usando o dia 2, 4, e 6 pontos de tempo. Encostas de replicação são então dividido pela inclinação da WT MJ4 a fim gerar escores de capacidade de replicação. É importante para normalizar os valores com base em MJ4 WT obtidos a partir da mesma chapa de RT para reduzir a variabilidade intra-ensaio.

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Resultados

A fim de executar corretamente este protocolo, o que cria um plasmídeo proviral capaz de montar totalmente funcionais, infecciosas quimeras Gag-MJ4, deve ser tomado muito cuidado para gerar os amplicons PCR adequados. Determinar se a PCR tem gerado o amplicon mordaça de tamanho adequado é fundamental. Os produtos devem estar dentro de 100 pares de bases (pb) do fragmento amplificado de aproximadamente 1700 pb apresentado na Figura 1A. O comprimento exacto deste fragmento irão variar de acordo c...

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Discussão

Devido à extensão e natureza técnica deste protocolo, há várias etapas que são fundamentais tanto para a construção bem sucedida de plasmídeos quiméricos Gag-MJ4, bem como para a quantificação da capacidade de replicação viral. Embora a estratégia de clonagem baseado enzima de restrição para a introdução de genes gag estrangeira em MJ4 descritas neste protocolo tem inúmeras vantagens sobre os métodos baseados recombinação utilizados anteriormente, o protocolo pode ser tecnicamente difícil, se as etapas críticas...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os investigadores agradecem a todos os voluntários na Zâmbia que participaram deste estudo e a todos os funcionários do Projeto de Pesquisa de HIV Zambia Emory em Lusaka que tornaram este estudo possível. Os investigadores gostariam de agradecer a Jon Allen, Smita Chavan e Mackenzie Hurlston pela assistência técnica e gerenciamento de amostras. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Mark Brockman por suas discussões e generosa doação das células GXR25.

Este estudo foi financiado pelo R01 AI64060 e R37 AI51231 (EH) e pela International AIDS Vaccine Initiative. Este trabalho foi possível em parte graças ao generoso apoio do povo americano por meio da Agência dos Estados Unidos para o Desenvolvimento Internacional (USAID). O conteúdo é de responsabilidade dos autores do estudo e não reflete necessariamente as opiniões da USAID ou do governo dos Estados Unidos. Este trabalho também foi apoiado, em parte, pelo Núcleo de Virologia do Centro Emory de Pesquisa da AIDS (Grant P30 AI050409). DC e JP foram apoiados em parte pela Action Cycling Fellowships. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão básica do Centro Nacional de Pesquisa de Primatas de Yerkes (2P51RR000165-51). Este projeto também foi financiado em parte pelo Centro Nacional de Recursos de Pesquisa P51RR165 e atualmente é apoiado pelo Escritório de Programas de Infraestrutura de Pesquisa / OD P51OD11132.

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Materiais

Reagentes de Ensaio de Quantificação de Transcriptase Reversa
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PCR Reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNACustomOligo 25 nmol, dessalinização padrão
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTCTGCTTGCCCA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, dessalinização padrão
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Água livre de nucleaseFisherSH30538FSFabricado pela Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 Tubos de Tira, Azul (Tampa Plana)DaiggerEF3647BX
SuperScript III sistema RT-PCR de uma etapaLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA polimeraseFisherF-549L
PCR Nucleotide MistureRoche4638956001
Agarose, alta resistência em gelFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb DNA ladderFisherPRG5711Fabricado pela Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV Gel e Sistema de limpeza PCRPromegaA9282
Lâminas de barbear,Fisher12-640Fabricado pela Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Microbiology & Reagentes de clonagem
LB Agar, MillerFisherBP1425-2
LB Caldo, LennoxFisherBP1427-2
Placas de Petri de poliestireno estéreis 100 x 15 mmFisher08-757-12
Sal de ampicilina sódicaSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Tubos de polipropileno de fundo redondoBD Biosciences
Endonuclease de restrição deNew England BioLabsR0564L
Endonuclease de restrição de BclINew England BioLabsR0160L
Endonuclease de restrição de HpaINew England BioLabsR0105L
T4 DNA Ligase, 5 U/μ lCélulasRoche 10799009001
JM109, >108 cfu/μ gPromegaL2001
Sistema de minipreparação de plasmídeo PureYieldPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Transiluminador de luz azulInvitrogenG6600
Microfuge 18 centrífugaBeckman Coulter367160
Reagentes de cultura de células
Limpador / desinfetante de ampiloFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWR PAE2311Fabricado pela Promega
Brometo de hexadimetrina (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Placas Costar, 6 poços, planasFisher07-200-83Fabricadas pela Corning Life
Placas Costar, 24 poços, planasFisher07-200-84Fabricadas pela Corning Life
Placas Costar, 96 poços, redondasFisher07-200-95Fabricado pela Corning Life
Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2Fisher10-126-37
Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm2Fisher10-126-34Fabricado pela Corning Life
Conical Tubes, 50 ml, tampa azulFisher14-432-22Fabricado pela BD Biosciences
Tubos cônicos, 15 ml, tampa azulFisher14-959-70CFabricado pela BD Biosciences
Tripsina-EDTAFisherMT25052CIFabricado pela Mediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penicilina/ Estreptomicina/Glutamina, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS com magnésio e cálcio, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS sem magnésio e cálcioLife Technologies/Invitrogen20012-050
Tubos Sarstedt, cores sortidasSarstedt72.694.996
Bandejas de reservatório para Multicanal, 55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Microplaca tratada com cultura de tecidos de fundo em V transparente Corning 96 Fisher07-200-96Fabricado pela Corning Life
HEPES, solução tampão de 1 mLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, Definido, 500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941fabricado pela Promega
Glutaraldeído, Grau II, 25% em H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M Solução de cloreto de magnésioSigma-AldrichM1028-100ML
Solução de formaldeído, para biologia molecular, 36,5%Sigma-AldrichF8775-500ML
Potássio hexacianoferrato(II) trihidratadoSigma-AldrichP9387-100G
Hexacianoferrato de potássio(III)Centrífuga Sigma-AldrichP8131-100G
Allegra X15-RBeckman Coulter392932
TC10 MicroscópioBio-Rad1450001
VistaVisionVWR
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0Life Technologies/Invitrogen15568025Deve ser ajustado para pH 7.8 com KOH
2 M Cloreto de potássio (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAjustar para solução 1 M
0.5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Ácido poliadenílico (Poly rA) sal de potássio Midland Reagent Co.P-3001
Oligo d(T) primerLife Technologies/Invitrogen18418-012
Ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, Tela de Fósforo de Super Resolução, PequenoPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermowell (M) PolicarbonatoFisher07-200-245Fabricado pela Corning Life
Fita de vedação de alumínio de microplaca de 96 poços Corning, não estérilFisher07-200-684Fabricado pela Corning Life
DE-81 papel de troca aniônicaWhatman3658-915
Citrato trissódico di-hidratadoSigma-AldrichS1804-1KG
Cloreto de sódioFisherS671-3
de autorradiografiaFisherFB-CA-810
Cyclone armazenamento de tela de phoshporPackard
de um gume 352059 HpaI competentes Contador de células automatizado invertido <td colspan="4"> Modelo de placa de 96 poços

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A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a
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