Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

Published: August 6, 2014 doi: 10.3791/51544
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Ratiometrische bimoleculaire bakens (RBMBs) kan worden gebruikt om het interne gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen. Hier beschrijven we de bereiding en zuivering van RBMBs, levering van RBMBs in cellen van microporatie en fluorescentie beeldvorming van afzonderlijke RNA transcripten in real-time.

Abstract

De toenemende besef dat zowel de temporele en ruimtelijke regulatie van genexpressie kan belangrijke gevolgen cel functie heeft geleid tot de ontwikkeling van diverse technieken om afzonderlijke RNA transcripten in enkele levende cellen te visualiseren. Een veelbelovende techniek die onlangs is beschreven maakt gebruik van een oligonucleotide-gebaseerde optische sonde, ratiometrische bimoleculaire baken (RBMB), RNA transcripten die zijn ontworpen om ten minste vier tandem repeats van de RBMB doelsequentie bevatten het 3'-ongetranslateerde gebied te detecteren. RBMBs zijn speciaal ontworpen om een ​​fel fluorescerend signaal na hybridisatie met complementaire RNA uit te zenden, maar anders blijven uitgeblust. Het gebruik van een synthetische probe in deze aanpak fotostabiele, rood-verschoven en hoog emissieve organische kleurstoffen worden gebruikt voor beeldvorming. Binding van meerdere RBMBs de gemanipuleerde RNA transcripten resultaten in discrete fluorescentie spots wanneer bekeken onder een breed veld fluorescentiemicroscoop. Dientengevolge kan de beweging van de individuele RNA-transcripten gemakkelijk worden gevisualiseerd in real-time door middel van een tijdreeks van fluorescentiebeelden. Hier beschrijven we de voorbereiding en de zuivering van RBMBs, levering in cellen door microporatie en live-cell imaging van enkelvoudige RNA-transcripten.

Introduction

De expressie en regulatie van RNA transcripten is een complex en dynamisch proces dat grotendeels verantwoordelijk voor de controle cel gedrag en het lot. Hoewel het belang van RNA in dicteren celfunctie is enige tijd bekend, is het vaak moeilijk om duidelijke verbindingen te maken tussen de twee aangezien de meeste RNA analysemiddelen missen de ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk belangrijke regulerende gebeurtenissen zoals transcriptie barsten vangen, RNA mensenhandel, en gelokaliseerde RNA processing. Dit heeft geleid tot de komst van verschillende technieken waarmee individuele RNA-transcripten worden gevisualiseerd in levende cellen in real-time 1. Misschien de meest prominente van deze technieken maakt gebruik van een GFP-fusie-eiwit MS2 RNA dat is ontworpen om tandem repeats van het MS2-bindingsplaats bevatten in de 3'-UTR 2,3 doel. Doordat meerdere GFP moleculen in de nabijheid, individuele RNA-transcripten lijken zo helder fluorescerende vlekkenvia fluorescentiemicroscopie. De GFP-MS2 systeem ongekend inzicht in RNA gedrag, waaronder directe visualisatie en metingen van transcriptionele barsten 4,5 detectie van unieke subcellulaire lokalisatie en verwerking 6-9 en real-time imaging van RNA transport 10 ontvangen. Ondanks het enorme potentieel van het GFP-MS2 systeem ongebonden GFP-MS2 fusie-eiwitten kunnen een hoog achtergrondniveau fluorescentiesignaal dat de veelzijdigheid en dynamisch bereik van deze techniek beperkt creëren. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om dit achtergrondsignaal beperken, waaronder subcellulaire compartimentalisatie van ongebonden GFP-MS2 10, eiwit fragment complementatie 11 en alternatieve RNA bindende eiwitten en richt 12. Echter, al deze benaderingen gevoelig voor de relatieve en de totale expressie van het RNA-doel en GFP-MS2 fusieproteïne blijven.

