Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridação em<em&gt; Xenopus</em

Resumo

O embrião de Xenopus laevis continua a ser excepcionalmente útil no estudo do desenvolvimento inicial devido ao seu grande tamanho e facilidade de manipulação. É fornecido um protocolo simplificado para o protocolo de hibridização in situ de montagem inteira que pode ser usado na identificação de órgãos específicos neste sistema modelo.

Resumo

Organogênese é o estudo de como os órgãos são especificados e, em seguida, adquirem sua forma e funções específicas durante o desenvolvimento. O embrião de Xenopuslaevis é muito útil para estudar a organogênese porque seu grande tamanho os torna muito adequados para identificar órgãos nas primeiras etapas da organogênese. Neste momento, o principal método usado para identificar um órgão ou primórdio específico é a hibridização in situ de montagem inteira com sondas de RNA antisense marcadas específicas para um gene que é expresso no órgão de interesse. Além disso, é relativamente fácil manipular genes ou vias de sinalização em Xenopus e a hibridização in situ permite testar mudanças na presença ou morfologia de um órgão-alvo. A hibridização in situ de montagem inteira é um protocolo de vários dias com muitas etapas envolvidas. Aqui, fornecemos um protocolo simplificado com número reduzido de etapas e reagentes usados que funciona bem para ensaios de rotina. Os robôs de hibridização in situ facilitaram muito o processo e detalhamos como e quando utilizamos essa tecnologia no processo. Uma vez concluída uma hibridização in situ, capturar a melhor imagem do resultado pode ser frustrante. Fornecemos conselhos sobre como otimizar a imagem dos resultados da hibridização in situ. Embora o protocolo descreva a avaliação da organogênese em Xenopus laevis, o mesmo protocolo básico pode quase certamente ser adaptado para Xenopus tropicalis e outros sistemas modelo.

Introdução

O padrão de expressão de um gene específico é uma informação importante para determinar o papel potencial desse gene no desenvolvimento de um órgão ou tipo de célula específico. Simplificando, se não for expresso na hora e no lugar certos, é improvável que desempenhe um papel fundamental. Em Xenopus, como na maioria dos embriões iniciais, o ensaio mais comumente usado para detectar a expressão de um gene é a hibridização in situ de montagem inteira usando sondas de RNA antisense marcadas. O uso de coloração de anticorpos para avaliar a expressão de um gene em Xenopus está se tornando mais comum à medida que os pesquisadores descobrem anticorpos, geralmente criados contra proteínas de mamíferos, que reagem de forma cruzada ao homólogo de Xenopus ou geram seus próprios ^1-3. No entanto, a grande maioria dos estudos sobre a organogênese de Xenopus ainda utiliza sondas de RNA antisense. Quando os anticorpos são usados, cada anticorpo individual geralmente requer otimização para os protocolos primários de concentração ou fixação de anticorpos. Em contraste, o protocolo para hibridizações in situ é essencialmente invariante para diferentes sondas. O conceito básico é relativamente simples e um excelente protocolo padrão foi bem estabelecido ⁴. Nosso protocolo é uma versão simplificada do protocolo original ⁴ que ainda fornece excelente detecção de padrões de expressão gênica no embrião inicial. Os embriões são fixados e então preparados para hibridização, alterando soluções e temperaturas de modo que permita a ligação de alta rigidez da sonda de RNA antisense marcada ao seu mRNA alvo. A sonda não ligada é lavada e os embriões são então preparados para a ligação de um anticorpo contra o rótulo nas sondas de RNA. O excesso de anticorpos é então lavado e uma reação enzimática de cor é usada para localizar onde a sonda de RNA está ligada ao embrião. Existem agora várias linhas transgênicas de Xenopus que impulsionam a expressão de proteínas fluorescentes em tecidos específicos e estão disponíveis nos centros de estoque de Xenopus, como o National Xenopus Resource em Woods Hole. Embora muito útil para muitos experimentos que exigem o exame da organogênese em embriões vivos, essa opção requer alojamento separado para as linhagens transgênicas.

