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Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

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DOI:

10.3791/51518

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18 de agosto de 2014

 , 
1NYU Neuroscience Institute, New York University School of Medicine, 2Brain and Mind Research Institute, Weill Cornell Medical College

Neste artigo

Resumo

Este procedimento mostra como direcionar interneurônios no prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Essa técnica foi particularmente eficiente para alcançar a expressão gênica seletiva em subtipos de interneurônios destinados às camadas superficiais do córtex.

Resumo

O estudo do sistema nervoso (CNS) central de maturação depende de orientação genética de populações neuronais. No entanto, a tarefa de restringir a expressão de genes de interesse para os subtipos neuronais específicos provou extremamente difícil devido à escassez relativa de elementos promotores específicos. Interneurônios GABAérgicos constituem uma população neuronal com ampla diversidade genética e morfológica. De facto, mais de 11 subtipos diferentes de interneurónios sensíveis a GABA têm sido caracterizadas no córtex do rato 1. Aqui apresentamos um protocolo adaptado para direcionamento seletivo das populações GABAérgicos. Conseguimos subtipo direccionamento selectivo de interneurónios sensíveis a GABA, utilizando o elemento potenciador da transcrição homeobox factores Dlx5 e DLX6, os homólogos da distal inferior (Dll) do gene de Drosophila 2,3, para dirigir a expressão de genes específicos dentro do útero por meio de electroporação.

Introdução

A maior parte dos interneurônios GABAérgicos corticais originam de duas estruturas embrionárias transitórias nomeadas as eminências ganglionares média e caudal (MGE e CGE respectivamente) 4. Parvalbumin e somatostatina expressar interneurônios origem no MGE enquanto Calretinina (Cr), Vasointestinal peptídeo (VIP) e Reelin (Re) expressando interneurônios originam do CGE. Estes subtipos Interneuron podem ser distinguidos pelas suas datas de nascimento. MGE subtipos derivados nascem entre o dia embrionário 9.5 (E9.5) e E16.5 5,6. Em contraste, interneurônios CGE derivados nascem E12.5 através E18.5 com sua produção atingindo um máximo de 6 E15.5. A orientação genética dessa população tarde nascido, no entanto, permanece indefinida.

Os (Dlx) genes distal-less murino são exclusivamente expressos no cérebro anterior ventral desenvolvimento 3. Interneurônios GABAérgicos e neurônios de projeção do estriado, mas não células piramidais corticais expressar Dlx1, 2,5, e 6 genes em estágios iniciais de desenvolvimento 3. De facto, os genes são expressos Dlx na zona MGE e CGE subventricular (SVZ), em todas as células progenitoras GABAérgicos. Expressão desses genes se torna restrita a seleccionar subtipos em fases pós-mitóticas 7-9. Evidências experimentais anteriores mostraram que o elemento potenciador Dlx5 / 6 permite o direcionamento seletivo de linhagens GABAérgicas em modelos de camundongos transgênicos 2. Foi testada a utilização de um destes elementos potenciadores no contexto da expressão episómico no cérebro do rato em desenvolvimento. Nós sub clonado o elemento potenciador Dlx5 / 6 em conjunto com um promotor mínimo e a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) no Bluescript (BS) plasmídeo de esqueleto (Figura 1). Nós introduzimos o plasmídeo por meio de in utero eletroporação em E15.5 para alvejar seletivamente Cr-, VIP e Re subtipos 3,8,10. A nossa técnica permite electroporação escasso, o que facilitaa reconstrução das características morfológicas de células singe. Além disso, os níveis excepcionalmente elevados de expressão de genes em neurónios GABAérgicos corticais permite estudos funcionais. Realizou-se a perda eo ganho de estudos da função utilizando vários tipo selvagem e genes dominantes negativos 11.

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Protocolo

Todos os animais foram tratados de acordo com as normas e diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso da NYU School of Medicine animal Institucional.

Rato Cepas
Swiss Webster ratinhos fêmeas fornecidos por TACONIC Foram utilizados para estas experiências. A fim de orientar especificamente interneurônios camada superficial, foram utilizados embriões E15.5.

Nota: O plasmídeo utilizado no presente trabalho (Dlx5 / 6.eGFP plasmídeo 3 mg / mL) foi gerado utilizando técnicas de clonagem convencionais. O eGFP cDNA foi clonado num Dlx5 / 6-Pmin-poliA plasmídeo. Este plasmídeo está disponível mediante solicitação (demarn02@nyumc.org).

