Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.
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Artigo de método
Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embriões de peixe-zebra são uma poderosa ferramenta para a triagem em larga escala de pequenas moléculas. Zebrafish transgênicos que expressam proteínas repórter fluorescentes são freqüentemente usados para identificar os produtos químicos que modulam a expressão do gene. Telas químicas que ensaio de fluorescência no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados para rastreio de alto conteúdo. Nós descrevemos um procedimento usando um microscópio de epifluorescência padrão com um palco motorizado a imagem automaticamente embriões de peixes-zebra e detectar a fluorescência de tecido específico. Usando zebrafish transgênicos que relatam a atividade do receptor de estrogênio via expressão de GFP, foi desenvolvido um processo semi-automatizado para triagem de ligantes do receptor de estrogênio que ativam o repórter de uma forma específica de tecido. Neste vídeo, descrevemos os procedimentos para arraying embriões de peixe-zebra em 24-48 horas pós fertilização (hpf) em uma placa de 96 poços e adicionando pequenas moléculas que se ligam receptores de estrogênio. Em 72-96 hpf, imagens de cada poço a partir detoda a placa são coletados automaticamente e inspecionados manualmente para fluorescência de tecido específico. Este protocolo demonstra a capacidade para detectar os estrogénios que activam os receptores de válvulas cardíacas, mas não no fígado.
Introdução
Paulistinha transgênico foram desenvolvidos que permitem a visualização direta de atividade em vias de sinalização, como fatores de crescimento de fibroblastos 1, o ácido retinóico 2 e 3 estrógenos, em embriões vivos. Estas ferramentas permitem o rastreio de produtos químicos que perturbam as vias de sinalização (ensaiado como uma mudança na intensidade de fluorescência) ou por produtos químicos que modulam a sinalização de um modo específico do tecido (alteração na fluorescência de localização) 4. Captura de imagem automatizado aumenta a taxa de transferência de telas químicas dramaticamente 5,6. Telas que fluor....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Alabama em Comitê Animal Care e Use Institucional Birmingham.
1. Breeding Zebrafish e ovo Coleções
- Três dias antes do início da exposição a produtos químicos, montar tanques de criação com divisórias para machos e fêmeas separados. Encha cada metade do caminho tanque com água do sistema de aquicultura. Usando uma rede, transferir Tg (5xERE: GFP) peixe c262/c262 para tanques de criação, colocando 2 machos e 3 fêmeas em cada tanque separado por uma divisória. Coloque uma tampa em cada tanque e etiqueta com data e as tensões a serem cruzados. ....
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Resultados
A Figura 1 mostra imagens compósitas a partir de poços individuais de uma placa de 96 poços. Cada imagem composta é composta de 59 imagens individuais com 5% de imagem de sobreposição. Note-se que o peixe-zebra vivos são orientadas aleatoriamente dentro de cada poço, ainda que são capazes de distinguir da fluorescência no coração a partir do fígado. Imagens de campo claro, são úteis como referências para avaliar a orientação peixe-zebra e visualizar anormalidades morfológicas (Figuras 1A e 1C).<.......
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Discussão
Este protocolo descreve um método simples para automaticamente a imagem de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra. O protocolo foi desenvolvido utilizando uma Zeiss Axio Observer. Z1 com software Zen azul 2011, no entanto, a técnica pode ser adaptada usando qualquer microscópio invertido com uma platina motorizada e software de controlo do microscópio que possa realizar a telha para criar imagens compostas. Equipar um microscópio invertido com um palco motorizado pode fornecer uma alternativa prát.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos Susan Farmer e os funcionários do centro de pesquisa do peixe-zebra UAB para cuidado zebrafish. O financiamento é fornecido pelos fundos de start-up do Departamento de Farmacologia e Toxicologia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pipetas de transferência de plástico; furo largo | Fisher | 13-711-23 | |
| Pipetas de transferência de plástico; ponta fina | Fisher | 13-711-26 | |
| Placas de 96 poços, redondas, de fundo plano | Fisher | 21-377-203 | |
| Placas de 100 x 35 mm | Fisher | 08-757-100D | |
| Placas de 35 x 60 mm | Fisher | 08-757-100B | |
| Pinça fina Dumont #5 | Ferramentas de Ciência Fina | 11254-20 | dimensões da ponta 0,05 x 0,01 mm, para remover manualmente córions de embriões |
| Tricaine metanossulfonato | Sigma Aldrich | A5040-25G | veja o Livro do Zebrafish para receita (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-fenil 2-tioureia (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare estoque de 20 mM (100x) e use a 200 μ M em E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | O protocolo Carl Zeiss | requer um microscópio de fluorescência invertida com uma platina motorizada | |
| Objetiva de longa distância de trabalho de 20x | Carl Zeiss | Usamos uma objetiva com 0,4 NA e 8,4 mm de distância de trabalho | |
| Câmera digital Axiocam HRm | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 software de controle de microscópio | Carl Zeiss | O protocolo requer software de automação e controle de microscopia para permitir a captura de imagens lado a lado usando um estágio motorizado | |
| Azul de Metileno | Sigma Aldrich | MB-1; 25 gramas | fazem solução a 2% em água RO para uso em E3B (abaixo) |
| E3B | 60X E3 SOLUÇÃO: NaCl - 17,2 gramas KCl - 0,76 gramas CaCl2-2H2O - 2,9 gramas MgSO4-7H2O - 4,9 gramas ou MgSO4 - 2,39 gramas Dissolver em 1 litro de água Milli-Q; armazenar em frasco estéril de 1 litro. 1X E3B SOLUÇÃO PARA PEIXE-ZEBRA: 60X E3 150 ml 2% azul de metileno 100 μ l Leve para 9 litros com água Milli-Q |
Referências
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene exp....
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Reimpressões e permissões
