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Imagerie en temps réel de l'unité d'ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

Published: August 6, 2014 doi: 10.3791/51544
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Balises bimoléculaires Ratiométrique (de RBMBs) peuvent être utilisés pour une seule image transcrits d'ARN modifiées dans les cellules vivantes. Ici, nous décrivons la préparation et la purification de RBMBs, livraison de RBMBs dans les cellules par microporation et l'imagerie de fluorescence de transcrits d'ARN simples en temps réel.

Abstract

La prise de conscience croissante que le règlement de temporelle et spatiale de l'expression du gène peut avoir des conséquences importantes sur la fonction cellulaire a conduit au développement de diverses techniques de visualiser des transcrits d'ARN dans les cellules individuelles de vie simples. Une technique prometteuse qui vient d'être décrite utilise une sonde à base d'oligonucléotide-optique, ratiométrique balise bimoléculaire (RBMB), pour détecter des transcrits d'ARN qui ont été modifiées pour contenir au moins quatre répétitions en tandem de la séquence cible d'RBMB dans la région 3 'non traduite. RBMBs sont spécifiquement conçus pour émettre un signal fluorescent lumineux par hybridation à l'ARN complémentaire, mais autrement, restent éteints. L'utilisation d'une sonde synthétique dans cette approche permet photostable, décalé vers le rouge, et des colorants organiques fortement émissifs à être utilisé pour l'imagerie. La liaison de plusieurs RBMBs les ARN transcrits les résultats d'ingénierie dans les points de fluorescence discrets lorsqu'on les examine sous un microscope à fluorescence à champ large. Par conséquent, le mouvement de transcrits d'ARN individuels peuvent être facilement visualisées en temps réel en prenant une série temporelle d'images fluorescentes. Nous décrivons ici la préparation et la purification de RBMBs, la livraison dans les cellules par microporation et vivons-cellule imagerie de transcrits d'ARN simple.

Introduction

L'expression et la régulation des transcrits d'ARN est un processus complexe et dynamique qui est en grande partie responsable de contrôler le comportement des cellules et sort. Bien que l'importance de l'ARN dans la fonction des cellules dicter est connue depuis un certain temps, il est souvent difficile d'établir des liens clairs entre les deux puisque la plupart des outils d'analyse de l'ARN n'ont pas la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour capturer les événements réglementaires importants tels que la transcription éclatement, de l'ARN la traite, et le traitement de l'ARN localisée. Cela a conduit à l'apparition de plusieurs techniques qui permettent de transcription d'ARN différents à être visualisés dans des cellules vivantes en temps réel 1. Peut-être le plus important de ces techniques utilise une protéine de fusion GFP-MS2 à l'ARN cible qui a été modifié pour contenir des répétitions en tandem du site de liaison de MS2 dans la 3'-UTR de 2,3. En apportant de multiples molécules de GFP en proximité, transcrits d'ARN individuelles apparaissent comme des taches fluorescentes brillantespar microscopie de fluorescence. Le système GFP-MS2 a fourni un aperçu sans précédent sur ​​le comportement de l'ARN, y compris la visualisation directe et mesures de transcription éclatement 4,5, la détection de la localisation et de la transformation 6-9 uniques sub-cellulaire et l'imagerie en temps réel du transport de l'ARN 10. Cependant, en dépit de l'énorme potentiel du système GFP-MS2, des protéines de fusion GFP-MS2 non liés peuvent créer un signal fluorescent de fond élevé qui limite la polyvalence et la gamme dynamique de cette technique. Plusieurs approches ont été développées pour limiter ce signal de fond, y compris le cloisonnement subcellulaire de la GFP-MS2 non lié 10, fragment de protéine complémentation 11, et des protéines de liaison d'ARN et d'autres cibles 12. Cependant, toutes ces approches restent sensibles à l'expression relative et totale de l'ARN cible et GFP-MS2 protéine de fusion.