1 Preparação de microinjeção pipetas

  1. Defina o extrator de calor # 2-860.
  2. Colocar e fixar o capilar de vidro perto do filamento. Verificar que o diâmetro externo (OD) da pipeta é cerca de 30 um.
  3. Pressione o botão "puxar".
  4. Retire cuidadosamente o capilar. A parte inferior é a agulha. Descartar a parte superior.

2 Anestesia Procedimento

  1. Prepare uma câmara contendo isoflurano. Nota: O isoflurano é o anestésico preferido devido a sua ação rápida e baixa incidência de efeitos colaterais. Pentobarbital é outra opção; No entanto, a tolerância deste fármaco é variável e pode levar a uma taxa de mortalidade maior do que o isoflurano.
  2. Definir o fluxo de isoflurano a 4-5% em 0,5-1 L / min O 2.
  3. Certifique-se de que a válvula para a câmara é aberta enquanto que a válvula para a placa de cabeça está fechado.
  4. Posicione o mouse grávida na câmara.
  5. Deixe o mouse para ir sob o efeito da anestesia. Isso levará cerca de 2-3 min. Verifique a taxa de respiração. Se o rato começa a hiperventilar, reduzir a dose de isoflurano.
  6. Após o mouse está anestesiado, imediatamente removê-lo da câmara. Coloque-o lado ventral em cima da almofada de aquecimento e iNSERT a cabeça na máscara que continuará a fornecer isoflurano durante toda a cirurgia. Certifique-se de mudar o fluxo de isoflurano da câmara para a mangueira que liga a peça adaptador cabeça. Coloque uma gota de lubrificante ocular em cada olho e fechar os olhos.
  7. Ajuste a almofada de aquecimento a 36 ° C graus para minimizar hipotermia.
  8. Verificar a ausência de pé e cauda reflexos, beliscar as patas traseiras ea cauda.

3. Cirurgia

  1. Limpe a pele que cobre o abdômen com etanol 70%.
  2. Use uma pinça para puxar a pele para cima. Após as cirurgias, lavar todos os instrumentos com detergente e água, e esterilizou-se a 72 ° CO / N.
  3. Fazer uma pequena incisão vertical (cerca de 2 cm) ao longo da linha média de partida a meio caminho entre o terceiro e quarto pares de glândulas mamarias. Use a tesoura cirurgia finas. Tome cuidado para não danificar a parede abdominal.
  4. Separe cuidadosamente a pele do peritônio.
  5. Visualize as artériase nervuras na parede abdominal. Adicione outro dois centímetros incisão vertical através do peritoneu (evitando os vasos) para expor a cavidade abdominal.
  6. Prenda a pele ea parede abdominal de cada lado evitando pinçamento das artérias. Nota: Se as artérias são acidentalmente perfurada, sacrificar o animal imediatamente ao realizar deslocamento cervical ou overdose isoflurano.
  7. Pré aqueça o PBS estéril a 37 ° C. Cubra os grampos com PBS úmidos Kim toalhetes.
  8. Hidratar a cavidade abdominal exposta com PBS. Repita este passo várias vezes durante a realização da cirurgia.
  9. Utilizando uma pinça redondas, puxe a cadeia embrionárias (E15.5) fora da cavidade. Deixe o resto da cadeia sobre os lenços umedecidos. Iniciar expondo metade do útero primeiro. Uma vez que os embriões em que são electroporados, trazê-lo de volta para dentro, em seguida, trabalhar no segundo semestre.

