A cultura in vitro modelo celular para Toxic Chemical Testing Inhaled

Resumo

Este protocolo destina-se a demonstrar o método de exposição de culturas de células a produtos químicos tóxicos inalados. Exposição de diferenciado interface ar-líquido (LPA) culturas de células epiteliais das vias aéreas oferece um modelo único de exposição das vias aéreas de gases tóxicos como o cloro. Nesse artigo, descrevem efeito de exposição ao cloro em culturas de interface ar-líquido de células epiteliais e de cultura submersa de cardiomiócitos. Em sistemas de exposição in vitro permitem estudos sobre os mecanismos importantes para avaliar as vias que poderia, então, ser utilizados para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.

Resumo

As culturas celulares são indispensáveis ​​para desenvolver e estudar a eficácia de agentes terapêuticos, antes da sua utilização em modelos animais. Nós temos a capacidade única de modelar células do epitélio das vias aéreas humana e do músculo cardíaco bem diferenciadas. Esta poderia ser uma ferramenta de valor inestimável para estudar os efeitos deletérios de produtos químicos tóxicos inalados, tais como o cloro, que normalmente podem interagir com as superfícies das células, e formam vários subprodutos quando reagem com água, e limitar os seus efeitos em culturas submersas. Nosso modelo utilizando culturas de células epiteliais das vias aéreas o bem diferenciadas em interface ar-liqiuid contorna essa limitação, bem como fornece uma oportunidade para avaliar mecanismos críticos de toxicidade de potenciais químicos inalados venenosas. Descrevemos aprimorada perda da integridade da membrana, liberação caspase e morte sobre química inalado tóxico, como a exposição de cloro. Neste artigo, propomos métodos para modelar exposição de cloro no coração de mamíferos e das vias aéreas epitelial cvaras de cultura e testes simples para avaliar seu efeito sobre esses tipos de células.

Introdução

A exposição a produtos químicos tóxicos inalados (tiques) / gases, tais como o cloro (Cl ₂₎ continua a ser um problema de saúde em curso em exposição acidental, assim como no seu uso potencial como um agente de ameaça química. Embora os pulmões são o principal alvo, órgãos como o coração eo cérebro também são afetados ^1-3. Modelos in vivo são geralmente utilizados para testes de toxicidade de TICs, mas em ensaios in vitro para avaliação de toxicidade são mais simples, mais rápido e mais rentável. In vitro modelos também permitem extensa investigação de interações célula-agente que podem ser difíceis de avaliar in vivo. Tais sistemas de exposição in vitro são raros e, além disso, em alguns dos modelos convencionais, onde os agentes tóxicos são adicionadas ao meio de cultura no qual as células são submergidas, as propriedades dos agentes pode mudar devido a interacções e ligação de componentes do meio. Em tais cenários sistemas de cultura de células, como a interface ar-líquido (ALI) culturas de células primárias das vias respiratórias humanas epiteliais, aqui propostas, que podem ser diretamente expostos a agentes gasosos pode ser promissor.

As células epiteliais que revestem as vias aéreas são as primeiras linhas de defesa contra substâncias químicas tóxicas inaladas. O epitélio das vias respiratórias humanas forma uma barreira física entre o lúmen e as células subjacentes no pulmão e participa na resposta do pulmão. Ela produz um número de citocinas e outros agentes pro-e anti-inflamatórias bem como segrega líquido superfície muco / vias aéreas (ASL) que cobre o epitélio. Uma das limitações em convencional submerso em sistemas de cultura in vitro é também que o ASL e muco que cobre a superfície epitelial é removido ou diluído. Isto não reflecte o estado fisiológico das células epiteliais pulmonares, que são expostas ao ar. Assim, um ideal sistema in vitro para testes de toxicidade TIC deve replicar esta arquitetura. Há um grande interesse no desenvolvimento rápido de triagem métodos que predizem em toxicidade in vivo. As células epiteliais cultivadas no ALI diferenciar e têm estruturas e funções bem diferenciadas em comparação com células cultivadas submersas e servir um modelo superior das vias respiratórias.