A titre d'unLTERNATIVE aux systèmes GFP-MS2, les balises moléculaires ont également été utilisées pour détecter des transcrits d'ARN modifiées avec des répétitions en tandem du site de liaison complémentaire à l'extrémité 3 'UTR 13,14. Les balises moléculaires sont des sondes oligonucléotidiques formant épingle à cheveux qui sont marqués à une extrémité avec un agent d'extinction et à l'autre extrémité avec un rapporteur fluorescent. Quand il n'est pas lié à l'ARN cible le rapporteur fluorescent et un extincteur rester à proximité, ce qui entraîne un état de faible fluorescent. Lors de l'hybridation, le rapporteur fluorescent et extincteur sont écartées et la fluorescence est rétabli. Similaire au système GFP-MS2, la liaison de balises moléculaires multiples sur un seul résultat de la transcription de l'ARN dans un endroit lumineux fluorescent qui peut être identifiée par microscopie à fluorescence; cependant, la fluorescence de fond devrait être beaucoup plus faible, en raison de la configuration de trempe balises moléculaires non liés. Malheureusement, malgré le mécanisme d'activation intelligente qui est incorporé dans la mconception de balise olecular, il ya maintenant plus de preuves que non hybridée balises moléculaires ne restent pas dans la conformation en épingle à cheveux lorsqu'il est introduit dans des cellules vivantes. Par conséquent, ils génèrent un signal de faux-positifs, qui réduit de manière significative le rapport signal sur fond. Pour pallier cet inconvénient, nous avons récemment développé une nouvelle sonde de synthèse de l'ARN d'imagerie des cellules vivantes, balises bimoléculaires ratiométriques (RBMBs; Figure 1A) 15,16. RBMBs sont composées de deux brins d'oligonucléotides 2'-O-méthyle qui forment une structure hybride avec des caractéristiques à la fois de l'ARN court en épingle à cheveux (shRNA) et des balises moléculaires. Le mécanisme d'activation de la boucle et la fluorescence est similaire à la balise moléculaire, tandis que le long double brin domaine avec un surplomb en 3 'UU est plus caractéristique des shRNA. Les caractéristiques shRNA sont conçus pour conduire l'exportation nucléaire, que nous avons trouvé une augmentation vie intracellulaire de> 24 h, à la dégradation observable minimale, etempêche l'ouverture non-spécifique de la boucle. En conséquence RBMBs présentent un fond signal-significativement plus élevé que les balises moléculaires.

Il est à noter que RBMBs ne peut être préparé en utilisant des oligonucléotides d'ADN, puisque les sondes à base d'ADN ne possèdent pas les mêmes capacités d'exportation nucléaires que des sondes à base d'ARN. Structurellement, la boucle de RBMB est généralement conçue pour être comprise entre 15 et 21 bases de long, à créer un équilibre entre la spécificité et la sélectivité de l'hybridation sur l'ARN. La tige courte qui se forme à partir de deux domaines auto-complémentaires est généralement conçu pour être quatre bases. Si une tige plus longue est choisie, le taux d'hybridation entre la boucle de RBMB et l'ARN cible est significativement ralentie 17,18. A l'inverse, quand une séquence de tige plus courte est sélectionnée, la température de fusion est souvent trop faible pour maintenir la structure tige-boucle à 37 ° C, conduisant à un signal de fond élevé. La spécificité de la RBMB est également rougeuced que la longueur de la tige est raccourcie. Depuis la séquence de la tige-boucle de RBMB peut également influer sur les performances de RBMB, il doit être soigneusement sélectionné 19. En particulier, les séquences de boucle idéal devrait avoir une structure secondaire minimale, s'hybrider à des séquences d'ARN avec une structure secondaire minimale, d'éviter les sites de liaison de protéines, et éviter hors cible de liaison. Prédictions des deux RBMB et structure secondaire d'ARN peuvent être obtenues en utilisant un logiciel tel que mfold 20. Sites complémentaires hors-cible peuvent identifiés à l'aide d'un nucléotide base locale Affectation outil de recherche (BLAST). Cependant, en raison d'incohérences dans les prédictions du modèle et de la difficulté à identifier les sites de protéines Biding, la spécificité de tous les RBMBs doit finalement être validée expérimentalement.

Si on le souhaite, un colorant de référence non éteint qui est insensible à l'état d'hybridation peut être ajouté à la RBMB 15. L'addition d'un colorant de référence peut prOvide un marqueur pour la livraison de la sonde et être utilisés pour l'imagerie ratiométrique, si des mesures plus précises de fluorescence cellulaire total sont nécessaires. Les colorants de référence permet d'ajuster les mesures de différences de fond dues aux variations de cellule à cellule dans la livraison. Cependant, lors de l'imagerie de l'ARN transcrits colorant individuel de référence n'est pas nécessaire. Notamment, certains colorants de référence peuvent interférer avec l'exportation de RBMBs à partir du noyau, ce qui conduit à un signal d'arrière-plan légèrement plus élevée dans le noyau.

