Den här artikeln beskrivs en metod för att generera chimära embryon som är utformade för att testa artspecifika bidrag neurallisten och / eller annan vävnad till kraniofaciala utveckling.
Den generation av chimära embryon är ett utbrett och kraftfull metod för att studera cellöden, vävnadsinteraktioner och artspecifika bidrag till histologiska och morfologiska utvecklingen av ryggradsdjur embryon. I synnerhet har användningen av chimära embryon etablerat betydelsen av neural crest att rikta artspecifik morfologi craniofacial komplex. Förfarandet som beskrivs häri utnyttjar två fågelarter, anka och vaktel, med anmärkningsvärt annorlunda craniofacial morfologi. Denna metod underlättar i hög grad utredning av molekylära och cellulära reglering av artspecifikt mönster i kraniofaciala komplexet. Experiment i vaktlar och Anka chimära embryon har redan avslöjat neurallist-medierad vävnadsinteraktioner och cell-autonoma beteenden som reglerar artspecifika mönster i kraniofaciala skelett, muskulatur, och hölje. Den stora mångfalden av neurallist derivat tyder på betydande potentialför framtida tillämpningar av vaktel-anka chimär systemet att förstå ryggradsdjur utveckling, sjukdom, och evolution.
Den ansiktsskelett till tillväxt och fusion av flera ansikts processer som är sammansatta av neurallisten och mesodermalt mesenkym omgiven av ektodermala och endodermala epiteliala skikten 1-11. Morfogenetiska händelser inom varje process styrs av distinkta signalerings interaktioner mellan mesenkymet och omgivande epitel 12-16. Ändringar av dessa signalerings interaktioner och / eller deras nedströms effekten bidrar till sjukdoms fenotyper och kan också ha betydelse för utvecklingen av det kraniofaciala skelettet 17, 18. Därför belysa hur och av vävnadsinteraktioner har stor potential för att öka vår förståelse för utvecklings-och evolutionsbiologi av ansiktsskelettet.
Användningen av chimära embryon för att undersöka vävnadsinteraktioner har en lång historia i utvecklingsbiologi. Detta tillvägagångssätt var uppfunnen av Hans Spemann och hans labbsom upptäckte embryonala "arrangörerna" genom att transplantera vävnad mellan embryon av olika grodarter. Spemann var en mästare på mikro-kirurgiska tekniker vars hand-kompetens kompletterades av hans utveckling av särskilda verktyg, särskilt Spemann pipett. Viktor Hamburger var doktorand i laboratorium av Hans Spemann i Freiburg under 1920-talet, vilket är när originaltransplantationsexperiment som ledde till Spemann Nobelpris utfördes. När Hamburger flyttade till Washington University i St Louis 1935, detaljerade han processen att göra en Spemann mikropipett i sin handbok för experimentell embryologi 19. Drew Noden var en doktorand i Hamburger labb vid Washington University fram till 1972. Efter att ha flyttat till University of Massachusetts, Amherst och sedan till Cornell University, Noden fortsatte tillverka och använda Spemann mikropipetter för sina kirurgiska transplantationer involverar vaktel-chick chimärer. &# 160;. Medan en doktorand, en av författarna (Rich Schneider) tränade med Drew Noden vid Cornell 1995-1998 Följande protokoll för att göra en Spemann mikropipett bygger på beskrivningar skrivna av hamburgare och Noden, och innehåller följande ändringar som gjorts Schneider.
Användningen av vaktel-chick chimärer för studier av kraniofaciala utveckling och framför allt för att förstå de bidrag neurallistceller var uppfunnen av Noden och Le Douarin i början av 1970-talet, över i Le Douarin et al 20. Detta tillvägagångssätt har i stort sett antagit i många studier och av många andra forskare 1, 4, 5, 21-38. Motsvarande tillväxttakt och morfologi av vaktlar och chick gör transplantationer inom dem idealiska för studier av cellens öde och härstamning spårning. Men på grund av likheterna mellan vaktel och chick, morfologiska förändringar induced av donatorceller är svåra att tyda. Däremot har andra fågel chimära system ingår inhemska anka som ett sätt att studera mekanismer som gör embryon anatomiskt distinkta 39-50. Mer specifikt erbjuder vaktel-anka chimär systemet flera fördelar för kräsna effekterna av givaren på värden, och vice versa. Först, vaktlar och Anka embryon är avgränsade i kroppsstorlek och form, vilket ger ett direkt sätt att utforska donator-eller värdspecifika mekanismer för mönsterbildning genom analys av differential domäner av genuttryck (figur 1 A och B). För det andra, vaktlar och Anka embryon har avsevärt olika takt av mognad, med vaktel kläckning i 17 dagar och anka kläckning i 28 dagar. Transplanterade neurallist behåller sin inneboende mognadstakt i värdmiljön, och därmed är det möjligt att identifiera tidsmässiga förändringar i genuttryck, vävnadsinteraktioner, histogenes och morphogenesis51-57. Slutligen har den anti-vaktel nukleär antikropp (Q ¢ PN) tillåter donator-och värd cellulära bidrag vara permanent särskiljas från varandra genom att känna igen ett protein, som ubiquitously uttrycks i vaktel celler men frånvarande från anka celler.
