Linear Amplificação Mediada por PCR - Localização de elementos genéticos e Caracterização de Unknown Flanquear DNA

Summary

Linear-amplificação mediada (LAM)-PCR é um método desenvolvido para identificar as posições exactas dos vectores de integração no genoma viral. A técnica evoluiu para ser o método superior para estudar a dinâmica clonais em pacientes de terapia genética, biossegurança de tecnologias inovadoras de vetores, a diversidade de células T, modelos de células-tronco do câncer, etc

Abstract

PCR mediada por amplificação linear (LAM-PCR) foi desenvolvida para estudar a hematopoiese em células corrigidas por genes de pacientes tratados por terapia gênica com sistemas vetoriais integrados. Devido à integração estável de vetores retrovirais, os locais de integração podem ser usados para estudar o destino clonal de células individuais e sua progênie. A LAM-PCR, pela primeira vez, forneceu evidências de que a leucemia em pacientes tratados com terapia gênica se originou da superexpressão induzida por provírus de um proto-oncogene vizinho. A alta sensibilidade e especificidade da LAM-PCR em comparação com os métodos existentes, como PCR inversa e PCR mediada por ligação (LM)-PCR, é alcançada por uma etapa inicial de pré-amplificação (PCR linear de 100 ciclos) usando primers específicos de vetores biotinilados que permitem que as etapas de reação subsequentes sejam realizadas em fase sólida (esferas magnéticas). O LAM-PCR é atualmente o método mais sensível disponível para identificar DNA desconhecido que está localizado nas proximidades do DNA conhecido. Recentemente, foi desenvolvida uma variante do LAM-PCR que contorna a digestão de restrição, revogando assim o viés de recuperação dos locais de integração e permite uma análise abrangente da localização dos provírus nos genomas do hospedeiro. O protocolo a seguir explica passo a passo a amplificação de sequências 3' e 5' adjacentes ao vetor lentiviral integrado.

Introduction

Linear-amplificação mediada por PCR (LAM-PCR) permite a identificação e caracterização de DNA flanqueando desconhecida adjacente ao ADN conhecida de qualquer origem. Mais especificamente, a LAM-PCR foi desenvolvido para localizar locais de integração de vectores virais (IS) dentro do genoma do hospedeiro ^{de 1,2.} Os elementos genéticos como retrovírus ou transposons integrar o seu genoma no genoma do hospedeiro em uma (semi-) forma aleatória ^3-6. Em muitos casos, é decisivo saber exactamente a posição em que esses vectores integrados. LAM-PCR tem sido provado ser superior a técnicas alternativas, como mediada por ligadura PCR ⁷ e suas ....

Protocol

1. Preparação de Linker Cassetes (LC)

1. Misturar 40 ul de oligonucleótido LC1 (Tabela 1), 40 ul de oligonucleótido LC2 (Tabela 1, com a enzima de restrição adequada saliência), 110 ul de Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), e 10 ul de 250 mM _MgCl2.
2. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos e deixar a reacção arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. Adicionar 300 ul de _H2O e concentrar dsLinker-ADN num filtro de centrifugação. Adicionar 80 ul de H ₂ O para o produto de eluição e uma alíquota de 10 ul de cassete de ligação preparados em tubos de 0,2 PCR.

2. Pré....

Results

LAM-PCR resulta na amplificação do genoma do vetor cruzamentos com um tamanho de fragmento definido para cada junção. O tamanho dos fragmentos de PCR individuais depende da distância entre o local do ADN conhecido no genoma e o local de reconhecimento da enzima de restrição mais próximo. Isto permite visualizar a diversidade das junções amplificados em amostras analisadas por electroforese em gel, por exemplo. Se apenas simples (monoclonais), vários (oligoclonais), ou múltiplos (policlonais) as bandas estão pre.......

Discussion

A técnica da LAM-PCR permite a identificação de sequências de ADN desconhecidas que flanqueiam uma região conhecida de ADN. Devido à elevada sensibilidade resultante do pré-amplificação dos cruzamentos com os iniciadores específicos de hibridação na sequência de ADN conhecida, que é possível amplificar e detectar até mesmo junções raras para baixo para o nível de uma única célula. Ao contrário, em uma situação policlonal LAM-PCR é capaz de amplificar milhares de junções diferentes numa única reacção.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polimerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Taq Alternativas Polimerases podem ser usadas
PCR Buffer	Qiagen	201203	Recomenda-se o uso deste tampão
dNTP-Mistura	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	ou qualquer outro dNTPs
Oligonucleotídeos (Primers)	MWG Biotech		HPLC purificado
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% wt/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5	USB Corporation	22637	ou qualquer outro fornecedor
EDTA	Applichem	A1103,0250	ou qualquer outro fornecedor
Klenow Polimerase	Roche Diagnostics	10104523001
Mistura de hexanucleotídeos	Roche Diagnostics	11277081001
Restrição endonuclease	NEB		ou qualquer outro fornecedor
Kit	de ligação de DNA Fast-LinkEpicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit Epicentre	Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	ou qualquer outro fornecedor
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	ou qualquer outro fornecedor
TBE buffer	Amresco	0658	ou qualquer outro fornecedor
Brometo de etídio	Applichem	A2273,0005	Brometo de etídio é mutagênico
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	ou qualquer outra escada de DNA
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	ou qualquer outro fornecedor
Magna-Sep Separador de Partículas Magnéticas	Life Technologies	K158501	para uso com Tubos de 1,5 ml
Magna-Sep Separador de Partículas Magnéticas	Life Technologies	K158696	para uso com placas de 96 poços
Amicon Ultra-0.5, membrana Ultracel-30	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	ou outro sistema de eletroforese
TProfessional 96	Biometra	050-551	ou outro Termociclador para placas de 96 poços
Agitador orbital KS 260 básico	IKA	2980200	ou outro agitador horizontal
Tubos de PCR de 0,2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	ou outros tubos de PCR de 0,2 ml Tubos
1,5 ml Eppendorf		12682	ou outros tubos de 1,5 ml Sistema de
documentação de gel	PeqLab		ou qualquer outro sistema de documentação de gel
Espectrofotômetro Nanodrop ND-1000	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 gel pré-moldado	Elchrom Scientific	3497
Aparelho de eletroforese em gel submerso SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Bioanalisador de Eletroforese	Agilent Technologies	G2939AA