Lorsqu'ils sont bien conçus, RBMBs peuvent être utilisés pour l'image des transcrits d'ARN dans les cellules individuelles de vie simples, si l'ARN cible est conçue pour contenir au moins quatre sites de liaison de RBMB (figure 1B) 16. RBMBs peuvent être efficacement délivrés dans une large gamme de types de cellules par l'intermédiaire de microporation, avec peu ou pas d'effet sur ​​la viabilité des cellules 21, et des mesures quantitatives de l'expression de gènes peuvent êtreacquis dans les 30 minutes. De plus, la méthode est assez peu sensible à des niveaux de concentration de RBMB et ARN cible, étant donné que la fluorescence de RBMBs non liés est efficacement stoppée. Ici, nous fournissons une description détaillée de la méthodologie utilisée pour préparer et purifier RBMBs, ainsi que d'un mode opératoire général pour la prestation de RBMBs en cellules vivantes par microporation et l'imagerie des transcrits d'ARN simples en temps réel.

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Protocol

Dans ce protocole, un oligonucléotide (RBMB1) a été marquée à son extrémité 5 'avec un colorant rapporteur CF640R et a la séquence: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3'. domaines auto-complémentaires, qui déterminent la formation de la structure en épingle à cheveux, sont en caractères gras. Le deuxième oligonucléotide (RBMB2) a été marqué à l'extrémité 3 'avec un extincteur Noir Iowa RQ-Sp et a la séquence: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'.

1 Préparation de RBMBs

  1. Effectuer une rotation rapide des tubes contenant les RBMB1 et RBMB2 oligonucleotides, afin d'assurer l'oligonucléotide est séché à la partie inférieure du tube, et remettre en suspension dans l'eau et de la DNase exempte de RNase à une concentration finale de 100 uM. Par exemple, un échantillon de 10 nmoles de l'oligonucléotide doit être remis en suspension dans 100 ul d'eau.
  2. Measure de la concentration exacte des échantillons de RBMB1 RBMB2 licence et par spectroscopie UV-vis.
    1. Mélanger 3 pl de l'échantillon de RBMB avec 117 ul de DPBS (sans calcium et magnésium) dans un microtube de centrifugation.
    2. Blank spectrophotomètre avec du DPBS et mesurer l'absorbance de 200 à 800 nm. Note: Pic absorbances à 260 nm et 650 nm doit être visible.
    3. Calculer la concentration des stocks des échantillons de RBMB basées sur l'absorbance à 260 nm (ou 650 nm pour RBMB1), en utilisant l'équation:
      Stock Concentration (M) = A 260 * facteur de dilution / coefficient d'extinction où A 260 est l'absorbance à 260 nm et le facteur de dilution est de 40.
      Remarque: Le coefficient d'extinction pour la RBMB se trouve sur la fiche technique fournie par le fabricant d'oligonucléotides. Le coefficient de CF640R d'extinction à 650 nm est 103000.
  3. Mélanger 20 pi de 100 uM RBMB1, 30 pl de 100 uM RBMB2, 6 pi 10x, Un tampon de phosphate (10x tampon phosphate 480 mM, K 2 HPO 4, 45 mM de KH 2 PO 4, 140 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) et 4 ul d'eau et de la DNase sans RNase. Incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 min. Note: Ceci est généralement suffisante pour environ 50 études.
  4. Préparer une colonne de chromatographie liquide en utilisant 75 Superdex qualité prép pour éliminer tous les oligonucléotides non hybridés RBMB2. Utiliser un 8 ml (0,7 x 20 cm) de colonne de chromatographie en phase liquide avec un volume de ~ 4 ml de lit de purifier le petit volume de sondes mixtes.
  5. Laver et s'équilibrer avec la Superdex ~ 50 ml de tampon phosphate de 1x en utilisant une pompe de seringue en cours d'exécution à un écoulement à un débit de 0,6 ml / min. Avant tout le fluide pénètre dans le volume du lit, arrêter la pompe de la seringue, retirez-le, et laissez le liquide restant passent par la colonne par gravité.
  6. Charger le mélange RBMB (60 pl) sur la colonne de chromatographie.
    1. Après que l'échantillon de RBMB a complètemententrée dans le lit, ajouter lentement encore 250 ul de tampon phosphate de 1x à la partie supérieure du lit de sorte que tout l'échantillon soit complètement entré dans la colonne.
    2. Remplir la colonne de la jante avec un tampon de phosphate 1x. Fermer le haut, et démarrer la pompe de la seringue - la seringue doit être rempli avec ~ 50 ml PBS 1x et de fonctionner à un taux de 0,6 ml / min.
    3. Une fois que le RBMB se rapproche de la partie inférieure de la colonne - l'échantillon de RBMB peut généralement être facilement visualisé en raison de la couleur du colorant incorporé dans la sonde - recueillir le flux continu à deux gouttes par microtube (1,5 ml). Arrêter la collecte de l'échantillon, une fois la couleur dans les microtubes devient clair.
  7. Mélanger les tubes contenant l'échantillon de RBMB couleur - généralement 5-6 tubes - et charger dans un dispositif de filtre centrifuge (10 000 MW de coupure). Centrifuger l'échantillon à 10 000 RCF pendant 20 min ou jusqu'à ce que le volume désiré. Remarque: Ces vitesses et les durées généralementobtenir un volume final de 30 ul ~.
  8. Mesurer la concentration exacte de l'échantillon de RBMB purifié par spectroscopie UV-Vis.
    1. Prendre 3 ml de l'échantillon de RBMB concentrée et mélanger avec 117 DPBS ul dans un tube à centrifuger.
    2. Blank spectrophotomètre avec du DPBS et mesurer l'absorbance de 200 à 800 nm. Note: Pic absorbances à 260 nm et 650 nm doit être visible.
    3. Calculer la concentration de l'action de la RBMB hybride basé sur l'absorption à 650 nm, en utilisant l'équation:
      Stock Concentration (M) = A 650 * facteur de dilution / coefficient disparu où A 650 est l'absorbance à 650 nm, le facteur de dilution est de 40.
      Remarque: Le coefficient d'extinction pour CF640R à 650 nm est de 103.000 et le coefficient d'extinction pour l'Iowa noir RQ est ~ 20000. Les coefficients d'extinction sont additives et ne sont pas sensibles à l'hybridation. Par conséquent, l'échantillon de stock RBMB a un coefficient d'extinction combiné de approximately 123 000 à 650 nm.
  9. Etiqueter le tube de façon appropriée avec le nom et la concentration et conserver à -20 ° C pour une utilisation future.