Als eenALTERNATIEVE de GFP-MS2 systemen, hebben moleculaire beacons ook gebruikt om gemodificeerde RNA transcripten met tandem repeats van de complementaire bindingsplaats in het 3'-UTR 13,14. Molecular beacons worden hairpin vormende oligonucleotide probes die gelabeld zijn aan een uiteinde met een quencher en aan het andere uiteinde met een fluorescerende reporter. Wanneer niet gebonden aan de doel-RNA fluorescente reporter en quencher blijven nabijheid, waardoor een laag fluorescerende toestand. Na hybridisatie worden de fluorescerende reporter en quencher elkaar gedwongen en fluorescentie wordt hersteld. Vergelijkbaar met de GFP-MS2 systeem, de binding van meerdere moleculaire beacons op een RNA transcript leidt tot een heldere fluorescerende vlek die kunnen worden geïdentificeerd door fluorescentie microscopie; echter de achtergrond fluorescentie verwachting veel lager vanwege het afgeschrikte configuratie van ongebonden molecular beacons. Helaas, ondanks de slimme activeringsmechanisme dat wordt opgenomen in de molecular baken ontwerp, is er nu steeds meer aanwijzingen dat de moleculaire bakens ongehybridiseerde doen in de hairpin conformatie niet blijven voor het binnenbrengen in levende cellen. Dientengevolge genereren ze een vals-positief signaal dat de signaal-achtergrond aanzienlijk vermindert. Om deze tekortkoming te ondervangen, hebben we onlangs een nieuwe synthetische probe voor beeldvorming RNA in levende cellen, ratiometrisch bimolecular bakens (RBMBs Figuur 1A) 15,16. RBMBs bestaan ​​uit twee 2'-O-methyl oligonucleotide strengen die een hybride structuur met kenmerken van zowel korte hairpin RNA (shRNA) en moleculaire bakens vormen. De lus en fluorescentie activeringsmechanisme is vergelijkbaar met de moleculaire beacon, terwijl de lange dubbelstrengs domein met een 3'-overhang UU is kenmerkend shRNA. De shRNA functies zijn ontworpen om nucleaire export, die we stijgingen zijn gevonden intracellulair leven naar> 24 uur, met een minimale waarneembare degradatie te rijden, envoorkomt niet-specifieke opening van de lus. Hierdoor RBMBs vertonen een significant hoger signaal-achtergrond dan moleculaire beacons.

Opgemerkt zij dat RBMBs niet kunnen worden bereid met DNA oligonucleotiden, aangezien DNA-probes hebben dezelfde mogelijkheden als nucleaire export-RNA probes bezitten. Structureel wordt de RBMB loop meestal ontworpen om tussen de 15 en 21 basen lang, om een ​​evenwicht te vinden tussen specificiteit en selectiviteit op RNA hybridisatie te creëren. De korte steel die zich vormt uit de twee zelf-complementaire domeinen gewoonlijk ontworpen om 4 basen. Als er een langere steel is geselecteerd, wordt de snelheid van hybridisatie tussen de RBMB lus en target RNA aanzienlijk vertraagd 17,18. Wanneer daarentegen een kortere steel sequentie wordt geselecteerd de smelttemperatuur vaak te laag om de stam-lusstructuur handhaven bij 37 ° C, waardoor een hoog achtergrondsignaal. De specificiteit van de RBMB is ook roodptie als de steellengte wordt verkort. Aangezien de sequentie van de RBMB stamlus kan RBMB prestaties beïnvloeden, moet zorgvuldig worden geselecteerd 19. Met name moet ideaal lussequenties minimale secundaire structuur, hybridiseren met RNA-sequenties met minimale secundaire structuur, voorkomen eiwitbindingsplaatsen en vermijd off-target binding. Voorspellingen van zowel RBMB en RNA secundaire structuur kan worden verkregen met behulp van software zoals mfold 20. Complementaire off-target sites kunnen geïdentificeerd met behulp van een nucleotide Basic Local Opdracht Search Tool (BLAST). Echter, als gevolg van inconsistenties in de modelvoorspellingen en de moeilijkheid bij het identificeren van eiwit afwachtend sites, de specificiteit van alle RBMBs uiteindelijk moet worden experimenteel gevalideerd.

Indien gewenst kan een afgeschrikte referentie kleurstof die ongevoelig is voor de hybridisatie toestand worden toegevoegd aan de RBMB 15. De toevoeging van een verwijzing kleurstof kan prOvide een marker voor levering probe en zijn gebruikt voor ratiometrische beeldvorming, indien meer nauwkeurige metingen van de totale cellulaire fluorescentie vereist. De referentie kleurstoffen maakt metingen worden gecorrigeerd voor verschillen in de achtergrond wegens cel-cel variaties in de aflevering. Wanneer beeldvorming individuele RNA transcripten de referentie kleurstof is niet noodzakelijk. Met name kan een verwijzing kleurstoffen interfereren met de uitvoer van RBMBs van de kern leidt tot een iets hogere achtergrondsignaal in de kern.