Neste estudo, descrevemos o uso de cultura de ar-líquido interface de vias respiratórias humanas (traqueobrônquicos) células epiteliais para testar a toxicidade do gás inalado venenoso e compará-lo com uma cultura de células submersa de cardiomiócitos, portanto, estudar um outro alvo importante de toxicidade.

Protocolo

1. Culturas de cardiomiócitos de rato

1. Todos os experimentos foram realizados sob protocolos aprovados pelo cuidado com os animais e uso comitê institucional, IACUC.
2. Obter cardiomiócitos de ratos a partir de corações (ventrículos) de ratos machos (240-260 g), utilizando métodos descritos anteriormente ^4. Resumidamente, anestesiar os animais com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg; confirmar anestesia pelo método de aperto do dedo do pé) e, em seguida, remover o coração em 10.0 ml, 1 mM de Ca ^{2 +} contendo tampão Krebs-Ringer, pH 7,4.
3. Lavar os corações 5-6x para remover o sangue e, em seguida, mudar para um buffer de Ca ^{2 +} livre Krebs Ringer contendo 0,02% de protease e 0,06% de colagenase A (5,0 ml / coração). Incubar os corações nesta solução durante 10-15 min a 37 ° C com agitação ocasional.
4. Após 10-15 minutos, lave a solução enzimática com Ca ^{2 +} tampão Krebs Ringer livre para um adicional de 5 min. Solte as células do tecido flácido nosção de uma pipeta 25 ml pipetando a suspensão para cima e para baixo várias vezes.
5. Separam-se as células a partir de tecido por filtração através de uma malha de nylon de 70 ^ m e permitir-lhes que se contentar em tampão Krebs-Ringer contendo 0,1 mM de Ca ^{2 +.} Suspende-se o sedimento de células em tampão 1,0 ml de Krebs Ringer contendo 0,2 mM Ca ^{2 +.}
6. Camada cuidadosamente ao longo de 5,0 ml de 60 ug / ml de albumina de soro bovino, BSA, em 15 ml de tubos de centrífuga, para separar os cardiomiócitos de nonmyocytes e permitir-lhes que se contentar com 30 min. Os cardiomiócitos são mais pesados ​​e se mover para a parte inferior do tubo. Retire cuidadosamente as células sobrenadante e mídia. Repetir esta etapa para purificar mais uma vez as células.
7. Gradualmente transição por lavagem (em etapas usando 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, e 1,0 mM Ca ^{2 +} contendo tampão) os miócitos / cardiomiócitos ventriculares para mM Ca ^{2 +} contendo tampão 1,0 e novamente suspensas em meio ACCT consistindo de Dulbecco Modified Eagle Médium , DMEM containing de 2 mg / ml de BSA, 2 mM de L-carnitina, creatina 5 mM, 5 mM de taurina, 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.
8. Placa cardiomiócitos em meio ACCT, a uma densidade de 100 a 150 células / mm ² a 100 mm, ou 35 milímetros laminina pratos de cultura de plástico ou 40 x 22 mm de lamelas de vidro pré-revestidas com laminina (1 mg / cm ²⁾ revestido. Após 1 h, lavar os pratos com 2,0 ml ACCT para remover as células que não estão ligados. Adicionar 10,0 ml de meio fresco e incuba-se as células.