Neurallisten är en transient embryonisk cellpopulation som huvudsakligen sprids i stor omfattning i hela embryot och differentierar in i olika celltyper, inklusive kondrocyter och osteoblaster, som bidrar till den kraniofaciala skelettet. Transplantation neurallist i vaktel-anka chimär systemet har starkt bidragit till vår förståelse av vävnadsinteraktioner och signalvägar som reglerar utvecklingen av det kraniofaciala skelettet. Men med tanke på den stora potential neurallisten att även generera glatta muskelceller, adipocyter, melanocyter, Schwann celler och neuroner, har vaktel-anka chimär systemet enorm potential för framtida tillämpningar, särskilt i samband med den snabba utvecklingen av stamcellsbiologi och regenerativ medicin. Eftersom vaktel och anka är både kommersiellt uppfödda arterna, finns en färdig leverans av relativt billiga befruktade ägg från en mängd olika gårdar. Sålunda bör denna teknik vara tillgängligt för researchennes verksamma inom en rad olika budgetar och anläggning utrymme.
Även om denna teknik är mycket kraftfull, finns det fortfarande ett antal begränsningar. Liksom andra kirurgiska tekniker, kvalitet och hållbarhet på vaktel-anka chimärer är beroende av de kirurgiska kompetensen hos forskaren, och därför kommer det att finnas mer inter-och intra-individuell variation mellan experiment som jämfört med andra modeller, t.ex. de som använder musen genetik. Dessutom finns det även variationer i frekvensen av utveckling och stadier av enskilda embryon som bidrar till reproducerbarhet och framgång för varje transplantation. Fågelembryon är också mycket känsliga för uttorkning och därmed kritiska steg under operation inkluderar hålla ljusnivåerna låga, tiden under mikroskop till ett minimum, äggen förseglade med tejp så mycket som möjligt, och hög luftfuktighet i det postoperativa inkubator till undvika uttorkning.
När det gäller lönsamheten av chimärer, usually mellan 50-75% överlever, även om dessa procentsatser kan minska den äldre samlingen scenen. I en typisk 4-6 tim session kirurgi, kan en erfaren kirurg generera 10-15 chimärer. Framgången för transplantat beror också i hög grad på kvaliteten på de verktyg. Bra verktyg leda till mer konsekventa, reproducerbara resultat. Med hjälp av en gasolbrännare för att göra volfram nålar låter extremt vassa nålar som ska göras. Den typ av ficklampa som används gör stor skillnad eftersom det styr storleken på flamman. Elektrolytisk skärpning kan också användas, men detta tillvägagångssätt är inte ens nära att producera nålar som skarp. Använd volfram stavar istället för buffras tråd så att nålarna kan göras direkt.
Den Spemann mikropipett, medan tidskrävande och svårt att göra, är ett idealiskt instrument för vävnadsöverföring. Pipetten kan anpassas med olika stora öppningar, och kan användas flera gånger. En kritisk faktor för usinga Spemann mikropipett är att ha lite vätska i pipetten innan du vidrör spetsen på ytan av embryot. En del av vätskan kommer alltid att strömma ut när kontakt sker med menisken över embryot. Genom att trycka på membranet ger vätska och transplantat vävnad som ska kastas ut mycket noggrant, medan något låta upp på membranet suger försiktigt givaren transplantat vävnad i pipetten. Att upprätthålla en bit av positivt tryck på membranet håller givartransplantatvävnad vid spetsen av pipetten under överföringen, och lite extra tryck på membranet tillåter givaren transplantatvävnad för att avsiktligt placerade i värden.
För skydd av Spemann pipetten under lagring och sterilisering, bort glödlampan ur den breda änden och försiktigt in den avsmalnande spetsen i lampan. Placera Spemann pipetten i ett provrör av glas, täcka toppen med aluminiumfolie och autoklav före operation. Efter flera pipetter är ready att steriliseras igen för kirurgi, invertera pipetterna, värma dem nästan till en koka i samma lösning av destillerat vatten och glasvaror tvättmedel och sedan skölja upprepade gånger med destillerat vatten. Autoklav pipetter i deras individuella rör. Den gummislang som bildar membranet och gummi lampan bör bytas ut efter flera steriliseringar eller när de blir mörkare och stel.
Många av komponenterna i detta protokoll innebär farlig utrustning. Till exempel, förfarandet för att göra en Spemann Mikropipett omfattar tre typer av flammor samt uppvärmning, dra, blåser, bockning, skärning och polering av glas. Därför bär lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) som ökar säkerheten, t.ex. skyddsglasögon och skyddsrock är kritisk. Dessutom, eftersom många människor lider av, eller har potential att utvecklas, ägg allergi, använd alltid handskar vid hantering av ägg. Med dessa försiktighetsåtgärder i åtanke, vaktel-anka chimär systemet isa säker, effektiv och relativt tillgänglig metod som har många framtida tillämpningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av en National Institute of Dental och Craniofacial Research (NIDCR) F32 bidrag (DE021929) till JLF och en NIDCR R01 bidrag DE016402 till RAS
1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
Hank’s BSS w/o Phenol Red | Invitrogen | 14025-092 | |
Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | .22µm filter-sterilized |
18G Needles | BD | 305195 | |
5 ml syringe | BD | 309646 | |
No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Spemann Pipet | Hand-made in lab | ||
Egg holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
Alcohol burner | Fisher | 04-245-1 | |
Transparent tape | 3M Scotch | 600 | |
Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
Tungston wire (.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
Bunsun burner | Fisher Scientific | S49117 | |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm |
Propane fuel cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
Diamond point pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
Rubber bulbs | Fisherbrand | S32325 |