Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Kevin G. Chen; Rebecca S. Hamilton; Pamela G. Robey; Barbara S. Mallon

doi:10.3791/51519

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Artigo de método

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

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DOI:

10.3791/51519

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24 de julho de 2014

Kevin G. Chen¹ , Rebecca S. Hamilton¹ , Pamela G. Robey² , Barbara S. Mallon¹

¹NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, ²Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), com base no crescimento de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Este novo método, utilizando inibidores de quinase associados a Rho ou a isoforma de laminina 521 (LN-521), é adequado para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneos, manipulação genética e descoberta de medicamentos.

Resumo

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são uma grande promessa para medicina regenerativa e aplicações biofarmacêuticas. Atualmente, a cultura ideal e a expansão eficiente de grandes quantidades de hPSCs de grau clínico são questões críticas nas terapias baseadas em hPSC. Convencionalmente, as hPSCs são propagadas como colônias em sistemas de cultura alimentadores e livres de alimentadores. No entanto, esses métodos têm várias limitações importantes, incluindo baixos rendimentos celulares e geração de células heterogeneamente diferenciadas. Para melhorar os métodos atuais de cultura de hPSC, desenvolvemos recentemente um novo método, que se baseia na cultura de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Aqui, apresentamos protocolos NCM detalhados baseados no inibidor de quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632. Também fornecemos novas informações sobre a cultura de NCM com diferentes moléculas pequenas, como Y-39983 (inibidor de ROCK I), fenilbenzodioxano (inibidor de ROCK II) e tiazovivina (um novo inibidor de ROCK). Estendemos ainda mais nosso protocolo básico para cultivar hPSCs em proteínas extracelulares definidas, como a isoforma de laminina 521 (LN-521), sem o uso de inibidores de ROCK. Além disso, com base no NCM, demonstramos a transfecção ou transdução eficiente de DNAs de plasmídeo, partículas lentivirais e microRNAs baseados em oligonucleotídeos em hPSCs, a fim de modificar geneticamente essas células para análises moleculares e descoberta de medicamentos. Os métodos baseados em NCM superam as principais deficiências da cultura do tipo colônia e, portanto, podem ser adequados para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneas para futuras terapias clínicas, pesquisa com células-tronco e descoberta de medicamentos.

Introdução

A capacidade de se diferenciar em direção hPSCs tecidos adultos multilinhagem abriu novos caminhos para o tratamento de pacientes que sofrem de doenças graves que envolvem cardiovascular, hepática, pâncreas, e sistemas neurológicos ^1-4. Vários tipos de células derivadas de hPSCs também fornecem plataformas celulares robustos para modelagem de doenças, a engenharia genética, a seleção da droga, e ^1,4 testes toxicológicos. A questão-chave que garante suas aplicações clínicas e farmacológicas futuras é a geração de um grande número de hPSCs clínica de grau através de cultura in vitro de células. No entanto, sistemas de cultivo atuais são i....