Este procedimento mostra como direcionar interneurônios no prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Essa técnica foi particularmente eficiente para alcançar a expressão gênica seletiva em subtipos de interneurônios destinados às camadas superficiais do córtex.
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Artigo de método
Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo do sistema nervoso (CNS) central de maturação depende de orientação genética de populações neuronais. No entanto, a tarefa de restringir a expressão de genes de interesse para os subtipos neuronais específicos provou extremamente difícil devido à escassez relativa de elementos promotores específicos. Interneurônios GABAérgicos constituem uma população neuronal com ampla diversidade genética e morfológica. De facto, mais de 11 subtipos diferentes de interneurónios sensíveis a GABA têm sido caracterizadas no córtex do rato 1. Aqui apresentamos um protocolo adaptado para direcionamento seletivo das populações GABAérgicos. Conseguimos subtipo direccionamento selectivo de interneurónios sensíveis a GABA, utilizando o elemento potenciador da transcrição homeobox factores Dlx5 e DLX6, os homólogos da distal inferior (Dll) do gene de Drosophila 2,3, para dirigir a expressão de genes específicos dentro do útero por meio de electroporação.
Introdução
A maior parte dos interneurônios GABAérgicos corticais originam de duas estruturas embrionárias transitórias nomeadas as eminências ganglionares média e caudal (MGE e CGE respectivamente) 4. Parvalbumin e somatostatina expressar interneurônios origem no MGE enquanto Calretinina (Cr), Vasointestinal peptídeo (VIP) e Reelin (Re) expressando interneurônios originam do CGE. Estes subtipos Interneuron podem ser distinguidos pelas suas datas de nascimento. MGE subtipos derivados nascem entre o dia embrionário 9.5 (E9.5) e E16.5 5,6. Em contraste, interneurônios CGE derivados nascem E12.5 através E18.5 com sua produção atingindo um máximo de 6
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Protocolo
Todos os animais foram tratados de acordo com as normas e diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso da NYU School of Medicine animal Institucional.
Rato Cepas
Swiss Webster ratinhos fêmeas fornecidos por TACONIC Foram utilizados para estas experiências. A fim de orientar especificamente interneurônios camada superficial, foram utilizados embriões E15.5.
Nota: O plasmídeo utilizado no presente trabalho (Dlx5 / 6.eGFP plasmídeo 3 mg / mL) foi gerado utilizando técnicas de clonagem convencionais. O eGFP cDNA foi clonado num Dlx5 / 6-Pmin-poliA plasmídeo. Este plasmídeo está disponív....
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Resultados
Nós adaptamos a técnica de eletroporação in utero para atingir alvos específicos tipo de célula de neurônios vencimento. Para dirigir a expressão de GFP em interneurônios CGE derivados, foi utilizado o elemento potenciador Dlx5 / 6 e restrito nossas injeções para E15.5, a fase em que a maioria dos interneurônios CGE derivados são gerados. Realizou-se a análise em P8 e P15 11 (Figuras 1 e 2). Foi confirmada a origem ventral de neurônios eletroporados por co e.......
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Discussão
Limitações da técnica
Embora esta técnica permite a célula de análise autônoma de processos celulares, não é adequado para análise da população. Os electroporations são muito escassos com menos de mil células eletroporados por cérebro. Como consequência, a técnica não pode ser utilizada para avaliar as consequências comportamentais resultantes da manipulação genética de interneurónios CGE-derivados.
Enquanto electroporações realizadas em subtipos alvo E13.5 E14.5.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Somos gratos a Lihong Yin para assistência técnica. NVD é um destinatário de um NARSAD Young Investigator Award e também é apoiada por doações da NIH (5 K99 MH095825-02). Pesquisa no laboratório Fishell é apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Saúde Mental (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) e da Fundação Simons.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Eletroporador com pedal | Eletrodos de pá Protech International | CUY21 | |
| 5 mm | Protech International | CUY650P5 | |
| Almofada de aquecimento | Extrator | P30 DCT-15 | |
| Scientific | Instrumentos Sutter 3282322 | ||
| Sistemas de Anestesia Fluovac | Aparelho Harvard | 726425 | |
| Tesoura de Operação Delicada 4.75" Reta Afiada/Afiada | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Trança de Seda Preta 18" C-1 Caixa 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Aplicando Fórceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Tesouras de Grampo | Roboz | RC-4894 | |
| Pinça de Fixação | Ferramentas de Ciência Fina | 11031-15 | |
| Tubo capilar de vidro | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Estéril PBS | Life Technologies | 20012-027 |
Referências
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K.
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Reimpressões e permissões