2 Préparation de poly-D-lysine couché 8 bien chambré lamelle couvre-objet

  1. Préparer une solution à 0,2 mg / ml de poly-D-lysine par dissolution de 5 mg de poly-D-lysine (poudre lyophilisée, g irradié) dans 25 ml d'eau stérilisée dans un environnement stérile.
  2. Ajouter 200 ul de l'/ ml de solution de poly-D-lysine 0,2 mg dans chaque puits d'une lamelle de 8 puits à chambre, dans un environnement stérile.
  3. Incuber à température ambiante pendant 16 à 18 heures sous la hotte de culture cellulaire.
  4. Aspirer la Poly-D-lysine et laver le bien 3 fois avec de l'eau distillée stérile. Remarque: Les diapositives de la chambre enrobés peuvent être conservés à 4 ° C.

3 Sonde livraison

Remarque: Le système cellulaire utilisé doit contenir un gène chimère intégré qui exprime l'ARN avec au moins 4 séquentielle bindtion des sites pour la RBMB dans la région 3 'non traduite (UTR). Les séquences cibles doivent être complémentaires à la boucle de la RBMB. Il est conseillé que comme contrôle négatif, la même lignée de cellules est conçu pour exprimer la même construction génétique, mais sans les répétitions en tandem. Dans ce protocole, une lignée cellulaire de fibrosarcome humain HT1080, a été modifiée pour exprimer l'ARN de GFP avec 96 répétitions en tandem de la séquence cible d'RBMB dans la 3'-UTR. La lignée cellulaire de commande a été conçu pour exprimer un ARN de GFP de type sauvage.