4. Eletroporação

  1. Continue a usar fórceps redondas para manipular os embriões.
  2. Visualize os ventrículos laterais. Os ventrículos laterais correm ao longo da linha média (Figura 1b).
  3. Adicionar Verde Rápido (Banco: 10% w / v) à solução de DNA de uma mistura 01:20 de visualizar que durante a injecção. Preparar a solução de DNA através da dissolução do sedimento obtido a partir de um protocolo padrão de purificação de maxi-prep em água destilada.
  4. Utilize micropipetas pré puxados com um êmbolo para injetar 1 ml da solução de DNA (Dlx5 / 6-EGFP, 3 mg / mL) com Fast Green. Cortar a ponta da micropipeta com uma pinça fina # 5 (Dumont) para deixar 6 mm de comprimento a partir do início do ombro até ao final da ponta da agulha antes de colocar a pipeta. Segure a cabeça do embrião com uma pinça redondas. Entram no cérebro com a pipeta com um ângulo de 45 ° com vista para o ventrículo lateral, localizado perto da linha média. Se a agulha penetra através do ventrículo, retirar lentamente a pipeta como você usa o êmbolo para injetar DNA. O ventrículo deve ficar verde quando osolução começa a preenchê-lo. Neste ponto, param de se mover a pipeta e injectar 1 ml de ADN. Delicadamente, retire a pipeta.
  5. Defina o electroporator CUY21 cinco 45V pulsos de 50 ms espaçadas de 950 ms.
  6. Use 5 milímetros eletrodos de remo para os embriões E15.5. Mergulhe os eletrodos em PBS para garantir a transmissão de corrente eficiente.
  7. Coloque as pás de eléctrodos em volta da cabeça do embrião com a pá positivo sobre o ventrículo contendo a solução de ADN. Ligeiramente inferior a pá positiva com relação à negativa para criar uma corrente ventral através das eminências ganglionares. Esta manipulação irá minimizar a expressão ectópica de células piramidais.
  8. Após a colocação dos eletrodos, entregar um pulso, pressionando o pedal uma vez.
  9. Retirar os eletrodos e limpe-os. Repita os passos de 4,6-4,9 com cada embrião.
  10. Após electroporating todos os embriões, derrame 3 ml de PBS para dentro da cavidade abdominal e devolvê-las para a cavidade abdominal.
  11. Primeiro sutura da parede abdominal com uma agulha curva e sutura de seda 5-0 e, em seguida, a pele. Aplicar lidocaína (4%) na ferida. Administrar 120 mg / kg de aspirina peritônio intra para analgesia.
    Nota: O procedimento completo deve ser realizado em 20 minutos ou menos. É aconselhável que os novatos só electroporate alguns embriões para manter o tempo de funcionamento curto. Cirurgias prolongadas vai diminuir a taxa de sobrevivência dos embriões.
  12. Remover o animal da tubulação de anestesia e permitir a recuperação da almofada de aquecimento em um papel wipe.
  13. Voltar animais para a jaula, mantê-lo no bloco de aquecimento a 37 ° C e monitorar o estado de saúde. Os animais geralmente toleram bem a cirurgia e começam a mover-se lentamente, logo depois de terem sido removidos do tubo anestesia. Se o sangramento ou letargia excessiva é observada, sacrificar o animal imediatamente realizando IACUC aprovado procedimentos de eutanásia, como a luxação cervical ou anestesia overdose.
  14. Voltar gaiola para o vivarium. As fêmeas dão à luz naturalmente.

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Resultados

Nós adaptamos a técnica de eletroporação in utero para atingir alvos específicos tipo de célula de neurônios vencimento. Para dirigir a expressão de GFP em interneurônios CGE derivados, foi utilizado o elemento potenciador Dlx5 / 6 e restrito nossas injeções para E15.5, a fase em que a maioria dos interneurônios CGE derivados são gerados. Realizou-se a análise em P8 e P15 11 (Figuras 1 e 2). Foi confirmada a origem ventral de neurônios eletroporados por co e...

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Discussão

Limitações da técnica

Embora esta técnica permite a célula de análise autônoma de processos celulares, não é adequado para análise da população. Os electroporations são muito escassos com menos de mil células eletroporados por cérebro. Como consequência, a técnica não pode ser utilizada para avaliar as consequências comportamentais resultantes da manipulação genética de interneurónios CGE-derivados.

Enquanto electroporações realizadas em subtipos alvo E13.5 E14.5...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Somos gratos a Lihong Yin para assistência técnica. NVD é um destinatário de um NARSAD Young Investigator Award e também é apoiada por doações da NIH (5 K99 MH095825-02). Pesquisa no laboratório Fishell é apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Saúde Mental (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) e da Fundação Simons.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Eletroporador com pedalEletrodos de pá Protech InternationalCUY21
5 mmProtech InternationalCUY650P5
Almofada de aquecimento ExtratorP30 DCT-15
Scientific Instrumentos Sutter 3282322
Sistemas de Anestesia FluovacAparelho Harvard726425
Tesoura de Operação Delicada 4.75" Reta Afiada/AfiadaRobozRS-6702
5-0 Trança de Seda Preta 18" C-1 Caixa 36 RobozSUT-1073-21
Micro Clip Aplicando Fórceps 5.5"RobozRS-5410
2 Tesouras de GrampoRobozRC-4894
Pinça de Fixação Ferramentas de Ciência Fina11031-15
Tubo capilar de vidro FHC27-30-0Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID
Fast GreenSigma-AldrichF7258 
Estéril PBSLife Technologies20012-027
de instrumentos Sutter da Kent

Referências

  1. Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
  2. Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
  3. Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
  4. Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
  5. Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
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