2. Diferenciada interface ar-líquido (ALI) Cultura da Human Airway células basais epiteliais

1. Procure tecidos humanos traqueobrônquicas de Doenças National Research Interchange sob Institutional Review Board protocolos aprovado. Colheita celular e realizar a cultura utilizando um procedimento publicado ^5,6. Este procedimento utiliza culturas de células como eles são um modelo preciso para exposições de inalação humana para TICs, no entanto, se necessário, pode-se isolar e crescer a ALI moutilizar e / ou células epiteliais das vias respiratórias do rato ^7,8.
2. Resumidamente, fazer pequenos pedaços (~ ¼ de polegada) de tecido após a remoção de todos os nódulos linfáticos e dos tecidos conjuntivos. Lave o tecido várias vezes em solução de Lactato de Ringer. Adicionar os tecidos para um tubo de 50 ml e adicionar solução de protease (1% Protease/0.01% de DNase em meio mínimo essencial, MEM, a proporção de tecido fluido (1:10)).
3. Balance o tecido a 4 ° C durante a noite. Terminar a dissociação do tecido pela adição de 10% de soro fetal bovino. Raspar a superfície epitelial com um bisturi cirúrgico e recolher as células por centrifugação (2000 rpm durante 10 min).
4. As células em placas a uma passagem em poços com tampa revestida com colagénio em meio especial ALI preparados como descrito em detalhe por Fulcher et al ^9. Cultura durante 5 dias antes de mudar para a interface ar-líquido (ALI), removendo meios de apicais.
5. Alimentar as células usando meios de LPA em dias alternados, e permitir que as células se diferenciam em 2-3 semanas adicionais (observar numerosos cílios batendo e secreção de muco) antes de realizar exposições. Lavar a superfície apical com PBS quente juntamente com as mudanças de mídia.

3. Cloro exposição

1. Contêm o sistema de exposição de cloro (CES) dentro de uma capa química qualificado com uma velocidade nominal de 100 fpm operacional que proporciona o confinamento secundário necessário para evitar a exposição do pessoal no caso de fugas acidentais do cloro.
2. Operar o sistema sob uma ligeira pressão positiva (0,5 polegadas de água). O ar seco é alimentado a 15 L / min, e um nível adequado de cloro é alimentado para atingir a concentração final desejada de cloro. As câmaras têm uma tampa de bloqueio com 4 mini fechaduras BCU e uma junta de silicone de baixa dureza para fornecer o selo de pressão.
3. Entregar a mistura Cl ₂ através de um controlador de fluxo de massa. O CES usa um cilindro de gás comprimido que contém 1,0% de Cl _2, em azoto seco.
4. Regular o fluxo de ar de diluição com oprojetado painel de controle e regulação semelhante a concentração Cl ₂ entregues para as câmaras de exposição. A bomba de amostragem baixo volume puxa a exaustão das câmaras em um analisador de cloro para monitorar as concentrações que são então gravados em um registrador de dados conectado ao analisador.
5. Medir as taxas de fluxo dentro das câmaras antes da exposição utilizando um medidor de fluxo de garantir taxas de fornecimento e exaustão iguais.
6. Prepare as culturas de células para a exposição, removendo os meios de sobrenadante e adicionando meio fresco (mídia basolateral em culturas ALI). Qualquer pré-tratamentos com agentes pode ser realizada nesta altura.
7. Expor as culturas de células com LPA epiteliais das vias respiratórias a Cl ₂ de gás (50, 100, ou 300 ppm, durante 30 min) nas duas câmaras de polissulfona biocontainment seladas. Os cardiomiócitos (submersas ou culturas confluentes nas membranas) são expostas a 50 ou 100 ppm Cl ₂ durante 15 min.
8. Após a exposição lavar as câmaras com ar até o Cl ₂ nível cai abaixo de 1 ppm e pode ser aberta com segurança para remover as células (no prazo de 5 min).

4. Resistência elétrica transepitelial (TER) Medição

1. Meça o TER de ar-líquido-interface, ALI, culturas usando um voltohmmeter epitelial com um par de eletrodos de cloreto de "pauzinho" de prata.
2. Equilibrar o eletrodo pauzinho na ALI media 15 min antes do uso.
3. Adicionar mídia quente para a apical (1,0 ml) e basolateral (2,0 ml) de superfície e medir o TER de usar os eletrodos pauzinho do voltohmmeter.
4. Mergulhe o braço mais curto do eletrodo na mídia apicais e quanto mais tempo o braço na mídia basolateral. Clique no botão "medida" no voltohmmeter para avaliar a resistência elétrica.
5. O voltohmmeter tem a opção de medir ohms ou k ohms. Subtraia a resistência através de um livre de células de apoio a cultura da resistência medida em cada camada de células para produzir o transresistência epitelial (TER).