  1. cellules de plaque dans une fiole de T25 à 40-50% de confluence un jour avant la livraison de la sonde. Culture des cellules avec du milieu DMEM supplémenté avec 1% de pen / strep et 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  2. Le lendemain, allumer le microporateur et configurer les paramètres de microporation à 950 V, 2 impulsions, 25 ms. Note: Ces paramètres ont été optimisés pour les cellules HT1080, mais ils sont d'un type cellulaire dépendante et peut être adjusted pour d'autres types de cellules comme décrit dans les instructions du fabricant.
  3. Remplir le tube de microporation avec 4 ml de tampon électrolytique et placez-le sur la station de microporation.
  4. Sortez le stock échantillon de RBMB purifié et dégivrer. Diluer plusieurs microlitres à une concentration finale de 12 uM avec du tampon phosphate de 1x. 1 ul sont nécessaires pour chaque microporation.
  5. Introduire à la pipette 1 ml de milieu de culture avec du FBS, sans antibiotiques, mais dans un tube à centrifuger. Remarque: Il sera utilisé pour les cellules en suspension immédiatement après microporation et peut être annulée, à proximité du dispositif de microporation, pour le moment. L'inclusion d'antibiotiques dans les milieux de culture diminue la viabilité des cellules après microporation.
  6. Retirer les milieux de culture cellulaire à partir des cellules HT1080 modifiées (60-80% de confluence), laver les cellules avec 1 ml de Ca2 + et Mg2 + Les DPBS -Free une fois, et on incube avec 1 ml de trypsine pendant 1-2 min.
  7. Arrêtez le trypsinization en ajoutant 1 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, des antibiotiques et sans rouge de phénol, et transférer les cellules dans deux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation.
  8. Centrifuger les cellules dans le tube à centrifuger à 200 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant, remettre en suspension et mélanger les culots de cellules dans un volume final de 1 ml de DPBS.
  9. Prenez 10 ul de la suspension cellulaire bien mélangé et compter les cellules.
  10. Introduire à la pipette les cellules de haut en bas plusieurs fois pour s'assurer qu'ils sont bien dispersés et transférer 300 000 cellules avec DPBS dans un nouveau tube de 1,5 ml et centrifuger à 200 g pendant 5 min.
  11. Eliminer le surnageant, en faisant attention de ne pas perturber le culot cellulaire. Reprendre le culot dans 11 ul de tampon de remise en suspension et la pipette de haut en bas plusieurs fois pour s'assurer que les cellules sont bien dispersées. Veillez à ne pas générer des bulles d'air. Remarque: Les bulles d'air vont provoquer une étincelle pendant microporation et aboutir à la livraison de RBMB pauvres et la mort cellulaire.
  12. Ajouter 1 pl de la RBMB dilué (12 M) et bien mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Encore une fois veiller à ne pas générer des bulles d'air.
  13. Aspirer 10 pl du mélange RBMB-cellule, à l'aide de la pipette de microporation, et insérer la pipette dans le tube de microporation. Appuyez sur le bouton start pour démarrer le microporation. Remarque: Il doit y avoir aucune bulle d'air visibles dans la pointe.
  14. Lorsque l'écran de la montre microporateur fin, retirer la pipette de la gare, expulser le mélange de 10 pi dans le tube à centrifuger qui a été préparé plus tôt, avec 1 ml de milieu de culture avec du FBS mais sans antibiotiques. Mélanger doucement en faisant basculer le tube d'un côté à côté à plusieurs reprises.
  15. Faites tourner les cellules à 200 g pendant 5 min et laver les cellules deux fois, dans 1 ml de phénol rouge milieu de culture sans FBS avec mais sans antibiotiques, pour enlever les RBMBs qui n'ont pas été livrés dans les cellules. Remettre en suspension avec 400 ul de phénol milieu de culture sans rouge avec du FBS mais sansantibiotiques.
  16. Plate cellules micropore dans la lamelle revêtue de 8 puits chambré à 200 ul par puits ou à la confluence souhaitée Poly-D-lysine.
  17. Facultatif: Si il est souhaitable de l'image du noyau, ajouter Hoechst 33342 à des cellules à une concentration finale de 0,01 mg / ml.
  18. Placez les lamelle chambré dans un incubateur de culture cellulaire. Incuber les cellules pendant 1-2 heures avant l'imagerie, de sorte que les cellules aient suffisamment de temps pour s'installer sur la surface de la lamelle. Remarque: L'imagerie peut être effectuée dès 30 min post-microporation.

4 Image Acquisition

  1. Allumer le système supérieur d'incubation en direct de l'étage de cellule et s'équilibrer jusqu'à ce qu'il atteigne 37 ° C, 5% CO 2 et 75% d'humidité.
  2. Allumez la source de lumière microscope et fluorescent et ouvrir le logiciel Metamorph. Remarque: Les autres logiciels similaires pour le contrôle de microscope et d'acquisition d'image peuvent également être utilisés.
  3. Appliquer de l'huile Immersol à l'objectif.
  4. Transférer la lamelle chambré avec des cellules micropore au système haut d'incubation en direct au stade de cellule. Incuber le système d'étape haut jusqu'à ce que la température et la concentration de CO 2 sont stabilisées.
  5. Ouvrez l'onglet Acquérir, dans le logiciel Metamorph. Cliquez sur le bouton Show Live de trouver le terrain, la mise au point sous une lumière blanche et cliquez sur le bouton Stop Live.
  6. Sous l'onglet Acquisition, cliquez sur le bouton et ouvrir de pop-up acquisition de flux, et de configurer les paramètres d'acquisition de films souhaités. Acquérir 150 images en utilisant le filtre Cy5 / CF640R et enregistrez les images sur le disque dur.

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Representative Results

Peu de temps après la microporation de cellules HT1080 en présence d'RBMBs, des transcrits d'ARN individuels qui ont été modifiés pour contenir de multiples sites de liaison de RBMB à leur extrémité 3 'UTR apparaissent des taches fluorescentes comme lumineuses lorsque imagé par l'ensemble du domaine de la microscopie à fluorescence (figure 2). Alors que les transcrits d'ARN individuelles avec les sites de liaison aussi peu que quatre de RBMB peuvent être visualisés dans les cellules vivantes, plus les sites de l'extrémité 3 'UTR liaison RBMB, plus le signal fluorescent. En outre, les plus RBMBs qui sont liés à chaque transcription la plus l'ARN peuvent être visualisés avant que le signal est perdu en raison de photoblanchiment. Dans ce protocole, l'ARN a été conçue pour contenir des séquences répétées 96 en tandem de la séquence cible d'RBMB dans la 3'-UTR. L'acquisition d'images en continu permet transcrits d'ARN individuelles à imager en temps réel (Film 1). Transcrits d'ARN individuelles peuvent être facilement vus se déplaçant dans le cytoplasme et le noyau of les cellules. Alors que la plupart des taches semblent subir les mouvements browniens ou sous-diffusifs, dans de rares cas, un ARN soumises à un transport réalisé sera observée (Film 2). Thèses transcrits d'ARN se déplacent généralement rapidement le long d'une trajectoire rectiligne (figure 3); Toutefois, certains ARN ne suivent des trajectoires courbes ou apporter des changements brusques de direction. Ces mouvements sont en contraste frappant avec les mouvements browniens, qui sont de nature aléatoire et présentent de petits déplacements d'ensemble dans les délais courts acquis ici (c'est à dire <1 min). Les mouvements d'ARN dirigés sont compatibles avec le transport de l'ARN le long des microtubules et des microfilaments. Ces expériences indiquent que RBMBs fournissent un outil polyvalent et robuste pour l'imagerie de transcrits d'ARN dans des cellules vivantes individuelles.

Figure 1
Figure1 Représentation schématique de la méthodologie et RBMBs image utilisée transcrits d'ARN dans des cellules vivantes individuelles. A) RBMBs en présence et en absence de l'ARN cible complémentaire. Dans l'absence de l'ARN ou de la cible, la fluorescence est éteinte RBMB. En présence de l'ARN cible, la fluorescence de RBMB est rétabli. B) RBMBs multiples lient chaque transcription de l'ARN créer une tache fluorescente lumineuse qui peut être détecté par grand champ microscopie à fluorescence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Représentant l'image des cellules HT1080 exprimant de façon stable l'ARN avec A) 96 répétitions en tandem ou B) 4 répétitions en tandem de site de liaison à RBMBla 3'-UTR, à la suite de la délivrance intracellulaire de RBMBs. La présence de répétitions en tandem de 96 permet transcrits d'ARN individuelles apparaissent comme des taches fluorescentes vives. ARN contenant uniquement des séquences répétées en tandem à 4 peut également être visualisé, mais l'intensité des taches fluorescentes est très faible et souvent uniquement détectable dans les zones de fond exceptionnellement bas. Le petit nombre de points particulièrement lumineux correspond à l'ARN qui ne bouge pas. Barre d'échelle: 10. Pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 Montage d'une transcription de l'ARN en cours de transport dirigée. La trajectoire de la transcription est montré dans la plus gauche panneau. La trajectoire est superposée sur une seule fRame de la série chronologique. Barre d'échelle:. 2,5 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film 1. film représentatif de cellules HT1080 exprimant de façon stable l'ARN avec des répétitions en tandem de 96 site de liaison de RBMB dans la 3'-UTR, à la suite de la délivrance intracellulaire de RBMBs. Transcrits d'ARN individuelles apparaissent comme des taches fluorescentes brillantes. Barre d'échelle: 10. Pm Cliquez ici pour voir la vidéo.

Film 2 de film représentant d'une transcription de l'ARN soumises à un transport réalisé. Barre d'échelle: 10. Pm Cliquez ici pour voir la vidéo.

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Discussion

La capacité d'une seule image de transcription d'ARN dans des cellules vivantes modifiées à l'aide d'un microscope à champ large classique nécessite un signal lumineux fluorescent et photostable à être associée à chaque produit de transcription d'ARN et un faible bruit de fond de fluorescence émanant de sondes fluorescentes non liés. Dans ce procédé, un signal lumineux fluorescent est obtenu par hybridation multiple (jusqu'à 96) des sondes fluorescentes à base d'oligonucléotides, à savoir RBMBs, sur chaque transcrit d'ARN. Toutefois, aussi peu que quatre fixations sites sont suffisantes 16. Les signaux collectives aboutissent à une tache fluorescente lumineuse qui peut suivis en temps réel. La présence de multiples sondes permet également de plus longs temps d'imagerie, depuis une fraction substantielle des colorants fluorescents doivent être Photo-blanchissement collective avant que le signal est perdu. Il est envisagé que cette technique fournira une perspective unique sur l'ARN biologie et permettre l'étude d'un large éventail de comportements d'ARN allant de la mesure de eréponse e de trafic de l'ARN à différents stimuli externes, en observant les modèles de localisation subcellulaire uniques d'ARN cible, en étudiant le destin et la vie de l'ARN, et donnant un aperçu de la réglementation de l'ARN. En outre, il peut être possible de suivre l'évolution (c'est à dire en amont et en régulation) dans l'expression de l'ARN. Bien que cette possibilité n'a pas encore été corrigée, nous avons précédemment montré que le nombre de copies d'ARN peut être quantifié de manière assez précise pour un maximum de 24 heures 22 dans des cellules vivantes. En outre, RBMBs ne semblent pas affecter le niveau d'expression du gène. Ensemble, ces résultats fournissent une preuve initiale que les changements dans l'expression des gènes au cours de cette période ont été suivis de façon précise, sur une base cellule par cellule, et que RBMBs n'a pas conduit à une augmentation de la stabilité de l'ARN ou ralenti la dégradation des ARN. Cependant, il n'est pas clair dans quelle mesure l'expression du gène réellement changé pendant ce temps le cas échéant.

En général, il ests'attend à ce que toute augmentation de l'expression des gènes devrait être facilement identifiable; en raison de l'abondance de RBMB non liée à la cellule qui est libre de se lier transcriptions nouvellement formés. Cependant, ce qui est moins clair, c'est la façon dont RBMBs se dissocient de l'ARN lors de la traduction et de la dégradation et si il ya un certain décalage entre l'expression de l'ARN / dégradation et l'imagerie de ces transcriptions. Des études complémentaires sont encore nécessaires pour mieux comprendre la performance de RBMB dans ces scénarios.

Plusieurs approches alternatives à l'imagerie des transcrits d'ARN simples ont été signalés auparavant. Les premières études ont porté sur l'étiquetage fluorescence transcrits d'ARN isolés et de réintroduction de ces transcriptions dans les cellules, généralement par microinjection 23,24. Le signal-bruit de fond de cette approche est très élevé, en raison de la possibilité de supprimer des colorants fluorescents non liés, mais il ya des préoccupations quant à savoir si le comportement de l'ARN observée représente exactement true traitement de l'ARN. La solution la plus courante à cette lacune a impliqué transgènes d'ingénierie avec des répétitions en tandem dans l'extrémité 3 'UTR qui peuvent être liés par un rapporteur fluorescent, analogues à l'approche de RBMB présenté ici. Rapporteurs fluorescents précédents ont inclus de petites molécules qui ne sont fluorescents sur des aptamères d'ARN, communément appelés épinards 25, et la GFP contraignant. Épinards n'a pas encore été utilisé pour l'imagerie des transcrits d'ARN simple, mais a été utilisé pour l'image expression globale. En revanche, la GFP a été utilisé avec succès à l'image des transcrits d'ARN simple. Dans cette approche, un rapporteur GFP est fusionné à la protéine d'enveloppe de phage MS2 bactérienne (GFP-MS2) et se lie à un ARN conçue construire avec des répétitions en tandem du site de liaison de MS2 dans la 3'-UTR de 2,10. Bien que cette approche est très similaire à l'approche décrite ici, RBMBs offrent plusieurs avantages. Par exemple, des fluorophores organiques RBMBs permettent d'être utilisés pour l'imagerie, qui fournit une plus grande diversité de choix avec photostabilité et une luminosité supérieure à celle des protéines fluorescentes. En outre, il existe de nombreux fluorophores organiques disponibles dans le commerce qui émettent dans l'extrême à l'infrarouge proche. L'avantage de choisir des colorants avec des spectres d'émission décalée vers le rouge provient de l'autofluorescence cellulaire faible observée à ces longueurs d'onde. Etant donné que des niveaux élevés d'auto-fluorescence peuvent facilement étouffer les signaux fluorescents liés à l'hybridation de l'ARN, la capacité de réduire considérablement autofluorescence fournit une augmentation importante du rapport signal à bruit de fond. Un autre avantage important de l'utilisation RBMBs est que le signal provenant des sondes non liées est significativement éteinte. Bien, différentes approches ont été prises pour réduire la fluorescence de la GFP non lié à l'approche GFP-MS2, par exemple, l'utilisation des signaux de localisation nucléaire fond, contrôler les niveaux d'expression de la GFP, et divisée GFP complémentation 1,10,11,26,27, l' présence d'un MOIE trempe réelté dans la conception de RBMB fournit aux utilisateurs une plus grande flexibilité expérimentale. Par exemple, l'approche par RBMB est relativement insensible à la fois le niveau et par rapport au total de l'expression de l'ARN et de la concentration de la sonde. En fait, les transcrits individuels peuvent être imagés avec des concentrations de RBMB qui s'étendent sur un ordre de grandeur. Les avantages combinés de photostabilité élevée, le signal lumineux, et le fond inférieur permettent en temps réel des expériences d'imagerie de l'ARN avec RBMBs beaucoup plus accessibles pour les utilisateurs de microscopie avec des compétences limitées.