A hibridização in situ pode delinear claramente onde órgãos ou tipos de células específicos se formarão no embrião inicial (Figura 1). A técnica é notavelmente sensível, uma vez que se pode detectar a expressão gênica em um pequeno número de células em um único embrião ⁵. No entanto, a hibridização in situ usando a intensidade da coloração colorimétrica não é considerada quantificável porque a reação de cor não é linear. Apesar da dificuldade em quantificar a intensidade da coloração, as mudanças na expressão são frequentemente bastante perceptíveis; particularmente quando a hibridização in situ mostra aumentos ou diminuições quantificáveis no tamanho dos domínios de expressão ^6,7.

As vantagens claras da hibridização in situ de montagem inteira a tornam um ensaio crítico no estudo do desenvolvimento inicial. No entanto, é demorado e requer muitas etapas ao longo de vários dias. Este protocolo é uma versão simplificada do protocolo padrão que elimina várias etapas sem reduzir a qualidade do resultado in situ. A simplificação também elimina fontes de variabilidade, facilitando a solução de problemas se uma hibridização in situ não for ideal. Especificamente, eliminamos o uso de tratamentos com proteinase K e RNAse do embrião, duas etapas que podem depender da qualidade do reagente e também podem reduzir a intensidade do sinal se exageradas. O protocolo também oferece algum grau de economia de custos devido à eliminação do uso de vários reagentes. Finalmente, este protocolo também fornece algumas diretrizes simples para melhorar a captura de imagens de resultados de hibridização in situ. Embora este protocolo seja otimizado para trabalho em embriões de Xenopus, é provável que pelo menos algumas das simplificações sejam aplicáveis ao trabalho de hibridização in situ em outros sistemas embrionários.

Protocolo

1. Preparação Embryo

1. Se não for feito rotineiramente como parte da cultura de embriões, de-geléia os embriões com 2,5% de cisteína, pH 8,0 antes da fixação ^8. Embora não seja absolutamente necessário, é útil para, em seguida, remover manualmente o envelope fertilização antes da fixação utilizando fórceps finos.
   1. Use pipetas de Pasteur de vidro para transferir os embriões. A pipeta não é grande o suficiente para transferir os embriões assim usar uma caneta de diamante para cortar a pipeta de vidro em um ponto grande o suficiente para pegar um embrião. Eliminar as arestas vivas das pipetas depois do corte, passando rapidamente a ponta de corte através da chama do bico de Bunsen para fundir as bordas afiadas.
      NOTA: Cuidado deve ser tomado, como o vidro ainda pode ser quente o suficiente para causar queimaduras, mesmo que parece ter arrefecido por inspeção visual.