5. Medição Caspase

1. Adicionar mídia ALI fresco (2,0 ml) para a exposição de pós superfície basolateral da célula e incubar à temperatura ambiente. Colete mídia sobrenadante a 4 e 24 horas.
2. Medir a caspase 3/7 actividade nas sobrenadantes de meios utilizando uma caspase comercial 3/7 Kit de ensaio.

6. Western Blot e Imunocitoquímica

1. Realizar as transferências Western usando lisados ​​de células, como anteriormente descrito ^10. Suspender o lisado de proteína (20 mg) em 5x tampão de amostra reduzida e deixe ferver por 5 min. Sujeitou-se o lisado de proteína a SDS-PAGE (4-15%) e transferir as proteínas separadas para uma membrana de nitrocelulose por transferência electroforética.
2. Bloquear a ligação não-específica por incubação da membrana com leite a 5% em tampão de lavagem (PBS + 0,1% de detergente) e sondar as membranas com anticorpos primários contra SERCA2 ou actina sarcomérica na diluição 1:1.000, durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lavar e incubar as membranas com os respectivos anticorpos secundários conjugados com peroxidase e desenvolvimento para a detecção, tal como descrito antes de ¹⁰ usando o kit comercial de detecção com peroxidase.
3. Para imunocitoquímica, o tratamento de células vivas cultivadas em insertos ou lamelas de vidro em placas de 6 poços com 0,4% de Triton-X-100 em tampão de citrato de sódio 10 mM durante 20 min, após a lavagem com PBS.
4. Bloco de ligação não específica por tratamento das células com 5% de soro de burro, durante 20 min, e em seguida, incuba-se as células com IgG não específicas ou os anticorpos primários individuais específicos para actina sarcomérica ou Ki-67.
5. Lavar as células com PBS e incuba-se com anticorpos secundários conjugados fluorescentes para detectar o anticorpo primário e um corante nuclear (1 ug / ml de DAPI).
6. Lavar com PBS e montar lamelas usando a mídia de montagem comerciais.
7. Visualizar a coloração utilizando um microscópio de fluorescência.

Resultados

Haste primária cardiomiócitos em forma anexar em matrizes de laminina e se espalhar e se diferenciar em culturas confluentes (Figura 1A e sua inserção). Estas células foram adicionalmente caracterizados com base na expressão de actina e sarcomérica SERCA2 (Figuras 1B e 1C). Rato cardiomiócitos são altamente suscetíveis à toxicidade de cloro como 15 minutos de exposição a 100 ppm de cloro causou extensos arredondamento celular e morte em culturas submersas e rompimento d...

Discussão

O tipo mais comum de exposição tóxica aguda ocorre quando se respira um produto químico venenoso para os pulmões. Estes produtos químicos também podem ser tomadas rapidamente na corrente sanguínea e pode afetar outros órgãos, como o cérebro eo coração. Inalação de toxicidade de vários agentes que utilizam modelos animais são amplamente estudado e relatado, no entanto, os mecanismos são menos bem compreendidas. Este é um grande obstáculo no desenvolvimento de terapias eficazes. Ausência de em sistemas de exposiç...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ratos	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Cloro	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Kit Caspase 3/7	Eletrodo	G8091
	World Precision Instruments	EVOM e STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
Filtro de células de nylon de 70 mícrons	Corning	#352360
Câmaras de biocontenção de polissulfona	BCU, equipamento de gaiola Allentown	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Anticorpo de actina sarcomérica	Abcam Cambridge, MA	ab28052
Anticorpo SERCA2	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Anticorpo Ki-67	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Anticorpo secundário conjugado com Alexa 488	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitina	Sigma-Aldrich	C0283
Taurina	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinina	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Colagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Solução de Ringer com lactato	Abott Laboratories	7953
Soro de burro	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% de géis SDS-PAGE	Bio-Rad	456-1083
Membrana de nitrocelulose	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mídia de montagem, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Citrato de sódio	Sigma-Aldrich	71497
Colágeno	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminina	BD	biociências 354259
Penicilina/estreptomicina	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ

epitelial voltohmmeter e pauzinho Promega Kit de detecção de peroxidase