Wanneer goed ontworpen, kan RBMBs worden gebruikt om het individuele RNA-transcripten in enkele levende cellen, als het doel RNA is ontworpen om ten minste vier RBMB bindingsplaatsen (Figuur 1B) 16 bevatten. RBMBs kan efficiënt afgeleverd in diverse celtypen via microporatie, met weinig tot geen effect op de levensvatbaarheid van de cellen 21 en kwantitatieve metingen van genexpressie kanverworven binnen de 30 minuten. Bovendien is de methodiek is vrij ongevoelig voor RBMB concentratie en doelwit RNA spiegels, sinds fluorescentie van ongebonden RBMBs efficiënt wordt uitgeblust. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de gebruikte bereiden en zuiveren RBMBs methodologie en een algemene methode voor de levering van RBMBs in levende cellen via microporatie en de beeldvorming van afzonderlijke RNA transcripten in real-time.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

In dit protocol, een oligonucleotide (RBMB1) werd bestempeld op zijn 5'-uiteinde met een CF640R reporter kleurstof en heeft de sequentie: 5'mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC MUMU-3 '. Self-complementaire domeinen, die de vorming van de haarspeldstructuur trekken, zijn vet gedrukt. De tweede oligonucleotide (RBMB2) werd gemerkt aan het 3'-uiteinde met een Iowa Black RQ-Sp quencher en heeft de sequentie: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 '.

1 Bereiding van RBMBs

  1. Voer een snelle rotatie van de buizen met de RBMB1 en RBMB2 oligonucleotiden, te zorgen voor de gedroogde oligonucleotide de bodem van de buis en resuspendeer in DNase en RNase-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM. Bijvoorbeeld, zou een 10 nmol monster oligonucleotide worden geresuspendeerd in 100 ui water.
  2. Measure de exacte concentratie van RBMB1 en RBMB2 voorraad monsters door UV-vis spectroscopie.
    1. Meng 3 ul van de RBMB monster met 117 ul DPBS (zonder calcium en magnesium) in een microcentrifugebuis.
    2. Leeg de spectrofotometer met DPBS en meet de absorptie 200-800 nm. Opmerking: piekabsorpties bij 260 nm en 650 nm moet zichtbaar zijn.
    3. Bereken de voorraad concentratie van de RBMB monsters op basis van de absorptie bij 260 nm (of 650 nm voor RBMB1) met de formule:
      Stock Concentratie (M) = A 260 * verdunningsfactor / extinctiecoëfficiënt waarbij A 260 is de absorptie bij 260 nm en de verdunningsfactor is 40.
      Opmerking: De extinctiecoëfficiënt voor de RBMB is te vinden in de beschrijving die door de oligonucleotide fabrikant. De extinctiecoëfficiënt van CF640R bij 650 nm is 103,000.
  3. Meng 20 ui 100 uM RBMB1, 30 ui 100 uM RBMB2, 6 pl 10xFosfaat buffer (10x fosfaat buffer: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mM KH 2PO 4, 140 mM NaH 2PO 4, pH 7,2) en 4 ui DNase en RNase-free water. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Opmerking: Dit is gewoonlijk voldoende voor ongeveer 50 studies.
  4. Bereid een vloeistof chromatografiekolom met 75 prep kwaliteit Superdex elke gehybridiseerde oligonucleotiden RBMB2 verwijderen. Gebruik een 8 ml (0,7 x 20 cm) vloeistof chromatografiekolom met een ~ 4 ml bedvolume om de kleine hoeveelheid gemengde probes zuiveren.
  5. Was en evenwicht de Superdex met ~ 50 ml 1x fosfaatbuffer met een injectiespuit pomp draait op een stroom bij een stroomsnelheid van 0,6 ml / min. Voordat alle van de vloeistof het bed volume komt, stop de injectiepomp, koppel het los en laat de resterende vloeistof gaat door de kolom door de zwaartekracht.
  6. Laad de RBMB mengsel (60 pl) op de chromatografiekolom.
    1. Na de RBMB monster volledig isging de bed, voeg langzaam een ​​250 ul van 1 x fosfaatbuffer naar de top van het bed zodat het gehele monster volledig is ingevoerd in de kolom.
    2. Vul de kolom aan de rand met 1x fosfaat buffer. Sluit de bovenste en start de spuitpomp - de injectiespuit moet worden gevuld met ~ 50 ml 1x PBS en gelopen bij een stroomsnelheid van 0,6 ml / min.
    3. Zodra de RBMB nadert de bodem van de kolom - de RBMB monster kan typisch gemakkelijk gevisualiseerd door de kleur van de kleurstof opgenomen in de probe - zich doorstroom 2 druppels per microcentrifugebuis (1,5 ml). Stoppen met het verzamelen van het monster als de kleur binnen de microcentrifugebuizen duidelijk.
  7. Combineer de buisjes met de gekleurde RBMB monster - meestal 5-6 tubes - en laden in een centrifugaal filter apparaat (10.000 MW cutoff). Centrifugeer het monster bij 10.000 RCF gedurende 20 minuten of totdat het gewenste volume. Opmerking: Deze snelheden en tijden typischleveren een eindvolume van 30 pi ~.
  8. Meet de exacte concentratie van het gezuiverde RBMB monster door UV-Vis spectroscopie.
    1. Neem 3 pl van de geconcentreerde RBMB monster en meng met 117 ul DPBS in een microcentrifugebuis.
    2. Leeg de spectrofotometer met DPBS en meet de absorptie 200-800 nm. Opmerking: piekabsorpties bij 260 nm en 650 nm moet zichtbaar zijn.
    3. Bereken de voorraad concentratie van het gehybridiseerde RBMB basis van de absorptie bij 650 nm, met de formule:
      Stock Concentratie (M) = A 650 * verdunningsfactor / uitgestorven coëfficiënt waarbij A 650 is de absorptie bij 650 nm, is de verdunningsfactor 40.
      Opmerking: De extinctiecoëfficiënt voor CF640R bij 650 nm is 103.000 en de extinctiecoëfficiënt voor Iowa Black RQ is ~ 20.000. De extinctie coëfficiënten additief en zijn niet gevoelig voor hybridisatie. Daarom is de voorraad RBMB monster heeft een gecombineerde extinctiecoëfficiënt van approximately 123,000 bij 650 nm.
  9. Label de buis behoren met naam en concentratie en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.