2. Realize a fixação do embrião nos estágios. Em primeiro lugar, preparar frascos de vidro para utilização na fixação de embriões. Use esses frascos para todas as etapas, incluindo finaisarmazenamento. Use frascos que são claras com uma boa vedação de teflon na tampa, permitindo o acompanhamento dos embriões durante todas as etapas do processo. Rotular os tubos de ensaio com informação experimental apropriado utilizando marcador permanente e, em seguida cobrir a etiqueta com fita adesiva transparente, como mesmo marcador permanente será perdida durante o decurso do processo, devido à utilização de álcoois e outros solventes.
   1. Use Mempfa para fixar os embriões. Fazer um stock de 8% de paraformaldeído em lotes de 50-100 ml de cada vez. Usar cerca de 75% de H ₂ O e necessária de calor para 50-60 ° C, o que é necessário para obter o paraformaldeído em solução.
      NOTA: Esta solução é um pouco diferente do que o Memfa utilizado em versões mais antigas protocolo publicado na medida em que utiliza paraformaldeído em vez de formaldeído.
   2. Adicionar 2-3 gotas de NaOH 10N ou até pH é de cerca de 7,5 (o uso de papel de pH para verificar o pH). Paraformaldeído é muito tóxico, portanto, gerar a solução estoque em um exaustor. Uma vez que o paro formaldeído é em solução, filtra-se a solução através de papel Whatman para um recipiente fresco e adicionar H ₂ O para o volume final. Se necessário, armazenar a solução de paraformaldeído a 4 ° C durante 1-2 semanas.
   3. Montar os componentes restantes da solução de fixação Mempfa (Tabela 1). Certifique-se que a concentração de trabalho final de paraformaldeído é de 4%. Guarde todos os componentes da solução de fixação a 4 ° C como ações.
   4. Usando uma pipeta de vidro de corte, fixar os embriões adicionando os embriões para os frascos de vidro marcados que tenham sido cheias com aproximadamente 3-4 ml de solução Mempfa (Tabela 1). Evitar que fixa mais do que 20-30 embriões por frasco. Adicionar os embriões com um mínimo de transferência de líquido a partir do meio do embrião. Fix embriões em solução Mempfa durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
   5. Para estruturas endoderme final realizar o in situs manualmente isoladas do intestino e endoderme derivados ^9,10, O que permite uma boa penetração da sonda e também evita a coloração cavidade.
   6. Armazenar uma solução de metanol a 100% a -20 ° C. Após a fixação paraformaldeído, substituir a solução Mempfa com aproximadamente 4 ml de -20 ° C, 100% de metanol para o armazenamento dos embriões.
   7. Agitar os frascos, após a adição de metanol para evitar que os embriões se colem ao vidro ou outros embriões. Além disso, certifique-se os frascos são hermeticamente fechado, porque o metanol pode evaporar no congelador ao longo do tempo se solta.
      NOTA: Os embriões podem ser armazenados durante pelo menos um ano, e mais provável, no metanol, antes de corar com nenhuma perda de qualidade na hibridização in situ.