Peut-être, l'inconvénient le plus notable de l'utilisation de sondes exogènes tels que RBMBs, contrairement à un journaliste moléculaire tels que la GFP, est la nécessité d'une administration intracellulaire. Heureusement, un certain nombre d'options existent, par exemple, la micro-injection 28, les agents de transfection 29, pénétration cellulaire des peptides 30 et Streptolysine O (SLO) 31. Personnellement, nous avons constaté que microporation estle sympathique et polyvalent option la plus utilisateur, qui entraîne généralement> 95% de viabilité et l'efficacité de livraison 21. C'est probablement parce que le processus d'électroporation microlitre volume présente une réduction de nombreux événements néfastes souvent associées à une électroporation, y compris la génération de chaleur, la dissolution de l'ion métallique, la variation de pH et de formation de l'oxyde. Surtout, microporation est également prête à des études à haut débit, depuis RBMBs peuvent être livrés dans> 100.000 cellules en une seule expérience.

Malgré les nombreux avantages de l'utilisation RBMBs à la localisation de l'ARN de l'image et du mouvement dans les cellules vivantes, un certain nombre de limites et des défis demeurent. Peut-être, le plus grand défi est l'incapacité à suivre l'ARN pour plus de quelques minutes sous exposition continue. Ceci est une conséquence à la fois de photoblanchiment et la capacité de l'ARN à se déplacer hors du plan focal de formation d'image. Colorants brillantes et plus photostable peuvent aider alleviate de ces lacunes à la fois, en augmentant le nombre de fois que chaque colorant peut être excité et en permettant aux taches fluorescentes discrètes à imager à plus grande distance du plan focal. Une approche prometteuse pour augmenter la photostabilité implique l'utilisation de colorants d'auto-guérison, qui utilisent l'état triplet extincteurs à proximité du fluorophore organique de prolonger leur durée de vie 32. Une autre option peut être l'utilisation de polymères conjugués fluorescents amplification, qui sont composées d'un grand nombre de fluorophores qui ne sont pas connectés l'auto-refroidissement brusque. Ces polymères peuvent être plusieurs fois plus lumineux que les fluorophores organiques simples et pourtant encore être efficacement refroidi par un seul groupement d'extinction 33,34; Toutefois, des travaux supplémentaires dans ce domaine est encore nécessaire. Il convient de noter que l'imagerie par intermittence, avec un taux de trame> une trame par seconde, ne peut être réalisée à l'image d'un transcrit d'ARN unique sur de longues périodes de temps, car il est difficile de s'assurer qu'il est til même transcription de l'ARN objet d'un suivi de cadre à cadre. Bien entendu, l'évaluation quantitative de l'expression des gènes au niveau de la cellule unique est toujours possible sur de longues périodes, par le comptage des taches fluorescentes individuelles sur une base 16,35,36 par des cellules. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire de garder la trace des transcrits individuels. Dans l'ensemble, on estime que RBMBs sont en mesure de fournir des indications importantes sur la fonction de l'ARN et permet l'imagerie de simples transcriptions d'ARN modifiées avec un équipement de microscopie conventionnelle et une expertise limitée.

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Disclosures

Dr Mark Behlke et le Dr Ling Huang sont employés par IDT qui offre des oligonucléotides à vendre proche de certains des composés décrits dans le manuscrit. IDT est, cependant, pas une société cotée en bourse et ils ne possèdent pas personnellement des actions / fonds propres dans IDT.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Prix National Science Foundation CARRIÈRE (0953583) et l'Institut national de la santé NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

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References

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Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons
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Song, Y., Zhang, X., Huang, L.,… More

Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

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