2 Voorbereiding van de Poly-d-lysine gecoat 8-goed Chambered dekglaasje

  1. Bereid een 0,2 mg / ml oplossing van poly-D-lysine door het oplossen van 5 mg van poly-D-lysine (gevriesdroogd poeder, G-bestraald) in 25 ml gesteriliseerd water in een steriele omgeving.
  2. Voeg 200 ul van 0,2 mg / ml Poly-D-lysine oplossing in elk putje van een 8-well chambered dekglaasje, in een steriele omgeving.
  3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 16-18 uur in de celkweek kap.
  4. Zuig het Poly-D-lysine en was de put 3 keer met steriel gedistilleerd water. Opmerking: De beklede kamer slides kunnen bij 4 ° C worden bewaard.

3 Probe Delivery

Opmerking: Het gebruikte celsysteem geïntegreerd genconstruct dat RNA expressie van tenminste 4-sequentiële bind bevattening locaties voor de RBMB in het 3'-ongetranslateerde gebied (UTR). De doelwitsequenties moet complementair zijn aan de lus van de RBMB zijn. Geadviseerd wordt als een negatieve controle, hetzelfde cellijn gemanipuleerd om hetzelfde gen construct tot expressie, maar zonder de tandem repeats. In dit protocol, een menselijke fibrosarcoom cellijn, HT1080, werd ontworpen om GFP-RNA met 96-tandem repeats van de RBMB doelsequentie in het 3'-UTR expressie. De controle cellijn werd ontworpen om wildtype GFP RNA expressie.

