Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

Resumo

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Resumo

Durante mais de 20 anos, a farmacologia inversa tem sido a estratégia mais proeminente para descobrir os ligandos activadores de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs). O início de um ensaio de farmacologia inversa é a clonagem e subsequente transfecção de um GPCR de interesse num sistema de expressão celular. O receptor heterólogo expresso é então desafiados com uma biblioteca de compostos de ligandos candidatos para identificar o ligando (s) de activação do receptor. A activação do receptor pode ser avaliada por medição das alterações da concentração de moléculas de segundo mensageiro repórter, como o cálcio ou o cAMP. O ensaio mobilização de cálcio à base de fluorescência descrito aqui é um meio-de transferência freqüentemente utilizado teste de reversão farmacologia. O GPCR órfãos é expressa de forma transiente em rim embrionário humano 293T (células HEK293T) e um constructo promíscuo Gu ₁₆ é co-transfectado. Após ligação do ligante, a ativação do Gu ₁₆ subunidade induz a liberação de cálcio from do retículo endoplasmático. Antes do rastreio do ligando, as células que expressam receptores são carregados com um indicador de cálcio fluorescente Fluo-4 acetoximetilo. O sinal de fluorescência de Fluo-4 é insignificante em células sob condições de repouso, mas pode ser amplificado mais do que uma dobra de 100 sobre a interacção com iões de cálcio, que são libertados após activação do receptor. A técnica descrita não requer o estabelecimento demorada das linhas de células transfectadas de forma estável, em que o material genético transfectada é integrado no genoma da célula hospedeira. Em vez disso, uma transfecção transiente, gerando expressão temporária do gene alvo, é suficiente para realizar o ensaio de rastreio. A configuração permite-throughput screening meio de centenas de compostos. A co-transfecção da promíscuo Gu _16, a qual acopla a maior parte dos GPCRs, permite que a via de sinalização intracelular a ser reorientada para a libertação de cálcio, independentemente da via de sinalização nativa no pavimento endógenomentos. As células HEK293T são fáceis de manusear e provaram a sua eficácia ao longo dos anos em ensaios deorphanization receptores. No entanto, a otimização do ensaio para receptores específicos podem permanecer necessário.

Introdução

Receptores acoplados à proteína (GPCRs) constituem uma das maiores e mais diversas famílias entre todas as proteínas da superfície celular. A sua presença em vertebrados, invertebrados, plantas, leveduras e fungo, assim como em Protozoa e os primeiros diploblásticos Metazoa indica que GPCRs estão entre as mais antigas moléculas ligadas a transdução de sinal ^1. Ativando seus ligantes naturais integram uma grande diversidade de estímulos externos, incluindo peptídeos, aminas biogênicas, odores, glicoproteínas, e fótons ^2. Como tal, estes sistemas de sinalização de receptor-ligando estão envolvidas numa grande variedade de processos fisiológicos. O espectro funcional ampla torna idealmente adequada para o desenvolvimento de medicamentos terapêuticos, que cobrem uma vasta gama de doenças humanas. Sobre 50-60% das metas de drogas atuais são representados por GPCRs ^3,4. Além de sua grande importância na indústria farmacêutica, GPCRs também estão no centro das atenções para o desenvolvimento de umnova geração de inseticidas específicos da espécie ^5,6 e pesticidas em geral. Porque os ligantes naturais de muitos GPCRs ainda não são identificados, eles são classificados como GPCRs órfãos. O deorphanization desses receptores irá melhorar a compreensão de seus papéis fisiológicos em organismos e pode descobrir alvos putativos para novas aplicações de drogas ^7.

Desde a era genômica, a estratégia de farmacologia reversa é amplamente aplicado para o deorphanization de GPCRs ^8. A abordagem implica que um receptor órfão é usado como um "gancho" de 'peixe fora »o seu ligando de activação a partir de um extracto biológico ou a partir de uma biblioteca de compostos sintéticos. O GPCR de interesse é, por conseguinte, clonado e subsequentemente transfectadas em um sistema de expressão celular. Nos métodos mais utilizados, a activação do receptor é determinada medindo as alterações na concentração de moléculas de segundo mensageiro ⁹ (por exemplo, aquorina) ¹⁰ ou fluorescentes indicadores de cálcio (por exemplo, Fluo-4) ^11. Os ensaios baseados em fluorescência, em que as células que expressam receptores são carregados com um indicador fluorescente de cálcio antes de rastreio de ligando, tem a vantagem de que eles permitem o rastreio de alto rendimento, devido à sua facilidade de uso, o tempo de leitura curto, e a flexibilidade de triagem vários receptores órfãos sobre uma única placa ^12.