2. Preparação Probe

1. Use 1-2 mg de DNA molde para fazer as sondas marcadas com digoxigenina. Cortar o plasmídeo contendo a sequência de ADN apropriada na extremidade 5 'do gene de interesse com uma enzima de restrição adequada para that vector para gerar sondas anti-sentido.
   NOTA: O plasmídeo deve ter um local de ligação de polimerase de ARN adequado (por exemplo, T7, T3, ou SP6).
2. Permitir que o ADN, a água, de mistura de NTP e tampão de polimerase aquecer até à temperatura ambiente, antes de montar a reacção de síntese da sonda. Adicionar os componentes da reacção de síntese de ARN a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml na ordem listada na Tabela 2. Ajustar o volume de água adicionado para levar o volume total da reacção de síntese da sonda para 20 ul. Montar a reacção à temperatura ambiente, porque os componentes do tampão de polimerase pode precipitar o ADN molde quando em concentrações elevadas e frio.
3. Incubar a reacção de transcrição durante 2 horas a 37 ° C.
   NOTA: As incubações de pouco mais de duas horas leva à inexistência de efeitos adversos, mas também mostram pouco maior rendimento. Se incubada durante uma hora, o rendimento será reduzido, mas ainda suficiente para uma boa sonda.
   1. Enquanto espera para a reacção de transcrição para acabamento, fazer um gel de agarose que vai ser utilizado para testar a qualidade da sonda. Melt 1 ug de agarose em 100 ml de tampão 1 x TAE (ver Tabela 1) por aquecimento da solução até ao ponto de ebulição. Remover a solução de calor, quando o pó de agarose estar completamente dissolvida.
   2. Adicionar 2 mL de brometo de etídio solução-mãe (10 mg / ml) até cerca de 100 ml de gel de agarose, quando a agarose foi arrefecida até cerca de 60 ° C para permitir a visualização de ARN sob luz ultravioleta (UV).
      NOTA: esta solução de gel de agarose pode ser mantido numa incubadora a 60 ° C de modo que os géis futuros pode ser vertida sem derreter repetido. Tome cuidado ao manusear o brometo de etídio, devido à toxicidade potencial.
4. Adicionar 1 mL DNAseI (grau livre de RNAse) para a reacção de transcrição, após a incubação de 2 horas e incubar durante mais 10 min a 37 ° C para eliminar o ADN molde.
5. Retirar 1 mL da mistura de reacção paraverificar a 1% de gel de agarose-TAE e para o resto (20 mL) adicionar 80 ul de SDS a 1% em tampão TE (Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM), 10 ul de 5M _de NH ₄ etilo, e 220 ​​ul etanol de frio. Vortex a mistura vigorosamente e reserve em gelo até os resultados da verificação de qualidade RNA são conhecidas.
   1. Executar os 1 ul de RNA removidos antes da precipitação sobre o gel a 1% de agarose-TAE. Para facilitar o carregamento do gel, adicionar 4-5 mL de água e 1 ul de corante de carregamento padrão para o RNA. Ver o RNA no gel utilizando um transiluminador de luz UV a fim de verificar a qualidade da sonda (ver discussão).
6. Precipitar o RNA restante que foi posto de lado no gelo na etapa 2.5, girando em uma microcentrífuga a toda a velocidade para 10 a 15 min. Decantar o sobrenadante com uma pipeta de vidro retirado e deixa-se secar brevemente.
   1. Ressuspender a sonda com 1 ml de tampão de hibridação de ARN (Quadro 1) no tubo eppendorf. Vortex e briefly aquecer o tubo a 37 ° C e novamente vórtice. Transferir a solução de sonda para um parafuso 15 ml tampa do tubo de poliestireno e enche-se a 7-10 ml com tampão de hibridação de ARN. Nota: A sonda pode ser mais diluída (a 10 vezes mais diluição ainda pode trabalhar), muitas vezes resultando em baixa de fundo, mas as reações de coloração também vai demorar mais tempo.