  1. Plaat cellen in een T25 kolf bij 40-50% confluentie een dag voor probe levering. Culture de cellen met DMEM medium aangevuld met 1% pen / strep en 10% foetaal bovine serum (FBS) en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.
  2. De volgende dag, zet de microporator en het opzetten van de microporatie parameters tot 950 V, 2 pulsen, 25 msec. Opmerking: Deze parameters zijn geoptimaliseerd voor HT1080-cellen, maar ze zijn celtype afhankelijk en kan Adjusted andere celtypes zoals beschreven in de instructies van de fabrikant.
  3. Vul de microporatie buis met 4 ml elektrolytische buffer en plaats het op de microporatie station.
  4. Neem de voorraad steekproef van gezuiverd RBMB en ontdooi het. Verdun aantal microliters tot een eindconcentratie van 12 pM met 1x fosfaatbuffer. 1 pi is nodig voor elke microporatie.
  5. Pipetteer 1 ml kweekmedium met FBS zonder antibiotica in een microcentrifugebuis. Opmerking: Dit wordt gebruikt om de cellen direct na microporatie schorten en kan worden vernietigd, bij microporatie-inrichting, voorlopig. De opname van antibiotica in de cultuur media zal de levensvatbaarheid van de cellen na microporatie verlagen.
  6. Verwijder de celkweek media uit de gemanipuleerde cellen HT1080 (60-80% samenvloeiing), was de cellen met 1 ml Ca 2 + en Mg 2 + -vrij DPBS een keer, en incubeer met 1 ml trypsine gedurende 1-2 minuten.
  7. Stop de trypsinization door 1 ml DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, zonder antibiotica en fenolrood, en breng de cellen in twee 1,5 ml microcentrifuge buisjes.
  8. Draai de cellen af ​​in de microcentrifugebuis bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, resuspendeer en combineren de celpellets in een eindvolume van 1 ml DPBS.
  9. Neem 10 pi uit de goed gemengde celsuspensie en tel de cellen.
  10. Pipetteer de cellen op en neer een paar keer om ervoor te zorgen dat ze goed verspreid en de overdracht van 300.000 cellen met DPBS in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en spin neer op 200 xg gedurende 5 minuten.
  11. Verwijder de bovenstaande vloeistof, zorg dat u de cel pellet niet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 11 ul resuspensie buffer en pipet op en neer meerdere keren dat de cellen goed gedispergeerd. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen te genereren. Let op: Luchtbellen zal een vonk veroorzaken tijdens microporatie en resulteren in een slechte RBMB levering en celdood.
  12. Voeg 1 ul van de verdunde RBMB (12 uM) en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. Nogmaals wees voorzichtig niet om eventuele luchtbellen te genereren.
  13. Zuig 10 ul van de RBMB-cel mengsel, met behulp van de microporatie pipet, en steek de pipet in de microporatie buis. Duw op de startknop om de microporatie starten. Opmerking: Er moet geen zichtbare luchtbellen in de punt.
  14. Wanneer het scherm van de microporator toont voltooiing, verwijder de pipet uit het station, te verdrijven van de 10 pi mengsel in de microcentrifugebuisje dat eerder werd voorbereid, met 1 ml kweekmedium met FBS maar zonder antibiotica. Meng voorzichtig door het schommelen van de buis side-to-side meerdere malen.
  15. Draai de cellen bij 200 g gedurende 5 minuten en was de cellen twee keer met 1 ml fenolrood kweekmedium met FBS zonder antibiotica, elke RBMBs die niet in de cellen geleverd verwijderen. Resuspendeer met 400 ul fenol rood kweekmedium met FBS zonderantibiotica.
  16. Plaat de microporated cellen in de poly-D-lysine gecoate 8-well chambered dekglaasje 200 gl per well of op het gewenste confluentie.
  17. Optioneel: Als het gewenst beeld de kern, voeg Hoechst 33342 aan de cellen in een eindconcentratie van 0,01 mg / ml.
  18. Plaats de chambered dekglaasje in een celcultuur incubator. Incubeer de cellen gedurende 1-2 uur voorafgaand aan beeldvorming, zodat de cellen voldoende tijd te vestigen op het dekglaasje oppervlak. Opmerking: Imaging kan zo snel worden uitgevoerd als 30 min post-microporatie.

4 Image Acquisition

  1. Zet de levende cel stadium top incubatiesysteem en equilibreren totdat zij tot 37 ° C, 5% CO2 en 75% vochtigheid.
  2. Zet de microscoop en fluorescerende lichtbron en open de Metamorph software. Opmerking: Andere soortgelijke software pakketten voor microscoop controle en beeldopname kan ook worden gebruikt.
  3. Solliciteer Immersol olie aan dedoelstelling.
  4. Breng de chambered dekglaasje met microporated cellen naar de levende cellen stadium top incubatiesysteem. Incubeer de bovenste fase systeem totdat de temperatuur en CO2 niveau gestabiliseerd.
  5. Open het tabblad Ophalen, in Metamorph software. Klik op de Show Live-knop om het veld te vinden, stel dan scherp onder wit licht in en klik op de Stop-knop Live.
  6. Onder het tabblad Ophalen, klik en open de overname stroom pop-up-knop, en het opzetten van de gewenste film acquisitie parameters. Verwerven van 150 frames met behulp van de Cy5 / CF640R filter en de beelden op te slaan op de harde schijf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kort na de microporatie van HT1080-cellen in de aanwezigheid van RBMBs individuele RNA transcripten die werden om meerdere RBMB bindingsplaatsen bevatten het 3'-UTR verschijnen als helder fluorescerende vlekken als afgebeeld door wide-field fluorescentie microscopie (figuur 2). Terwijl individuele RNA transcripten met slechts vier RBMB bindingsplaatsen kunnen worden afgebeeld in levende cellen, meer RBMB bindingsplaatsen in de 3'-UTR, hoe sterker het fluorescentiesignaal. Bovendien, hoe RBMBs dat hoe langer gebonden aan elk transcript RNA kan worden gevisualiseerd voordat het signaal verloren gaat door fotobleken. In dit protocol werd het RNA ontworpen om 96-tandem repeats van de RBMB doelsequentie in het 3'-UTR bevatten. De overname van streaming beelden mogelijk maakt individuele RNA-transcripten af te beelden in real-time (Film 1). Individuele RNA transcripten is goed te zien zich binnen het cytoplasma en de kern of de cellen. Terwijl de meeste van de plekken lijken Brownse of sub-diffuse bewegingen te ondergaan, in zeldzame gevallen een RNA ondergaat gericht vervoer zal worden waargenomen (Film 2). Scripties RNA-transcripten meestal bewegen snel langs een rechte weg (figuur 3); Sommige RNA niet volgen gekromd of om abrupte veranderingen van richting. Deze bewegingen staan ​​in scherp contrast met de Brownse bewegingen, die willekeurig in de natuur zijn en vertonen geringe totale verplaatsingen binnen het korte tijdsbestek hier verworven (dwz <1 min). De geregisseerd RNA bewegingen zijn in overeenstemming met het transport van RNA langs microtubuli en microfilamenten. Deze experimenten geven aan dat RBMBs bieden een veelzijdig en krachtig hulpmiddel voor het afbeelden individuele RNA-transcripten in levende cellen.