Aqui, o ensaio de mobilização de cálcio baseados em fluorescência é completamente descrita e ilustrada pelo processo deorphanization da Drosophila melanogaster curto neuropeptídeo F receptor (SNPF). Este sistema de sinalização neuropeptidérgicas foi inicialmente caracterizado por Mertens et al. em 2002 ¹³ com um ensaio de bioluminescência cálcio realizada em células de ovário de hamster chinês (CHO)¹⁴ e por Feng et al., Em 2003, com um ensaio eletrofisiológico utilizando oócitos Xenopus ^15. A presença do sistema de sinalização SNPF parece estar limitada ao filo dos artrópodes, em que está implicado numa ampla variedade de processos, incluindo a regulação da alimentação, o crescimento, as reacções de stress, a locomoção, e ritmos circadianos ^16.

A pesquisa sobre sistemas de sinalização neuropeptidérgicas em insetos podem não só levar a novos alvos para o desenvolvimento de inseticidas, mas o conhecimento do seu funcionamento também podem ser extrapolados para outros organismos como muitos sistemas de sinalização foram geralmente bem conservados ao longo da evolução ^17. Na última década, um grande progresso tem sido feito no processo deorphanization de GPCRs neuropeptídeo insetos. Apesar destes esforços, apenas um pequeno número de receptores foram acompanhados ao seu ligando cognato, e muita informação de seqüência paranovos GPCRs órfãos tornou-se disponível, devido à expansão da genômica ^18. A disponibilidade de médio / alto throughput abordagens de triagem, como o teste de mobilização de cálcio à base de fluorescência que tem provado ser uma técnica amplamente aplicado ^9,18, é, portanto, de valor inestimável.

O ensaio de mobilização de cálcio à base de fluorescência, tal como descrito aqui é realizada na embrionária 293T de rim humano (HEK293T) A linha de células e utiliza uma sonda fluorescente para determinar as alterações na concentração intracelular de cálcio após a activação do receptor. Para garantir a elevada expressão e os níveis de tradução do receptor, uma sequência de consenso de Kozak ¹⁹ é adicionado à extremidade 5 'da sequência de codificação do receptor, a qual é subsequentemente clonado num vector de expressão (por exemplo, séries vector pcDNA para linhas de células de mamíferos). Como é difícil prever o endógeno de proteína G-acoplamento de um GPCR órfãos com base em informação da sequênciasozinho, o segundo mensageiro moléculas (por exemplo, cálcio ou cAMP) que são modulados depois de activação do receptor muitas vezes permanecem desconhecidos antes da identificação do ligando. Para contornar este problema, as proteínas G promíscuos da família G _q (por exemplo, murino Gu Gu humano ₁₅ ou ₁₆ [usado aqui]) ou as proteínas G quiméricos (por exemplo, Gu _qi5) que interagem com a maior parte dos GPCRs e induzir a libertação de cálcio pode ser co-expressa ^20,21,22. Após a ligação do ligando ao seu receptor, o GPCR sofre uma alteração conformacional que conduz à activação de vias intracelulares específicos. A molécula de guanosina difosfato (GDP), com destino em condições de repouso para o Gu ₁₆ subunidade, será substituído por um trifosfato de guanosina (GTP) molécula. Isto provoca a dissociação da proteína G heterotrimérica num Gu ₁₆ e Gβγ subunidade. O Gu ₁₆ subunidade ativa a fosfolipase C &º 946; (PLCβ), que por sua vez hidrolisa o difosfato de fosfatidilinositol ligada à membrana (PIP _2), resultando em diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP _3). IP ₃ irá espalhar ao longo do citoplasma e activa os canais de cálcio de IP _{3-dependentes} presentes na membrana do retículo endoplasmático, o qual induz a libertação de cálcio para o interior do citoplasma.

A libertação de cálcio após a activação do receptor ocorre dentro de segundos e pode ser detectado através do carregamento de células antes do ensaio de rastreio com um corante sensível ao cálcio, Fluo-4, como acetoximetilo (AM) ^11. O grupo éster AM permite o fluoróforo para atravessar a membrana celular e é clivada por esterases citoplasmáticas, uma vez no interior da célula. Consequentemente, as cargas negativas do corante fluorescente é desmascarado, impedindo-o de difundir para fora da célula e que lhe permite interagir com os iões de cálcio. O sinal o fluorescentef Fluo-4 é insignificante em células sob condições de repouso apenas contêm as concentrações de cálcio na gama nanomolar. No entanto, quando o cálcio é libertado após a activação do receptor, o sinal pode aumentar a concentração de forma dependente a mais de 100 vezes, este meio garantindo uma grande relação de sinal-para-ruído. Fluo-4 também apresenta uma larga gama dinâmica para relatar [cálcio] em torno de um K _d (cálcio) de 345 nM, tornando-o adequado para medir alterações de cálcio fisiologicamente relevantes em uma ampla variedade de células. A excitação de Fluo-4 ocorre a 488 nm e a emissão de fluorescência é medida a 525 nm ^11. Fluorimeters como o leitor de placas de imagiologia por fluorescência (FLIPR) ^23, o NOVOSTAR, ou o FlexStation (dispositivo de estação) ¹² / são sistemas de alto rendimento médio que permitem adição simultânea composto e a detecção do sinal de Fluo-4, mediante a activação do receptor por cada poço em uma placa de ensaio. O ensaio de mobilização de cálcio descrito aqui baseia-se na estaçãodispositivo do sistema de microplacas de 96 poços.

O software SoftMax Pro (software) é usado para operar o dispositivo de estação, assim como para análise dos dados. O programa imediatamente exibe os resultados na forma de gráficos de formato de 96 poços. Vários poços podem ser seleccionados simultaneamente para comparar os resultados destes poços no mesmo gráfico. A unidade fluorescente relativa (RFU) valores de poços em cada coluna são medidos simultaneamente para um período de dois minutos, a começar antes da adição de compostos aos poços e continuada depois da medição do sinal de fluorescência após a activação do receptor. Tipicamente, a tendência de uma curva agonista alinha com a linha de base até um composto de activação é adicionado às células, o que resulta num rápido aumento do sinal fluorescente. A altura do pico é correlacionada com a concentração de agonista final no poço. Após o pico, o sinal fluorescente cai lentamente até ao nível da linha de base. O medições RFU can ser convertidos em curvas de concentração-resposta para determinar o valor _{de EC50} (concentração eficaz semi-máxima) de um ligando. Em geral, pelo menos três crivos independentes, cada um incluindo três réplicas de uma série de concentração, deve ser realizada para compor uma curva de concentração-resposta fiável.

Recomenda-se incluir vários controles positivos e negativos no projeto experimental. Primeiro de tudo, um controlo de transfecção, ou seja, a aplicação de um receptor com um ligando conhecido, deve ser testado. Isto permite verificar se o agente de transfecção foi operacional. A incorporação de uma experiência de controlo com um agonista para um receptor endógeno de a linha de células e um controlo negativo (por exemplo, tampão de lavagem) são também recomendado para monitorizar a saúde e viabilidade das células e para excluir a possibilidade de que o tampão de lavagem foi contaminada com um fator que pode desencadear uma auto-fluoreresposta perfume. Agonistas utilizados com frequência são de um péptido derivado a partir do-activated receptor-1 da protease (PAR _1), que actua como um agonista de PAR ₁ selectivo, ou carbacol, que activa o receptor de acetilcolina. Células transfectadas com um vector de expressão vazio também devem ser testados para excluir que os compostos activos interagem com os receptores endógenos da célula. Optimização de vários parâmetros descritos no protocolo abaixo pode ser necessário para os diferentes sistemas de sinalização. A figura esquemática do ensaio de mobilização de cálcio completo à base de fluorescência é apresentada na Figura 1.

Figura 1. Esquema geral do ensaio de mobilização de cálcio baseados em fluorescência. Automatizado de manuseamento de líquido e de fluorescência simultânea medições são realizadas com a estaçãoleitor de microplacas dispositivo, accionado pelo software. O dispositivo estação contém três gavetas: uma para a placa de celular, placa composto e rack ponta. Os compostos de transferências pipetador embutidas de uma coluna da placa de composto para a coluna correspondente da placa de células (passo 1). Cada poço da placa de células contém uma monocamada de células HEK293T que foram co-transfectadas com o GPCR de interesse e o promíscuo Gu ₁₆ subunidade. Quando um composto activa o receptor, o PIB Gu ₁₆ ligado é substituído por GTP. A subunidade Gu ₁₆ dissocia-se, posteriormente, a partir do complexo Gβγ e activa a fosfolipase Cp (PLCβ), que por sua vez hidrolisa o fosfatidilinositol bifosfato (PIP _2), resultando em diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP _3). IP ₃ ativa IP canais de cálcio _{de 3-dependente} presente na membrana do retículo endoplasmático, induzindo a libertação de cálcio into citoplasma. A interacção do cálcio com Fluo-4 (com a qual as células são carregadas previamente para o composto de adição) resulta num sinal de fluorescência (passo 2). O software apresenta os resultados como a unidade fluorescente relativa (RFU) valores em função do tempo, e as alturas dos picos correlacionar com a concentração de ligando de um modo dependente da concentração. Estes dados podem então ser convertidos em uma curva de concentração-resposta para determinar o valor de EC ₅₀ de um par receptor-ligando (passo 3).

Protocolo

Nota: Todas as acções em que são envolvidas as células devem ser realizadas num ambiente estéril de trabalho em um fluxo laminar.

1. Manutenção da Linha HEK293T celular

1. Crescer as células HEK293T em um frasco T-75, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de _CO2 umidificada.
2. Passagem das células quando uma confluência de 80% seja atingido. Nota: Isto normalmente leva de 3 a 4 dias. As células em cultura contínua permitir 20-25 passagens utilizáveis ​​para a seleção.
   1. Coloque salina tamponada com fosfato da Dulbecco (PBS) sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, PBS-tripsina-etilenodiaminotetracético ácido acético (EDTA) (500 ml de PBS suplementado com 10 ml de solução de tripsina-EDTA e 4,5 ml de 4% de EDTA) e meio de crescimento (500 ml meio de Eagle modificado por Dulbecco - alta concentração de glicose [DMEM], suplementado com 10% de soro fetal de bovino [FBS] e 1 mM de penicilina-estreptomicina [PS]) à temperatura ambiente, meia hora antes.
   2. Removero meio de crescimento a partir das células de idade. Lavar as células mortas com 3 ml de PBS e retire a PBS novamente.
   3. Adicionar 3 ml de PBS com tripsina-EDTA, incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente e remover a solução Nota: A morfologia das células irá mudar de a em forma de esfera em forma de estrela.
   4. Soltar as células do fundo do balão, agitando ligeiramente e recolher as células por lavagem dos vários tempos de fundo com 10 ml de meio de crescimento fresco.
   5. Transferir 1 ml da cultura celular para um novo frasco T-75 contendo 14 mL de meio de crescimento fresco, e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de _CO2 umidificada.

2. Transfecção transiente de células HEK293T

1. Crescer as células HEK293T em um frasco T-75 3 dias antes do ensaio real mobilização de cálcio ocorre. Certifique-se usar três T-75 frascos, um para a transfecção com a construção receptor, um para transfecção com um vetor vazio expressão, como controle negativo, e one para o controlo de transfecção. Nota: O passaging das células é realizada tal como descrito na etapa 1.2. Quando várias placas de 96 poços têm de ser rastreados, T-150 frascos pode ser usado para obter um maior rendimento de células (para fazer isso, duplos todas as quantidades listados nas etapas 1.2.5, 2.3, 3.1.3 e 3.1.4) .
2. Incubar os frascos a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ incubadora humidificada, durante 20-24 horas até que as culturas de células aproximar 50-70% de confluência.
3. Co-transfectar uma população de células com o vector de expressão que codifica o GPCR de interesse e o constructo Gu _16, o segundo frasco com o vector vazio e o constructo Gu _16, e a terceira com o controlo da transfecção e o Gu ₁₆ construto. Nota: Neste protocolo, o receptor Drosophila SNPF foi clonado num vector de expressão mamífero pcDNA3.1 ^13. JetPRIME foi utilizado para realizar a transfecção, mas outros reagentes de transfecção podem ser usados ​​também.
   1. Adicione pelootal de 7,8 mg de DNA (3,9 mg construção receptor ou vazio vetor, e 3,9 mg Gu ₁₆ construção de expressão) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 500 mL de buffer JetPRIME. Misture bem em vortex o tubo, e girar para baixo em breve.
   2. Adicionar 37.5 ul de reagente JetPRIME, vortex e girar durante 1 min a 14.000 x g. Incubar a mistura de transfecção de 10 min à temperatura ambiente.
   3. Adicionar gota a gota mix transfecção para o meio de cultura celular e certifique-se pipetar diretamente no meio de evitar o contato com as paredes da garrafa de cultura. Incubar os frascos a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ incubadora humidificada, durante 20-24 horas.