3. Hibridação in situ

1. Toma os embriões que foram armazenadas em metanol -20 ° C e deixa-se aquecer até à temperatura ambiente. Realize todo o procedimento nos frascos de vidro. Se diferentes embriões de um grupo vão ser olhado por diferentes sondas, mantê-los em um único frasco até pouco antes das sondas são adicionados para reduzir a variabilidade e de trabalho no primeiro dia.
   1. Reidratar os embriões por meio de uma série de metanol como indicado na Tabela 3 (ver Tabela 1 para as receitas de lavagem) em preparação para a adição da sonda. Agite suavemente o EmbryOS após cada alteração para garantir que eles não estão aderindo às paredes ou outro, e balançar os embriões montando os frascos em um nutator. Ao transferir os líquidos, verificar o interior das tampas para garantir que os embriões não foram presos lá.
   2. Uma vez na solução de sonda, hibridar os embriões durante a noite, como descrito na Tabela 3.
2. Remover a solução de sonda. Salve a sonda usada por armazenar em um 15 ml parafuso tubo de poliestireno cap, marcado com a data eo número de vezes que a sonda tem sido usado, a -20 ° C.
   NOTA: A mesma sonda pode ser reutilizado muitas vezes, para posterior hibridações in situ até que as reações colorimétricos começam a tomar um tempo anormalmente longo para chegar a intensidade desejada.
   1. Uma vez que a sonda é removida, preparar os embriões para coloração de anticorpos contra a sonda através de uma série de lavagens descritos na Tabela 4. Mudar a temperatura, conforme necessário (Tabela 4) por t movendoele nutator, com frascos de embriões em anexo, diretamente em fornos de hibridização que estão definidos para a temperatura adequada.
   2. Perfaz-se o volume apropriado do MAB + HTSS + BR + anti-Dig anticorpo (Quadro 4) no momento em que os embriões são incubadas no MAB + HTSS + BR solução de bloqueio de modo a que o anticorpo é bloqueada antes da adição ao embriões. Faça as soluções de bloqueio fresco no dia da utilização.
3. Remover a solução de anticorpos e começar lavagens como descrito na Tabela 5 a seguir à incubação durante a noite com anticorpo. Executar, pelo menos, doze lavagens de 30 min de modo a preparar-se para a coloração com o substrato de fosfatase alcalina e reduzir o fundo tanto quanto possível. Use um tampão MAB ou solução de TBT (Tabela 1) para as etapas de lavagem.
   NOTA: solução TBT é TTW que tem de 2 mg / ml de BSA adicionado.
   1. Substituir a última solução de lavagem com o substrato de fosfatase alcalina Roxo BM. Execute as reac coloraçãoção quer à temperatura ambiente ou a 37 ° C.
      NOTA: A coloração é mais rápida a 37 ° C, mas se for deixado durante a noite, o fundo inaceitável coloração pode muitas vezes ser um resultado. As reações de coloração, muitas vezes, exigem coloração durante a noite e a temperatura ambiente é mais seguro para isso.
   2. Se ainda mais a coloração é necessária e a solução de púrpura BM está a assumir uma cor azul, substitua a solução de coloração com frescos BM roxo e colocar os tubos em 37 ° C. Se o mRNA alvo é muito abundante, colocar os embriões na solução de coloração, a 4 ° C durante a noite e, em seguida, mover os embriões à temperatura ambiente ou a 37 ° C para permitir um melhor acompanhamento da reação de coloração.
   3. Monitorar novas reações com cuidado, pois o tempo para resultado final varia consideravelmente entre os diferentes RNAs alvo. Para consistência, parar a reacção de coloração (ver 3.4), quando não há novos locais de expressão resultante com mais tempo de incubação. É importante notar que se a hibridização in situ está a ser utilizado como um ensaiopara experimentos olhando para diferentes grupos de tratamento, usar o mesmo tempo para reações de cor entre embriões de tratamento e controle.
4. Parar a reacção de coloração e preparar os embriões para o armazenamento e gravação de imagem, alterando os líquidos como indicado na Tabela 6. Não agitar os embriões nesta fase devido à remoção de mancha pode ser visualizado como coloração púrpura do metanol em torno dos embriões.
   NOTA: Muitas vezes os embriões têm uma coloração azul clara a partir da solução de coloração e o metanol frio pode remover, pelo menos parcialmente, que, apesar de este não é suficiente para remover a coloração de fundo pesado ou cavidade. Metanol frio refere-se a metanol, que é mantido num congelador a -20 ° C.
   1. Reidratar os embriões e corrigir a mancha com Mempfa (Tabela 6). Uma vez fixo, remover a Mempfa e lavar os embriões com 25% de metanol.
   2. Remover o metanol a 25% e adicionar a solução de branqueamento se a remoção de pigmento endógenoé necessário. Tome cuidado ao manipular a solução branqueadora, pois pode causar queimaduras. Observar o branqueamento de perto como acontece relativamente com rapidez e o grau de branqueamento pode ser variado para diferentes efeitos (Figura 2).
   3. Desidratar embriões através de uma série de metanol a 100% de metanol para o armazenamento a longo prazo na sequência de branqueamento, ou para transferir PBS durante o armazenamento a curto prazo e de imagem subsequente (ver Tabela 6).

4. Imagem Embriões

1. Uma vez que o embrião tenha concluído o processo de coloração, a imagem do embrião para que as informações sobre onde o gene de interesse é expressa é capturada por um público mais vasto. Use 1% agarose como pano de fundo para visualizar os embriões não apurados.
   NOTA: A agarose dá um fundo azul / cinzento que contrasta com o embrião e a cor azul da reacção de coloração. Ele também ajuda a difundir sombras que distraem e reflexões que desviam a atenção do embrião.
   1. Adicionar agarose a água e, em seguida, deixe ferver até que a agarose é em solução e, em seguida, deixe esfriar até 50 antes de derramar em placa de Petri. Tal como acontece com a solução de gel de TAE, armazenar a solução de agarose em 55 ° C incubadora para usos múltiplos. Verter a agarose até uma profundidade de cerca de 2 mm na placa de Petri. Se necessário, ajustar a profundidade de agarose para se obter um matiz ligeiramente diferente do fundo.
   2. Após re-hidratação do armazenamento em metanol a uma solução aquosa (PBS ou TTW), usando uma série de metanol, colocar os embriões numa placa de Petri com a base de agarose (ver Tabela 6). Manter a solução limpa e, se necessário, usar a filtragem simples para eliminar as partículas pequenas que podem prejudicar o fundo limpo de boas imagens.
   3. Para os embriões de imagem vistas alternativas, tais como a partir do lado ventral, cortar canais finos na agarose para encaixar o embrião utilizando um fórceps fino e colocar os embriões nos canais para orientação (Figura 3 ). Tome cuidado na manipulação dos embriões, pois são facilmente danificados.
      NOTA: A maioria das fases têm uma posição característica que assumiria quando é colocada em solução. Por exemplo, os embriões blastula estágios tendem a se sentar animais para cima. Uma vez que os embriões começam a alongar, eles colocam do lado deles.
2. Use a fonte de luz de fibra óptica para iluminar o embrião de um ângulo raso, criando sombras sobre o embrião, que conferem profundidade à imagem e ajudar a discernir estruturas superficiais. Porque branqueamento pode eliminar pigmento que fornece pontos de referência úteis, use sombra para os embriões fortemente branqueadas.
3. Limpar os embriões para coloração de imagem que é profundamente dentro do embrião, tais como nas notocorda, pulmão, ou regiões do cérebro, (Figura 4). Para conseguir isso, colocar os embriões através de uma série de metanol até que em 100% de metanol.
   1. Após a imersão completa em metanol, transferir os embriões para uma solução de uma parte de álcool benzílico e duas partes de benzilo sernzoate (BABB). Os embriões inicialmente flutuar na superfície, mas como o metanol mistura com o BABB, eles irão afundar-se no BABB. Execute cada passo lidar com BABB em frascos de vidro ou pratos; BABB vai derreter qualquer plástico ou pintura.
   2. Depois de limpo, ver os embriões com luz transmitida vindo de baixo do embrião. Ajustar a intensidade da luz, bem como o ângulo a partir de baixo para melhorar o contraste e proporcionar a melhor cor.
   3. Ao ver embriões desmatadas levantar a placa de Petri de vidro para fora da base. Para fazer isso, simplesmente usando duas outras tampas prato petri para elevá-la para que a região do prato com embriões é elevado.
      NOTA: Isto tem a vantagem de ter a base fora de foco e eliminar efeitos de distração de imperfeições ou manchas na base do microscópio que pode interferir com a imagem.

5. Faça duplo de hibridização in situ

1. Para visualizar simultaneamente o padrão de expressão two diferentes genes de um único embrião, sintetizar duas sondas, uma para cada um dos diferentes genes. Sintetizar uma sonda utilizando DIG-UTP-11 como um rótulo como descrito acima. Dilui-se o produto da reacção de transcrição de ARN em tampão de hibridação, para se obter uma sonda de 3x mais concentrada do que a utilizada para o único hibridações in situ.
   1. Sintetizar a outra sonda de interesse, utilizando o mesmo protocolo como para DIG rotulados sondado excepto que fluoresceína-12-UTP deve ser substituído por DIG-11-UTP. Dilui-se o produto da reacção de transcrição de ARN em tampão de hibridação, para se obter uma sonda de 3x mais concentrada do que a utilizada para o único hibridações in situ.
   2. Misturar as duas sondas concentradas em uma proporção de 1: 1. Para melhores resultados, utilizar a sonda marcada com fluoresceína para o gene que mostra a expressão mais forte no único no protocolo de hibridação in situ.
2. Use o mesmo protocolo na hibridização in situ descrito para única in situ </ Em> hibridações, excepto o uso da sonda dupla (contendo a sonda de 1,5x mistura concentrada de sondas marcadas com digoxigenina e marcados com fluoresceína) no final do primeiro dia em lugar de uma única sonda de hibridação in situ.
   1. Seguir o protocolo de hibridação único no segundo dia do protocolo duplo em hibridização in situ, excepto fragmentos utilização anti-fluoresceína-AP Fab a uma diluição de 1: 4000 no lugar de fragmentos anti-DIG-AP Fab. Lavar o excesso de anticorpos a partir do embrião como no single no protocolo situ e realizar a primeira reação de cor utilizando o substrato BM-Purple AP.
3. Seguindo a reacção de cor primeiro, inactivar o anticorpo fluoresceína em glicina 0,1 M pH 2,0 durante 40 min, seguido de cinco lavagens em dez mínimo de MAB. Bloqueie os embriões no MAB + HTSS + BR por 90 min. Adicionar o anticorpo anti-DIG a uma diluição de 1: 2.000 em MAB + HTSS + BR e incubar a 4 ° C durante a noite.
   1. No dia seguinte, lavar os embriões thoroughly em MAB (12 lavagens de 30 min) para remover o excesso de anticorpo.
   2. Lavar os embriões durante 10 min em tampão de AP (Tabela 1) e, em seguida, cora com BCIP (0,5 mg / ml em tampão de AP).
      NOTA: O em combinação situ deve dar uma coloração azul-púrpura escuro para a primeira reacção de cor e uma reacção de cor azul claro para a segunda (Figura 5).
   3. Parar a reacção de cor final, através da remoção do tampão de AP e lavar três vezes com MAB. Corrigir os embriões com Mempfa para 10 min. Lavar os embriões com 5 lavagens rápidas em MAB ou TBT.
   4. Com esta combinação de cor, o uso de metanol nos tratamentos pós de coloração já não é possível, uma vez que irá eliminar a cor BCIP sozinho. Armazenar os embriões após coloração e fixação em PBS com azida de sódio a 0,02%. Intensidade de coloração pode ser fraco com duplo em situs. Se isto é um problema, reduzir as lavagens de quatro, cada duração de 2 h.

Resultados

A utilização de sondas específicas de tecido podem fornecer informações de destaque no que diz respeito ao estado de desenvolvimento para órgãos específicos. Nos exemplos a seguir, a fase do embrião é baseado na tabela estadiamento Nieuwkoop e Faber a ^11. Se alguém usa genes formulário sondas expressas após a diferenciação, troponina I cardíaca na fase 28-30, por exemplo (Figura 1C), a presença ou o tamanho de um órgão diferenciado pode ser avaliado em qualquer diferenciação fase pos...

Discussão

A capacidade para utilizar em hibridação in situ para visualizar o padrão de expressão de genes específicos é o método mais vulgarmente usado para identificar os órgãos ou tipos de células específicas do embrião de Xenopus. Isto é por causa de diversas vantagens oferecidas por esta técnica. A expressão de um gene pode identificar estruturas específicas bem antes de qualquer sinal histológicas de diferenciação, tais como o caso para a expressão em Nkx2.5 os progenitores do coração ante...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agitadores de tubos Labguake	VWR	17-08-2011
Frascos VWR	VWR	10-07-2012
L-cisteína		BioShop CYS342.500
Conjunto de trifosfato de ribonucleosídeo, 100mM	Roche	11277057001
Digoxigenina-11-UTP	Roche	11209256910
inibidor Rnase (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA Polimerase	Fermentas	EPO111
T3 RNA Polimerase	Fermentas	EPO101
SP6 RNA Polimerase	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
Soro de Ovelha	Wisent	31150
Reagente bloqueador	Roche	11096176001
BM roxo Ap Substrato	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenina-Ap Feb fragmentos	Roche	11093274910
Metanol	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldeído	BioShop	PAR070.500
Formamida	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
Ácido Maleico	VWR	CAMX0100-3
citrato de sódio tri-sódio	BioShop	CIT001
Peróxido de hidrogênio (solução a 30%)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Álcool Benzílico	Sigma	B-1042
Benzoato de Benzila	Sigma	B-6630
Agarose UltraPure	Invitrogen	16500-500