Figuur 1
Figuur1 Schema van RBMBs en methodologie beeld individuele RNA-transcripten in cellen. A) RBMBs in de aanwezigheid en afwezigheid van complementair doel-RNA. Bij het ontbreken of het doel RNA, wordt RBMB fluorescentie uitgeblust. In aanwezigheid van doelwit-RNA, wordt RBMB fluorescentie hersteld. B) Meerdere RBMBs binden elke RNA-transcript creëren van een heldere fluorescerende vlek die kan worden gedetecteerd door wide-field fluorescentie microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 Representatieve beeld van HT1080-cellen die stabiel tot expressie RNA met A) 96-tandem repeats of B) 4-tandem repeats van de RBMB bindingsplaatsde 3'-UTR, na de intracellulaire afgifte van RBMBs. De aanwezigheid van 96-tandem repeats kunnen afzonderlijke RNA transcripten te verschijnen als helder fluorescerende vlekken. RNA met alleen 4-tandem herhalingen kunnen worden gevisualiseerd, maar de intensiteit van het fluorescerende spots is erg zwak en vaak slechts detecteerbaar in gebieden met uitzonderlijk lage achtergrond. Het kleine aantal bijzonder lichtpuntjes overeenkomt met RNA dat niet beweegt. Schaalbalk:. 10 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3 Montage van een RNA-transcript gericht transport ondergaat. De baan van het transcript weergegeven in de meest linkse paneel. Het traject wordt overlay over een enkele frame van de tijdreeks. Schaalbalk:. 2,5 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Film 1 vertegenwoordiger film van HT1080 cellen stabiel tot expressie RNA met 96-tandem repeats van de RBMB bindingsplaats in de 3'-UTR, naar aanleiding van de intracellulaire aflevering van RBMBs. Individuele RNA-transcripten lijken zo helder fluorescerende vlekken. Schaalbalk:. 10 micrometer Klik hier om video te bekijken.

Movie 2 Vertegenwoordiger filmpje van een RNA-transcript ondergaat gericht vervoer. Schaalbalk:. 10 micrometer Klik hier om video te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mogelijkheid om het interne gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen met een gebruikelijke wide-field microscoop vereist een heldere en fotostabiele fluorescentiesignaal te worden bij elke RNA transcript en een lage achtergrond fluorescentie afkomstig van ongebonden fluorescentie probes. In deze werkwijze wordt een helder fluorescerend signaal bereikt hybridiseren meervoudige (tot 96) oligonucleotide-gebaseerde fluorescente probes, dwz RBMBs, op elk RNA-transcript. Aangezien weinig als vier bindings plaatsen voldoende 16. De collectieve signalen resulteren in een heldere fluorescerende vlek die bijgehouden in real-time. De aanwezigheid van meerdere probes maakt ook langere belichtingstijden, aangezien een aanzienlijk deel van de fluorescerende kleurstoffen worden gebleekt voordat de collectieve signaal is. Beoogd wordt dat deze techniek unieke inzicht te verkrijgen over RNA biologie en zorgen voor de studie van diverse RNA gedragingen variërend van meten the reactie van RNA mensenhandel aan verschillende externe stimuli, observeren unieke subcellulaire lokalisatie patronen van target RNA, het bestuderen van het lot en de levensduur van RNA, en het inzichtelijk maken van RNA-regelgeving. Daarnaast kan het mogelijk zijn om wijzigingen bij te houden (dwz up-en down-regulatie) in RNA expressie. Hoewel deze mogelijkheid nog niet is gevalideerd, hebben we eerder aangetoond dat RNA kopienummer vrij nauwkeurig kunnen worden gekwantificeerd tot 24 uur in levende cellen 22. Bovendien kan RBMBs niet het niveau van genexpressie beïnvloeden. Samen geven deze resultaten eerste bewijs dat veranderingen in genexpressie gedurende deze tijdsperiode werden nauwkeurig gevolgd, op een cel per cel basis, en dat RBMBs niet tot een verhoging van RNA stabiliteit of vertraagd RNA degradatie. Het is echter niet duidelijk in hoeverre genexpressie daadwerkelijk veranderd deze keer of helemaal niet.