3. Ensaio de Mobilização de Cálcio

1. Recolher as células transfectadas e semear-los em placas, de fundo claro, preto de parede de 96 poços.
   1. Coloque o PBS, PBS-tripsina-EDTA e o meio de transferência de DMEM (500 ml de DMEM suplementado com 10% de FBS dialisadoe 1% PS) à temperatura ambiente, meia hora antes.
   2. Cubra a 96 poços negros de parede, placas claras de fundo com 60 mL de PBS com fibronectina (0,0025%) por poço (5,85 ml de PBS e 150 mL de fibronectina [0,1%] por placa). Incubar as placas à temperatura ambiente durante 1 hora com a tampa colocada. Remover a solução a partir dos poços e incuba-se as placas mais uma vez durante 1 hora, sem a tampa, à temperatura ambiente. Em alternativa, é possível utilizar placas pré-revestidas durante a fixação das células reforçada.
   3. Tire o meio de crescimento de idade das células e lavar as células mortas fora com 3 ml de PBS e remover o PBS.
   4. Adicionar 3 ml PBS-tripsina-EDTA, incubar por 1 min, em seguida, retire a solução. Nota: A morfologia das células a partir de alterações em forma de estrela, em forma de esfera para.
   5. Soltar as células do fundo do balão, agitando ligeiramente e recolhê-las, por lavagem várias vezes com 10 ml de meio de transferência de DMEM. Transferência das células para um tubo Falcon de 50 ml.
   6. Contar onúmero de células por ml (feita com um NucleoCounter aqui, mas de uma câmara de Burker é aceitável). Adicionar 100 ul da cultura de células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 100 mL de tampão de lise e misture tocando no tubo. Adicionar 100 ul de tampão de estabilização e misture tocando.
   7. Encher um NucleoCassette com a suspensão de células e contagem das células com o contador. Multiplicar o número de células por três, como as células foram diluídas por um factor de três, ao adicionar a lise e estabilização em tampão passo 3.1.6.
   8. Dilui-se as células a uma concentração final de 600.000 células / ml e 150 ul de semear as células por poço em placas revestidas para obter uma densidade de células de cerca de 90.000 células por / poço. Evitar as bolhas de ar e bata a placa para espalhar as células uniformemente de forma a obter uma camada de células contíguas. Incubar as placas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ incubador humidificado durante 16-24 horas.
2. Carregar as células com o corante fluorescente e preparar o coplaca mpound.
   1. Preparar a solução salina balanceada de Hank (HBSS) / HEPES / Ca ^{2 +} / albumina sérica bovina (BSA) buffer: adicionar 165 mL de solução stock de _CaCl2 (1 M de _CaCl2 em água destilada [dH ₂ O] - armazenar à temperatura ambiente), solução estoque 500 HEPES ul (1 M HEPES em dH ₂ O, pH 7,4 - armazenar à temperatura ambiente), e 0,05 g de BSA a 50 ml HBSS. Note-se que o ácido gordo livre de BSA é utilizado para os ensaios de cálcio, como os ácidos gordos podem activar receptores específicos, prejudicando o sinal de cálcio do receptor de interesse.
   2. Preparar a solução probenecida (100x, 250 mm): dissolver 0,71 g de probenecide em NaOH 5 ml (1 m) e adicionar 50 ul HEPES solução estoque e 5 ml da / HEPES / Ca ^{2 +} tampão HBSS / BSA - sempre preparar nova solução. Nota: O probenecid inibe transportadores de aniões inorgânicos que podem desalojar Fluo-4 a partir do citoplasma, reduzindo, assim, o sinal fluorescente. Recomenda-se a realização da carga de corante nasa presença e ausência de probenecid para determinar se transportadores de aniões inorgânicos apresentam um problema potencial nas linhas celulares particulares sob investigação, como probenecida pode mesmo diminuir o sinal mediada por agonista.
   3. Preparar o tampão de lavagem: adicionar 500 uL de solução probenecida para 50 ml de HBSS / HEPES / Ca ^{2 +} / tampão de BSA, ajustar o pH para 7,4 e filtra a solução tampão. Sempre preparar tampão fresco, e 50 ml de solução tampão por placa é necessária.
   4. Prepare uma solução de ácido plurónico a 10%: misturar 50 mL de ácido plurónico (20% w / v em dimetil-sulfóxido [DMSO]) com 50 ul de DMSO - se ocorrer a cristalização, de calor a 37 ° C e sempre preparar uma solução fresca.
   5. Preparar uma solução de Fluo-4 AM (1 mM): adicionar 44 ul solução de 10% de ácido plurónico a um frasco que contém 50 ug de Fluo-4 AM e vortex até que esteja completamente dissolvido. Evitar a exposição à luz para evitar o branqueamento do fluoróforo.
   6. Prepare tampão de carregamento: adicionar 8,8 ml DMEM supplemented com 10 mM de HEPES e 2,5 mM de probenecid (pH 7,4) à solução de Fluo-4 AM (44 ul) e vortex. Sempre use tampão fresco.
   7. Descartar meio das células, lavar as células com 200 ul de PBS por poço, e remover o PBS.
   8. Adicionar 55 ul de tampão de carga por poço e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Envolva a placa em folha de alumínio para evitar a exposição da chapa para iluminar.
   9. Seque os compostos antes da tela, se forem solúveis em solventes que são prejudiciais (por exemplo, acetonitrilo) para o sistema de expressão celular.
   10. Solubiliza-se os peptídeos em tampão de lavagem em tubos siliconizados de 1,5 ml de microcentrífuga. Prepara-se uma série de diluições para realizar uma análise de concentração-resposta e determinação do valor de EC ₅₀ de um ligando. Adicionar 70 ml da ligante no correspondente poço da placa de composto (placas de 96 poços em forma de V) e incluem controles positivos (agonista endógeno) e negativos (tampão de lavagem) em cada placa. Não e: Se um composto não é solúvel na solução de lavagem, pode-se experimentar outros solventes que não sejam prejudiciais para as células sob investigação, tais como água ou soluções que emulsionar e solubilizar óleos e outras substâncias insolúveis em água (por exemplo, Kolliphor EL) .
   11. Medir todas as amostras em triplicado. Tenha em atenção que 50 ul de um ligando a partir da placa de composto vai ser transferido para um poço com 100 ul de tampão de lavagem de placa de células durante o ensaio, de modo a preparar os compostos de 3x a concentração final desejada.
   12. Descartar o tampão de carregamento da placa de células e adicionar tampão de lavagem de 100 ul a cada poço. Incubar a placa de 15 min à temperatura ambiente, e evitar a exposição à luz.
   13. Descartar o tampão de lavagem de placa de células e adicionar 100 ul de tampão de lavagem de novo a cada poço.
   14. Incubar a placa de células, a placa composta, e uma cremalheira de ponta (96 cavidades, as pontas das pipetas dispositivo estação) durante 15 min a 37 ° C.

título "> 4. Ensaio sobre o dispositivo Estação

1. Criar e carregar o arquivo de protocolo desejado com o software e ativar a unidade de controle de temperatura para a câmara de leitura. Aqui, medir a resposta de cálcio a 37 ° C durante 2 min numa linha de cada vez com 1,52 segundos de intervalo entre as leituras sucessivas (uma medição completa da placa de 96 poços demora aproximadamente 25 min) a 525 nm. Definir a excitação de Fluo-4 a 488 nm e transferir um volume total de 50 ul de composto para a placa de células, 18 segundos após o início da leitura, com a velocidade de distribuição fixada em 26 ul / seg e uma altura pipeta de 135 uL.
2. Posicione o composto e placa de células, eo rack ponta nas gavetas apropriadas do dispositivo estação.
3. Realizar uma única leitura da placa de células, ao mesmo comprimento de onda de excitação e de emissão no modo terminal, antes de iniciar a tela real no modo FLEX. Nota: Esta medida dá unidade fluorescência relativa valores (RFU) e permite a detecção de variabilidade entre nóslls da placa. Valores entre 20.000 e 40.000 são consideradas aceitáveis.
4. Iniciar o ensaio e analisar os dados com o software.

Resultados

Série de concentrações que variam de 50 uM para 0,001 nM foram testadas para todos os quatro peptídeos de Drosophila SNPF (Drome-SNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-SNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-SNPF-3: PQRLRWamide, Drome-SNPF-4: PMRLRWamide) em células HEK293T transientemente que expressam o receptor de Drosophila SNPF eo promíscuo Gu ₁₆ subunidade. O GPCR foi activado por todos os quatro péptidos em concentrações finais até 0,1 nM, e a activação do receptor foi dependente da concentração. Figura 2 mostra os gráficos correspondentes a uma das três réplicas da série de concentração Drome-SNPF-1. O controlo negativo (tampão de lavagem) não induziu um sinal de fluorescência, enquanto que o controlo positivo (PAR ₁ - ₁ uM) induziu forte activação do receptor-1, conduzindo a um sinal de alta fluorescente (± 30.000 RFU) activado por proteases endógenas. Deve notar-se que um desvio dea curva típica pode indicar anomalias. Por exemplo, um aumento contínuo da curva sem retornar à linha de base pode ser relacionada com sinais não mediados por receptores, tais como a presença de ionóforo de cálcio, ou uma bicamada lipídica interrompido causando escapes de cálcio.

O software permite a entrada de fórmulas para determinar a porcentagem de ativação ou os erros padrão das diferentes concentrações entre outros. Os dados resultantes são utilizados para compor as curvas de concentração-resposta preliminares para estimar os valores de EC _50, como mostrado para os quatro peptídeos Drome-SNPF na Figura 3. As curvas da Figura 3 também incluem dados para o controlo negativo, onde a concentração de série os péptidos Drome-SNPF foram testados em células HEK293T transfectadas com um vector pcDNA3.1 vazio. Os resultados indicam que a adição de péptidos a estas células não têm nenhum efeito sobre os receptores endógenos, mas, de facto activcomeu o receptor de interesse. O ensaio de mobilização de cálcio à base de fluorescência foi então repetido três vezes de forma independente. Com base nas curvas de concentração-resposta preliminares do ecrã inicial, as concentrações testadas foram adaptadas para cobrir a gama dinâmica da curva (Figura 4). Os valores de EC50 de Drome-SNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [intervalo de confiança de 95%]), Drome-SNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Drome-SNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) e Drome-SNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) são semelhantes, o que indica que eles são igualmente potentes para activar o receptor.

Figura 2. Gráfica saída do software para uma resposta mediada por receptores de fluorescência de uma série de concentração. Doze concentrações finais que variam de 50 (iM a 0,001 nM) of Drome-SNPF-1 péptido foram testados no receptor Drome-SNPF. A ativação é expressa em unidade fluorescente relativa valores (RFU). O gráfico superior mostra os resultados de seis concentrações mais elevadas e o gráfico inferior das seis concentrações mais baixas. O controlo positivo (+) é _um PAR (1 uM) e o controlo negativo (-) é o tampão de lavagem.

Figura 3. Curvas de concentração-resposta preliminares de péptidos Drosophila SNPF determinados por um único ensaio de mobilização de cálcio baseados em fluorescência. As curvas de concentração-resposta do receptor de Drosophila SNPF expresso transitoriamente em células HEK293T para os quatro peptídeos de Drosophila SNPF são mostrados em azul. Para os controlos negativos (a vermelho), os péptidos foram testados em HEK293TAs células transfectadas com um vector pcDNA3.1 vazio. As respostas fluorescentes são mostrados como relativa (%) para o valor mais elevado (100% de activação). As curvas são o resultado de uma experiência em que cada série de concentração foi avaliada em triplicado. As barras verticais representam os erros padrão da média (SEM), que por vezes são menores do que os símbolos utilizados (neste caso, apenas os símbolos estão representados).

Figura 4. Curvas de concentração-resposta e valores de EC ₅₀ correspondentes de péptidos Drosophila SNPF determinados por três ensaios de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada independentes. As curvas de resposta à concentração do receptor Drosopihla SNPF expressos transitoriamente em células HEK293T para os quatro peptídeos de Drosophila SNPF são o resultado de três me independenteasurements cada realizadas em triplicata (n ≥ 9). As respostas fluorescentes são mostrados como relativa (%) para o valor mais elevado (100% de activação). Os asteriscos indicam as concentrações para as quais barras de erro n ≤ 9. Indicam SEM, que por vezes são menores do que os símbolos utilizados (neste caso, apenas os símbolos estão representados). CE ₅₀ valores são mostrados com seus intervalos de confiança de 95%.

Discussão

O ensaio de mobilização de cálcio à base de fluorescência foi aplicado com êxito para confirmar a caracterização funcional do sistema de sinalização peptidérgica Drosophila SNPF, que já foi realizada por Mertens et al. com um ensaio de bioluminescência e por Feng et al. com ^13,15 ensaio eletrofisiológico. Os valores de EC ₅₀ obtidos com o ensaio de fluorescência em células HEK293T são cerca de 10 vezes menos do que os obtidos com o ensaio de bioluminescência realizadas em células CHO (Drome-SNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drome-SNPF- 2: fluo = 5,89 nM, lumi = 42 nM; Drome-SNPF-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM; Drome-SNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Estas variações podem ser explicada por vários factores, incluindo o facto de um dos sistemas de expressão utilizados podem ser mais adequados para a expressão funcional de um determinado receptor, ou a dobragem de alguns receptores podem ser menos eficiente na ctipos celulares ertain. Os valores de _EC50 de todos os quatro peptídeos Drome-SNPF estão na gama nanomolar, quando testado no seu receptor tanto com a fluorescência e a bioluminescência, geralmente suportar a relevância fisiológica da sua interacção-receptor do peptídeo in vivo.

Note-se que qualquer controlo de transfecção com um receptor para o qual o ligando de activação é conhecido foi incluído no ecrã apresentado aqui, porque o sistema de sinalização de Drosophila SNPF é normalmente o controlo de transfecção em montagens experimentais. O controlo positivo com um ligando endógeno das células HEK293T (PAR ₁₎ e o controlo negativo (tampão de lavagem) foram incluídos na tela. Os resultados do PAR ₁ mostrou que as células estavam numa boa condição. O controlo negativo (tampão de lavagem) não provocou um sinal de fluorescência, o que indica que o meio em que os péptidos são dissolvidos era livre de quaisquer contaminantes que possam influence os resultados.

O sistema de sinalização de Drosophila SNPF previamente caracterizados foi aqui utilizado para explicar o ensaio de mobilização de cálcio baseados em fluorescência. Para esta finalidade, a série de concentração de ligantes activantes foram testados imediatamente. No entanto, quando um receptor órfão é trazido para a sobre-expressão de um ensaio de rastreio para testar uma biblioteca contendo centenas de compostos, recomenda-se a primeira tela relativamente elevadas concentrações finais dos ligantes (por exemplo,., 10 ou 1 uM). Após a detecção de um composto de activação, uma série de diluições do composto que podem ser rastreados de modo a compor uma curva de concentração-resposta e determinação do valor de EC _50.

