Artigo de método

In Vitro Agregação ensaios utilizando hiperfosforilada Tau Protein

DOI:

10.3791/51537

⸱

2 de janeiro de 2015

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Proteínas tau não modificados e hiperfosforiladas foram utilizados em dois ensaios in vitro de agregação para revelar a cinética de agregação rápida dependente de hiperfosforila�o. Estes ensaios pavimentar o caminho para futuras telas para os compostos que podem modular a propensão de tau hyperphosphorylated para formar fibrilas que fundamentam a progressão da doença de Alzheimer.

Resumo

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A doença de Alzheimer faz parte de um grande grupo de distúrbios neurodegenerativos conhecidos como tauopatias que se manifestam pelos depósitos neuronais da proteína tau hiperfosforilada na forma de emaranhados neurofibrilares (NFTs). A densidade do NFT se correlaciona bem com o comprometimento cognitivo e outros sintomas neurodegenerativos, levando assim ao esforço de desenvolvimento de terapêuticas baseadas em agregação de tau. Até agora, no entanto, os ensaios de agregação de tau usam tau recombinante ou sintética que é desprovida das marcas de fosforilação relacionadas à patologia. Aqui descrevemos dois ensaios usando tau recombinante e hiperfosforilada como sujeito. Esses ensaios podem ser ampliados para telas de alto rendimento para compostos que podem modular a cinética ou a estabilidade de agregados de tau hiperfosforilados. Novas terapêuticas para a doença de Alzheimer e outras tauopatias podem ser descobertas usando isoformas de tau hiperfosforiladas.

Introdução

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Doença de Alzheimer (DA) é uma de uma grande colecção de desordens neurodegenerativas conhecidos como tauopatias. O tauopathy patologia de base por excelência é os emaranhados neurofibrilares, NFTs, nos neurônios, astrócitos e microglia 1-4. A densidade NFT se correlaciona com comprometimento cognitivo 3,5 e neurônio perda 6. NFT contém proteína tau hiperfosforilada principalmente (referido como "p-tau" daqui em diante), que forma filamentos helicoidais emparelhados (linear ou APC) 7,8. Tau é uma proteína associada à microtúbulos pensado para facilitar o transporte axonal, que é essencial para a sinalização neuronal e tráfi....

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Protocolo

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1. Preparação dos Reagentes

  1. Preparar tampão de agregação (20 mM Tris, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Armazenar à temperatura ambiente, estável por meses. Suplemento 1 mM de ditiotreitol (DTT) antes da utilização.
    NOTA: um tampão à base de HEPES (HEPES 10 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, DTT 5 mM) também produz resultados semelhantes em agregação de tau.
  2. Prepare tioflavina T ou S tioflavina solução estoque (3 mM, dissolvido em tampão de agregação), e um filtro de 0,22 um por unidade de filtro estéril. Armazenar a -20 ° C em um tubo coberto por folha de alumínio, estável durante meses.
  3. Preparar a solução de heparina (300 uM, dissolvidos ....

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Resultados

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Usando tau recombinante e p-tau (Figura 1), que estabeleceu dois protocolos diferentes para comparar a cinética de agregação de tau e p-tau, aproveitando a forte emissão de fluorescência de ThT e THS por ligação a agregados de proteína amilóide, incluindo tau e p-tau (Figura 2). Com ou sem o corante fluorescente na reacção de agregação, observou-se aumento consistente de agregação de tau por hiperfosforilação (Figuras 3-5). Esta estimulação é independente de heparina (d.......

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Discussão

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Este protocolo demonstra diferentes condições e instrumentos que detectam as tau rápida cinética de agregação dependente da fosforilação de ensaio. No ensaio de terminal, o corante de fluorescência ThT é adicionada a uma porção da reacção foi removida a partir da mistura principal em cada ponto de tempo. Amilóide A ligação induzida por fluorescência é então medida 26. Na segunda, com corante modo, a agregação tau é levada a cabo na presença de ThT ou THS, tornando este tipo de reacção adequados para a avaliaç.......

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Divulgações

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Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institute on Aging (AG039768) para MHK. Agradecemos aos Drs. Thomas Sharkey e Honggao Yan por fornecerem generosamente os instrumentos, bem como a Sean Weise e Yan Wu pela assistência técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Trizma  baseSigmaT1503
NaClMacron Fine ChemicalsMAL-7581-06
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Invitrogen15576-028
Tioflavina TSigmaT3516Armazenado em tioflavina escura
SSigmaT1892Armazenado em
heparinaSigmaH3393
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD9779Armazenado a 4 & C
Placa de 96 poçosCorning3917
ISA SPEX FluoroMax-2Horiba
SpectraMax M2 Leitor de microlato multimodoDispositivos
Anticorpo monoclonal anti-Tau de camundongoR& D Os sistemasMAB3494armazenados em – 80 &graus; O
escura moleculares

Referências

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  1. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci. 24, 1121-1159 (2001).
  2. Ballatore, C., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9), 663-672 ....

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