In het algemeen isVerwacht wordt dat een toename van genexpressie gemakkelijk zou kunnen worden geïdentificeerd; vanwege de overvloed van ongebonden RBMB in de cel die is vrij nieuw gevormde transcripten binden. Echter, wat is minder duidelijk is hoe RBMBs distantiëren van RNA tijdens de vertaling en degradatie en als er enige vertraging tussen RNA-expressie / degradatie en de beeldvorming van deze transcripties. Bijkomende studies zijn nog steeds nodig om beter te begrijpen RBMB prestaties in deze scenario's.

Verscheidene alternatieven voor enkele RNA transcripten beeldvorming zijn eerder gerapporteerd. De vroegste studies betrokken fluorescent labelen van geïsoleerde RNA-transcripten en herintroductie van deze transcripten in cellen, meestal door micro-injectie 23,24. De signaal-achtergrond hiervan is zeer hoog, vanwege de mogelijkheid om elk gebonden fluorescente kleurstoffen te verwijderen, maar er zorgen over of het waargenomen gedrag RNA nauwkeurig weergeeft true RNA processing. De meest gebruikelijke oplossing voor dit bezwaar is techniek transgenen betrokken bij tandem repeats in het 3'-UTR dat door een fluorescerende reporter kan gebonden, analoog aan de RBMB benadering hier gepresenteerd. Vorige fluorescente reporters hebben opgenomen kleine moleculen die alleen fluoresceren bij binding RNA aptameren, gewoonlijk aangeduid als spinazie 25 en GFP. Spinazie nog niet gebruikt om enkele RNA transcripten beeldvorming, maar is gebruikt om het globale expressie. Daarentegen is GFP gebruikt om succesvol beeld enkelvoudige RNA transcripten. In deze benadering wordt een GFP reporter gefuseerd aan het manteleiwit van faag MS2 bacteriële (GFP-MS2) en bindt aan een gemodificeerde RNA-construct met tandem repeats van het MS2-bindingsplaats in het 3'-UTR 2,10. Deze aanpak is vergelijkbaar met de hier beschreven benadering RBMBs bieden verschillende voordelen. Bijvoorbeeld, RBMBs laat organische fluoroforen worden gebruikt voor beeldvorming, waardoor een groter div bepaaltersiteit keuzes met superieure fotostabiliteit en superieure helderheid in vergelijking met fluorescerende eiwitten. Verder zijn er vele commercieel beschikbare organische fluoroforen die uitzenden in het uiterste near-infrared. Het voordeel van het kiezen kleurstoffen rood-verschoven emissie spectra voort uit de onderste cellulaire autofluorescentie waargenomen bij deze golflengten. Aangezien hoge autofluorescentie gemakkelijk overstemmen fluorescentiesignalen verbonden RNA hybridisatie, het vermogen aanzienlijk sneller autofluorescentie een belangrijk boost in signaal-achtergrond. Een ander belangrijk voordeel van het gebruik RBMBs is dat het signaal van ongebonden probes aanzienlijk wordt gedoofd. Hoewel verschillende benaderingen zijn ondernomen om de achtergrond fluorescentie van gebonden GFP in het GFP-MS2 benadering, bijvoorbeeld, gebruik van kernlokalisatiesignalen verminderen, regelen GFP expressie en split GFP complementatie 1,10,11,26,27, de aanwezigheid van een daadwerkelijke blussen moiety in de RBMB ontwerp biedt gebruikers een veel grotere experimentele flexibiliteit. Bijvoorbeeld, de RBMB methode betrekkelijk ongevoelig voor zowel de relatieve als totale niveau van RNA-expressie en probe concentratie. In feite, kunnen afzonderlijke transcripten worden afgebeeld met RBMB concentraties die een orde van grootte omvatten. De gecombineerde voordelen van hogere fotostabiliteit, helderder signaal, en een lagere achtergrond maken real-time RNA imaging experimenten met RBMBs veel toegankelijker voor microscopie gebruikers met beperkte kennis.