Uma vez que o ligando de activação de um receptor é determinada, a via de sinalização intracelular pode ser investigada através da adaptação do protocolo. O ensaio pode ser realizado como descrito acima, mas sem a co-transfecção do L ^5, ₁₆ subunidade. Quando uma resposta de cálcio é medida, isso significa que os pares de receptor com um endógeno Gu _q subunidade do sistema de expressão celular. Quando nenhum sinal fluorescente é observada, os protocolos para medir mudanças nas concentrações de outros mensageiros secundários (por ex., Campo) pode ser aplicada.

Da relação estrutura-actividade (SAR) estudos também pode ser levada a cabo para definir sequência do núcleo do péptido requerida para a activação do receptor. Em primeiro lugar, sequências truncadas são avaliados para definir a sequência mínima de aminoácidos do péptido que ainda é capaz de activar o receptor. Em seguida, os péptidos podem ser testados em que sistematicamente cada aminoácido foi substituído por um resíduo de alanina. Testando série alanina-substituição sintética sobre o receptor, que permite determinar a importância de cada um dos aminoácidos para a activação do receptor de ^24,25.

Apesar de seu uso freqüente e eficiência comprovadacácia, deve ser enfatizado que o ensaio descrito aqui pode precisar de algumas adaptações para obter os melhores resultados para os receptores específicos de interesse. A subunidade Gu ₁₆ tem a vantagem de que ele se liga a maior parte dos GPCRs, mas também pode ter um efeito negativo dominante sobre os receptores que par via Gu _q ²² endogenamente. Neste caso, pode ser útil para testar diversas combinações de proteínas G durante a optimização de um novo ensaio de cálcio e para comparar os resultados para os receptores acoplados à _q Gu na ausência ou na presença de Gu _16. Ensaios alternativos que são independentes da proteína G interagindo para detectar a activação do receptor também pode ser realizada, tal como a translocação de arrestina marcada com GFP, ou a detecção de alterações no potencial de membrana (p. ex., Pelo FLIPR Membrana Assay Kit Potencial). Além do Fluo-04:00 usado aqui, uma grande variedade de outros fluoróforos sensível ao cálcio, cada um com seu próprio espectral e isquêmicapropriedades ai, está disponível. O fluoróforo mais adequado pode ser seleccionado com base na GPCR, tipo de célula e o leitor de placas disponível, mas a verificação experimental é necessário. As quantidades de ADN transfectado e o ADN / transfecção razão reagente necessidade de ser determinado para cada combinação de linha de células-reagente receptor de transfecção. Finalmente, deve-se ter em mente que as células em cultura contínua permitir apenas 20-25 passagens utilizáveis ​​para executar os ensaios de rastreio.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
HEK293T células
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Solução de tripsina-EDTA (0,25%)	Sigma-Aldrich	T4049
Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado (EDTA)	MP Biomedicals	195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - glicose alta  (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Soro Fetal Bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Penicilina-Estreptomicina (P-S)	Sigma-Aldrich	P4333
jetPRIME	Polyplus transfecção	114-01	FuGENE HD Transfecção Reagente (Promega); Lipofectamina LTX & Mais reagente (tecnologias de vida)
Soro bovino fetal dialisado (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Fibronectina de plasma humano	Sigma-Aldrich	F0895
Reagente A100, tampão de lise	Chemometec	910-0003
Reagente B, tampão estabilizador	Chemometec	910-0002
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
HBSS tampão: Solução salina balanceada de Hank	Sigma-Aldrich	H8264
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
NaOH (1 M)	Vel	2781
Ácido plurônico	Invitrogen	P-3000MP
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Cálcio Green-1, ... (Invitrogen)
Frascos de cultura de tecidos TPP (T-75 e T-150)	Sigma-Aldrich	Z707503 e Z707554
dispositivo	FlexStation Molecular Devices		NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Dispositivos Moleculares)
Placas de poliestireno de paredes pretas (96 poços) com fundo transparente	Greiner Bio-One	655090	Microplacas revestidas de poliestireno preto de poliestireno preto de 96 poços
NucleoCassette	Chemometec	941-0001
NucleoCounter NC-100	Chemometec
Tubos de microcentrífuga, siliconizados	BioCision	BCS-2470
Placas de poliestireno em forma de V de 96 poços	Greiner Bio-One	651101
96 poços, ponteiras de pipeta FlexStation	Molecular Devices	9000-0912
Software Soft Max Pro	Molecular Devices