Misschien de meest opvallende nadeel van exogene probes zoals RBMBs, in tegenstelling tot moleculaire reporter zoals GFP, is de behoefte aan intracellulaire afgifte. Gelukkig diverse opties bestaan, bijvoorbeeld, micro-injectie 28 transfectieagentia 29 cel penetrerende peptiden 30 en streptolysine O (SLO) 31. Persoonlijk, hebben we ontdekt dat microporatie isde meest gebruiksvriendelijke en veelzijdige optie, meestal resulterend in> 95% levensvatbaarheid en levering efficiëntie 21. Dit is waarschijnlijk omdat het microliter-volume elektroporatie werkwijze vertoont een vermindering in de vele schadelijke gebeurtenissen vaak geassocieerd met elektroporatie, onder warmteontwikkeling metaalion oplossing, pH variatie en oxidevorming. Belangrijk microporatie ook ontvankelijk voor high-throughput studies, aangezien RBMBs tot> 100.000 cellen geleverd kunnen worden in een enkel experiment.

Ondanks de vele voordelen van het gebruik RBMBs om beeld RNA lokalisatie en beweging in levende cellen, een aantal beperkingen en problemen nog steeds. Misschien is de grootste uitdaging is het onvermogen om RNA te volgen voor meer dan een paar minuten onder continue blootstelling. Dit is een gevolg van zowel fotobleken en het vermogen van RNA uit de focale beeldvlak te bewegen. Helderder en meer fotostabiel kleurstoffen kunnen helpen alleviate deze tekortkomingen beide, door het aantal keren dat elke kleurstof kan worden opgewekt en waardoor de discrete fluorescerende vlekken worden afgebeeld op grotere afstand van het brandpuntsvlak. Een veelbelovende benadering voor photostability verhogen omvat het gebruik zelfherstellende kleurstoffen die triplet-toestand quenchers gebruiken nabij de organische fluorofoor hun levensduur te verlengen 32. Een andere mogelijkheid kan het gebruik van fluorescente versterkende geconjugeerde polymeren, die bestaan ​​uit een groot aantal aangesloten fluoroforen die niet zelf quench zijn. Deze polymeren kunnen vele malen helderder dan enkele organische fluoroforen en toch efficiënt worden gedoofd door een enkele blussen deel 33,34 zijn; is echter nog steeds nodig extra werk op dit gebied. Opgemerkt zij dat intermitterende beeldvorming, met een snelheid> 1 beeld per seconde, kan niet worden uitgevoerd om beeld een RNA transcript gedurende langere perioden, omdat het moeilijk te waarborgen dat het thij hetzelfde RNA-transcript wordt bijgehouden van het frame-to-frame. Natuurlijk kwantitatieve evaluatie van genexpressie op enkele cel niveau nog mogelijk over lange tijdsbestek door het tellen van individuele fluorescerende vlekken op een per cel basis 16,35,36. In dit geval is het niet noodzakelijk om bij te houden van individuele transcripten houden. Algemeen wordt aangenomen dat RBMBs zijn in staat om belangrijke inzicht RNA van functie, waardoor de beeldvorming van enige gemanipuleerde RNA transcripten met conventionele microscopie apparatuur en beperkte deskundigheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr Mark Behlke en Dr Ling Huang zijn in dienst van IDT, die oligonucleotiden te koop aanbiedt vergelijkbaar met sommige van de in het manuscript beschreven verbindingen. IDT is echter niet een beursgenoteerd bedrijf en zij persoonlijk geen aandelen bezitten / eigen vermogen in IDT.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation LOOPBAAN Award (0953583) en het National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  3. Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
  4. Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
  5. Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
  6. Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  7. Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
  8. Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
  9. Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
  10. Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
  11. Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
  12. Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
  13. Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
  14. Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
  15. Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
  16. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
  17. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
  18. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
  19. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
  20. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  21. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
  22. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
  23. Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
  24. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
  25. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  26. Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
  27. Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
  28. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
  29. Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
  30. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
  31. Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
  32. Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
  33. Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
  34. Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
  35. Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
  36. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).

Tags

Genetica RNA imaging enkel molecuul fluorescentie levende cel
Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, Y., Zhang, X., Huang, L.,… More

Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter