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A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL)

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DOI:

10.3791/51549

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23 de maio de 2014

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1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur

Neste artigo

Resumo

Expandindo a fundação e aplicabilidade da fluorescência por Unbound excitação de luminescência (FUEL) através do levantamento os princípios relevantes e demonstrar a sua compatibilidade com uma infinidade de fluoróforos e condições alvo de anticorpos.

Resumo

Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL) é um processo de emissão de excitação radiativa que produz um aumento do sinal e realce de contraste in vitro e in vivo. Ações de combustível Muitos dos mesmos princípios subjacentes como Transferência Bioluminescência Resonance Energy (BRET), mas é muito diferente nas distâncias de trabalho aceitáveis ​​entre a fonte luminescente ea entidade fluorescente. Enquanto BRET que se encontra limitada a um máximo de duas vezes o raio de Förster, geralmente menos do que 14 nm, o combustível pode ocorrer a distâncias até ao fim ou mesmo centímetros na ausência de um absorvedor óptico. Aqui vamos expandir sobre o fundamento e aplicabilidade do FUEL, revendo os princípios relevantes por trás do fenômeno e demonstrar a sua compatibilidade com uma ampla variedade de fluoróforos e nanopartículas fluorescentes. Além disso, a utilidade de COMBUSTÍVEL alvo-anticorpo é explorado. Os exemplos mostrados aqui fornecem evidências de que o combustível pode ser utilizado para applications onde BRET não é possível, preenchendo o vazio espacial que existe entre BRET e toda tradicional imagem dos animais.

Introdução

A modificação genética de organismos, tais como os vírus 1, 2, 3, bactérias ou pequenos mamíferos ou 4 para induzir ou bioluminescência constitutivamente expresso, tem sido muito bem sucedido e amplamente demonstrado 5-7. A bioluminescência, uma reacção quimioluminescente in vivo envolvendo reagentes que ocorrem naturalmente, tem a vantagem de produzir luz sem a necessidade de uma fonte de luz externa. Como tal, a imagem de bioluminescência não sofre os inconvenientes comuns de sinal de auto-e não específica encontrados a partir de imagens de fluorescência 8. Por conseguinte, a bioluminescência tem uma proporção significativa de sinal-para-ruído, uma vez detectado qualquer sinal proveniente apenas da fonte destinada. Enquanto muitos modelos têm explorado o operon lux de luminescens Photorhabdus (máximo de emissão centrado entre 480 e 490 nm) para in vitro e in vivo 9 aplicações, seu uso em pequena mammals tem sido problemática devido à própria natureza das condições de imagem; a existência de impregnante absorvedores ópticas, tais como a hemoglobina, e agentes de dispersão, tais como tecidos e ossos, fortemente afectar azul para os comprimentos de onda amarelas 3. A expressão de uma luciferase de pirilampo engenharia (máximo de emissão a 617nm) foi desenvolvido recentemente e incorporada, fornecendo uma ferramenta que ultrapassa grandemente a absorção óptica 10, mas ainda está sujeito a efeitos de espalhamento.

Em resposta, tem havido várias tentativas para vermelho-deslocar o sinal emitido para a janela óptica desejada de 650-900 nm, uma região de absorção e dispersão minimizado, utilizando transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) 11-13. Como uma ferramenta para melhorar a detecção do sinal, BRET, que utiliza uma fonte bioluminescente como o dador e um fluoróforo adicionado como o aceitador, tem encontrado um sucesso limitado. Como um exemplo seminal desse fenômeno ", auto-iluminação pontos quânticos4; (SIQDs) 14 consistem modificado Renilla reniformis luciferases ligados à camada de polímero-lisina externo quântica de disponível comercialmente pontos (QDs). Após a adição do substrato, a reacção bioluminescente induz a emissão de fluorescência a partir de QDs, gerando uma produção significativa de fotões vermelhos. No entanto, estes SIQDs têm limitado a aplicabilidade na visualização in vivo de eventos fisiologicamente relevantes. Esta aplicabilidade limitada, é provavelmente devido à dificuldade de se ligar a sonda dupla para o órgão, célula ou do gene de interesse, uma vez que os SIQDs não pode ser geneticamente codificado e, portanto, seria necessária uma modificação secundária do material de cobertura polimérica. Para melhorar a sua aplicabilidade, SIQDs alternativos, onde as luciferases estão vinculados diretamente ao núcleo luminescente, recentemente foram empregadas 15. Construindo fora do conceito SIQD, um sistema BRET mais aplicável foi alcançada ligando Cypridina luciferase de um emdocyanine corante 16, que era capaz de se direccionar especificamente tumores em ratinhos, enquanto a produção de um desvio para o vermelho substancial de 460 nm a 675 nm. Para submeter a transferência de energia não-radiativos, BRET segue os mesmos constrangimentos primárias como sua contraparte fluorescente: deve haver uma forte sobreposição espectral entre a emissão de dador e o aceitador de espectros de excitação e a distância de trabalho entre as duas porções deve ser da ordem do raio de Förster (5-14 nm dependendo do par dador-aceitador, com uma distância máxima eficaz de duas vezes o raio de Förster 17). Esta dependência distância limita muito os tipos de eventos que podem ser observadas usando BRET como um meio para melhorar a detecção.

Recentemente, uma nova abordagem foi identificado e demonstrados com estudos in vitro e em condições in vivo. Aproveitando a fundação de BRET, Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL) 18, 19 também requer uma forte sobreposição espectral entre o luminescente e componentes fluorescentes. No entanto, ao contrário BRET, o combustível é um processo completamente radiativa em que o fotão emitido a partir da fonte luminescente é absorvida por um fluoróforo opticamente acessíveis, o que posteriormente emite um fotão vermelho deslocado de acordo com o rendimento quântico de fluoróforo. Semelhante a BRET, esta abordagem também pode ser utilizada para ultrapassar as limitações de imagiologia, na presença de absorventes ópticos. O desvio para o vermelho resultante proporciona um aumento global e especificidade do sinal detectado, devido a uma diminuição da atenuação e de uma redução dos efeitos de dispersão óptica. COMBUSTÍVEL foi relatado para ocorrer entre Escherichia coli bioluminescentes expressando o operon lux e QDs 18, 19. Enquanto experimentalmente semelhante aos SIQDs, existe uma diferença fundamental: em combustível, ele não é necessário para a fonte luminescente estar fisicamente ligado ao fluoróforo, o qual permite que for codificação genética da sonda luminescente. Devido ao êxito da detecção de combustível entre as bactérias luminescentes e QDs, é possível que esta técnica pode ser aplicada a ambos superficial (pele) e profunda do tecido (pulmão, fígado) infecções, tais como Staphylococcus aureus e Klebsiellia pneumoniae.

Desde o relatório do seu significado experimental, COMBUSTÍVEL evoluiu para incluir um modelo matemático robusta 20, que pode ser utilizado para prever luminescente aceitável e pares fluorescentes, e as suas aplicações foram expandidas para incluir o uso na identificação das características fotofísicas, tais como o rendimento quântico. Nós descrevemos abaixo algumas das técnicas básicas de combustível. Primeiro, vamos mostrar evidências para esse fenômeno sobre a curto (mm) e comprimento (cm) distâncias de trabalho, o que fundamentalmente distingue COMBUSTÍVEL de BRET. Em segundo lugar, expandir os possíveis pares de combustível em examinar uma ampla variedade de fluoróforos e nanopartículas fluorescentes. Third, aplicações de combustível são investigados, comparando pares COMBUSTÍVEL alvo e não-alvo.

Protocolo

1. Reagentes

  1. Compra ou desenvolver bactérias luminescentes e meios de cultura apropriados, tais como Escherichia coli modificada expressando a ABCDE 21 lux, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22.
  2. Prepare uma solução salina fisiológica (NaCl 0,9%) e as soluções de meios de cultura de acordo com receitas-padrão. E. coli e K. pneumoniae foram cultivadas em meio Luria Bertani (LB) a 37 ° C, e V. fischeri e Photobacterium sp em LB suplementado com 0,5 M de NaCl a 22 ° C.
  3. Aquisição ou adquirir sondas fluorescentes, tais como Q-rastreador 705 (40 nm de diâmetro, que se refere a como QD705), Q-rastreador 800 (40 nm de diâmetro, que se refere a como QD800), fluorescente (40 nm de diâmetro) e microesferas de poliestireno não-fluorescente ( 48 nm de diâmetro), e corantes fluorescentes convencionais.
  4. Prepare os reagentes necessários para a rotulagem bacteriana.
  5. Assegurar o acesso aosum gerador de imagens de bioluminescência animal inteiro, tal como um IVIS Spectrum, que é capaz de detectar o sinal em uma ampla gama de comprimentos de onda de emissão e os tempos de exposição. Um leitor de placas capaz de medições bioluminescência é suficiente para a maioria das experiências aqui descritas.

2. Recapitulation Básico de COMBUSTÍVEL

  1. A partir de colônias individuais em placas de cultura padrão, comece culturas durante a noite de bactérias luminescentes. Aqui, V. Foram utilizados fischeri.
  2. No dia da experimentação, iniciar subculturas frescos e permitir-lhes a progredir até uma DO600 de 1-1,5 é alcançado. De modo a produzir resultados comparáveis, é melhor utilizar as bactérias nos estados de crescimento semelhantes em que se produzem os sinais intensos. Isto pode ser assegurado por manter o 600 constante OD.
  3. Combinar alíquotas de 100 ul de cada, quer com 5 ul de QD705 ou solução salina fisiológica (PS), e, em seguida, adicionar a 895 mL de PS em Standatinas rd espectroscópicas. Coloque as tinas cheias no IVIS Spectrum e tomar as medidas de acordo com as filtros adequados. Aqui, utilizou-se o filtro de emissão de 710-730 nm.

3. Combustível sobre diferentes distâncias

  1. Encha dois reduziu o volume (1 ml) fotométricos cuvetes de plástico, quer com 50 ul de QD705 ou 97,2 ul de não fluorescentes 48 nm microesferas de poliestireno, num volume total de 1 ml de PS. Isto assegura semelhante superfície sólida por volume total entre as duas entidades.
  2. Prepara-se uma cuvete de fonte de luz encerrando uma terceira tina com fita preta padrão ou outro material opaco capaz de bloquear a luz. Preparar-se cuidadosamente duas janelas ópticas idênticas em lados opostos da cuvete.
  3. Colocar as cuvettes previamente enchidos directamente para qualquer dos lados da tina de fonte de luz. Adicionar uma parte alíquota de 1 ml de V. cultura fischeri ou outra (isto é, E. coli ou luminescente Photobacterium sp) a partir de uma nova subcultura na cuvete de fonte de luz e cobri-lo com um material opaco, tal como o papel preto para reduzir a contaminação de luz.
  4. Visualize os três tinas sob os filtros de emissão adequadas, tais como a Luz total e 710-730 nm filtros de emissão, com tempos de exposição de 10, 30 e 30 segundos, respectivamente.
  5. Reposicionar os tinas externas equivalentes a distâncias maiores da cuba central, e, em seguida, visualizar novamente. Repita até uma distância de 3 centímetros definitivo face-a-face (central para reduzir o volume da cuvete) seja alcançada. A cada passo, adquirir uma imagem de fluorescência (excitação 450-480 nm, 710-730 nm de emissão) para validar o local QD705.

4. Investigando pares potenciais COMBUSTÍVEL

  1. Encha duas cuvetes de volume reduzido, com soluções de 1 ml contendo quer um fluoróforo ou uma nanopartícula fluorescente de interesse em uma, e PS ou PS com nanopartículas não fluorescentes como o controlo negativo na outra. Em diae trabalho demonstrou aqui, uma variedade de potenciais fluoróforos combustível disponível comercialmente e nanopartículas fluorescentes foram investigadas conforme descrito na Tabela 1.
  2. Adicionar uma parte alíquota de 1 ml de fresco V. fischeri ou outras bactérias luminescentes para uma terceira tina escurecidas contendo duas janelas ópticas fisicamente iguais situados em lados opostos. Cobrir a cuvete com uma substância opaca tal como uma folha de papel branco.
  3. A uma curta distância, mas iguais lugar as duas tinas de volume reduzido em ambos os lados da tina escurecidas e visualizar sob os filtros apropriados. Aqui, foi utilizada uma distância de 0,7 cm. Repita com os outros fluoróforos.

5. FUEL alvejado

  1. Preparar anticorpos biotinilados específicos para as bactérias luminescentes. Por exemplo, os anticorpos aqui primárias específicas para K. pneumoniae (α-Kp) foram biotinilados utilizando uma solução contendo o EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotina.
  2. Remover o excesso de reagente a partir dos anticorpos usando colunas de dessalinização sob centrifugação (1500 x g) durante 2 min.
  3. Usar um ensaio de Bradford padrão para determinar a concentração de proteína e determinar o grau de biotinilação do anticorpo por ensaio HABA.
  4. Obter o anticorpo biotinilado α-Kp-biot (AB) por mistura de lotes de 100 mL (10 mM, dissolvido em PBS 1x), com 40 ul de anticorpo α-Kp, o que resulta em um grau final de substituição de 16 resíduos de biotina por Ab e uma última concentração de proteína de 10 mg ml -1.
  5. Usando múltipla durante a noite replicar culturas, alvo das bactérias lavado com os anticorpos acima mencionados a seguir o protocolo apropriado.
    1. Especificamente, a lavagem K. pneumoniae em 1x PBS, e ressuspender em 1x PBS a uma DO de 4 (ca. 4 x 10 8 UFC ml-1 OD-1).
    2. Para cada repetição, incubar 100 mL PBS, α -Anticorpos kp (10 ul α-Kp-biotB ou 10 ul de PBS para o controlo) e 100 ul de células durante 90 min a 30 ° C. Lave as células três vezes em 1x PBS, e ressuspender em 196 ul de PBS.
  6. Rotular as células com o conjugado estreptavidina QD705 e dividi-los em dois volumes equivalentes.
  7. Lavar uma solução três vezes e em seguida ressuspender em que o volume apropriado.
  8. Distribuir 100 ul das soluções lavadas e não lavadas em poços individuais de um negro placa de 96 poços. Meça a luminescência resultante sob a Luz Total, 490-510 nm e 710-730 nm filtros. Concentração de fluoróforo pode ser determinada utilizando 450-480 nm de excitação e de emissão de 710-730 nm.

Resultados

Transferência de Energia de Ressonância (RET), é uma interacção não-radiativos entre um doador e um aceitador luminescente fluorescente, pelo que a energia a partir do dador saiu é capaz de induzir uma resposta de fluorescência a partir do receptor por meio de uma interacção dipolo-dipolo forte 13. RET, o que tem sido descrito usando 23 fluorescente, quimioluminescente 24, e bioluminescentes 13 doadores, requer principalmente: uma sobreposição espectral entre a emissão forte dador e aceitador de espectros de excitação;. 2 alinhamento rotacional adequado entre as duas entidades.; e 3. uma distância de trabalho não seja superior a 0,5 a 2 vezes o raio de Förster, R 0, entre o doador e receptor 17. Contrastando com RET, COMBUSTÍVEL ocorre quando uma fonte luminescente, tal como uma bactéria bioluminescentes, emite um fotão que é absorvida e re-emitida por uma segunda entidade, tal como um fluoróforo ou uma nanopartícula fluorescente, vermelho-deslocando o SPECT de emissãorum da fonte luminescente originais. Assim, COMBUSTÍVEL segue um processo de emissão de excitação semelhante ao padrão de epifluorescência condições normais, no entanto, sem o uso de um concentrado de excitação. Prova disso pode ser facilmente observado pela simples mistura de bactérias luminescentes e altamente fluorescentes pontos quânticos. Na presença do Vibrio sp, um aumento significativo no sinal vermelho é observado quando QD705 também estavam em solução em comparação com um controlo não-fluorescente microesfera de poliestireno (Figura 1A). Os componentes necessários para criar a bioluminescência, essencialmente, do substrato de aldeído, a luciferase, e ATP, são produzidos e contido no interior do citoplasma. Além disso, a produção enzimática luminóforo ocorre dentro do citoplasma bacteriano (Figura 1B). Como foi relatado noutro local, a distância entre a membrana interna e externa da bactéria é tipicamente maior do que 30 nm, 25-27, a uma distância que não permite a RET significativade ocorrer. Além disso, as nanopartículas fluorescentes não atravessam para o citoplasma bacteriano uma vez que não existe a endocitose ou outros meios de absorção. Juntas, essas restrições indicam que o combustível é o fenômeno de emissão de excitação dominante que ocorre quando bactérias luminescentes são misturadas com nanopartículas fluorescentes.

Como foi mostrado anteriormente, FUEL existe além da gama de RET. Para investigar a dependência de combustíveis em distância, de volume reduzido cuvetes espectrofotométricos padrão pode ser usado, com uma solução que contém um fluoróforo, um segundo contendo um controle adequado que pode controlar a dispersão, e a terceira contém uma alíquota de solução luminescente fresco. É essencial que o centro da cuvete ser envolto com fita preta ou outro material opaco, com excepção de, pelo menos, duas janelas ópticas idênticas localizadas em faces opostas, para reduzir qualquer potencial contaminação de luz a partir da fonte luminescente. Além disso, as duas cuvetes restantes precisaser colocadas de forma equidistante em ambos os lados do centro da cuvete. Finalmente, uma solução luminescente fresco, por meio de bactérias ou de quimioluminescência, deve ser utilizada com cada experiência para assegurar uma produção máxima de luz. Após a colocação apropriada, adquirir o sinal de luminescência sob os filtros desejados. A luz total e 710-730 nm filtros foram utilizados neste caso, apesar de apenas os dados a partir do último é mostrado. Depois de cada uma das aquisições, aumentar de forma incremental a distância face-a-face entre 1,0 cm e 3 cm (Figura 2). Finalmente, normalizar todos os dados para o ponto mais brilhante. Nos exemplos utilizados aqui, isto ocorreu a uma distância mais curta (D = 1 cm) entre a fonte luminescente e a cuvete contendo o QD705. Utilizando esta abordagem, o sinal COMBUSTÍVEL viável pode ser observado até a aquisição definitiva sugerindo que, na ausência de qualquer absorvedor óptico, o combustível pode ocorrer a distâncias superiores a qualquer eventual transferência de energia de ressonância e só pode ser explicada a ser puramente radiativoefeito. Ajustando os dados revelam uma diminuição do sinal como uma função da distância D na sequência de uma D-1 para a dependência D -2. Dependendo da configuração geométrica, a primeira corresponde à dependência distância capacitor eo segundo a lei do inverso do quadrado para fontes pontuais. Este resultado é, portanto, consistente com a configuração geral de aquisição, dado o tamanho da abertura da cuvete e a distância entre a fonte luminescente e o fluoróforo.

O combustível não se aplica somente a quantum dots, mas também pode ser observada por meio de uma ampla variedade de fluoróforos que variam a partir da série de microesferas fluorescentes Alexa (Tabela 2). A fim de ser comparável à de controlo, as concentrações iguais dos vários fluoróforos deve ser usada e a área total da superfície das nanopartículas mantido constante (Tabela 1). Ao comparar os fluoróforos e nanopartículas para seus controles apropriados (PS ou PS com não-fluorescentemicroesferas de poliestireno), um aumento significativo no sinal é observada no máximo de emissão de cada entidade fluorescente. Foi encontrado o maior aumento relativo do sinal de ocorrer onde o máximo de emissão de fluorescência foi mais distante a partir do máximo de emissão luminescente. Isto é o mais provável devido ao aumento da especificidade do sinal de fluorescência em comparação com o largo espectro de emissão da fonte luminescente. Pelo contrário, o sinal COMBUSTÍVEL menos fiável foi encontrado quando os dois máximos de emissão não foram bem separados. Curiosamente, um sinal COMBUSTÍVEL discernível foi encontrada com as microesferas amarelas, embora a diferença espectral é mínimo, provavelmente devido à quantidade substancial do fluoróforo presente por pérola (350 equivalentes de fluoresceína). Os resultados aqui apresentados indicam que sob condições apropriadas de combustível pode ser alcançada com uma variedade de fluoróforos, que permite a confecção de sondas escolhidas para aplicações mais pertinentes no âmbito tanto in vitro e em condições in vivo. O significado do sinal COMBUSTÍVEL observada foi determinada usando um teste t de Student bicaudal padrão. Como tal, apenas o Alexa555 foi considerado incompatível com a fonte luminescente usado.

A fim de explorar os efeitos da segmentação em FUEL, anticorpos biotinilados foram usados ​​para direcionar as bactérias luminescentes e QDs ligadas a estreptavidina. É importante que as bactérias ou fonte luminescência fornecer uma camada de espessura suficiente para minimizar a possibilidade de RET entre o luminófero e o fluoróforo correspondente. Após incubação e lavagem para remover os anticorpos não ligados, as bactérias marcadas com biotina são então expostas quer QD705 estreptavidina conjugada ou QD705 não-funcionalizada como o controlo, as soluções divididas e um conjunto expostos a lavagens adicionais a fim de remover qualquer não-aderente QD705. Aqui, para todas as quatro condições, a luminescência resultante foi observada sob a luz total, 490-510 nm, umad 710-730 nm filtros, embora apenas os dois últimos filtros são utilizados para a análise de dados. A presença do QD705 foi comparada através 450-480 nm de excitação e 710-730 nm filtros de emissão. Após investigação encontramos pouca ou nenhuma diferença no sinal vermelho deslocado quando as soluções foram deixadas em um estado sujo (Figura 3). O sinal de fluorescência resultante sob esta condição também é encontrado para ser muito semelhante, sugerindo que um número igual de QD705 estava presente tanto no âmbito do Estado-alvo e não-alvo. No entanto, a lavagem das amostras para remover qualquer QD705 solto proporciona um aumento de quase duas vezes na sinal vermelho em relação às bactérias alvo em relação ao seu controle não-alvo. Investigação de fluorescência pode ser utilizado para verificar a presença ou ausência do QD705. Comparativamente, a condição lavado alvo resultou em uma intensidade de fluorescência que foi quase três vezes menos do que a condição de sujo, mas o desvio para o vermelho resultante diminuiu apenas30%, sugerindo que sob as condições puramente ligados a segmentação das bactérias irá resultar num aumento da emissão vermelho deslocado. Isso implica fortemente a utilidade de FUEL direcionados para aplicações futuras.

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Figura 1. UM COMBUSTÍVEL interacção entre as bactérias luminescentes e disponíveis comercialmente quantum dots leva a um aumento na produção de fotões vermelhos. Duas cuvetes espectrofotométricos foram cheias com soluções contendo 100 mL alíquotas de fresco V. fischeri cultura com uma DO600 de 1-1,5, 895 ul de PS, e quer 5 ul de QD705 ou solução salina fisiológica (PS), antes de serem colocadas num espectro IVIS e o espectro de emissão adquirida. Um aumento significativo no sinal vermelho é alcançada devido à presença deo QD705, como pode ser observado pelo aumento fótons detectados • sec -1 • cm -2 (p • s -1 • cm -2) em relação ao controle sob o filtro de emissão de 710-730 nm (A). Aqui, a dupla membrana das bactérias exclui a interacção das porções luminescentes (círculos azuis) e a QD705 (círculos pretos). O ex-são encontradas apenas no citoplasma bacteriano enquanto o último são distribuídos gratuitamente na solução de massa (B). N = 3 para cada solução bacteriana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Evidência de FUEL ocorrendo em distâncias complexcluindo etely transferência de energia de ressonância. cuvetes espectrofotométricos foram preenchidas com soluções contendo quer 50 ul de QD705 e 950 ul de solução salina fisiológica (PS) ou de 97,2 ul de microesferas não fluorescentes 48 nm de poliestireno e 902,8 mL de PS, e colocada de modo equidistante, em lados opostos de uma cuvete negro central contendo 1 ml de fresco luminescente Photobacterium sp a um OD 600 de 1-1,5. A cuvete central de duas janelas ópticas idênticas, permitindo os fotões emitidos para dispersar livremente. Obtenção de imagens a distâncias (D) variando de 1,0 a 3 cm, a produção observada de luz vermelha diminuiu em função da distância que demonstre que o combustível pode ocorrer a distâncias não realizáveis ​​por transferência de energia de ressonância. A intensidade parecia ter D -2 dependência, semelhante à lei do inverso do quadrado (esquerda). O mesmo protocolo foi seguido por E. coli (direita). As linhas de tendência resultantes segurar forma ao conceito that as bactérias estão atuando como fontes pontuais de luz. Um total de três medições independentes distância foram adquiridos com cada usando uma subcultura única. As barras de erro estão presentes em cada ponto. Em alguns casos, as barras de erro foram menores do que os símbolos usados ​​que indicam a intensidade normalizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Uma comparação entre alvo (específico) e não-alvo (solução a granel) de combustível. K. pneumoniae foram funcionalizados com anticorpos biotinilados e, em seguida, expostos a um ou outro marcado com estreptavidina (Targeted) ou não-marcado (não-alvo) QD705. As soluções resultantes foram igualmente divided e um conjunto lavadas três vezes com PBS antes de serem ressuspensas no seu volume inicial em PBS. As soluções foram então distribuídas em poços individuais de uma placa preta de 96 poços e a bioluminescência observada sob os 490-510 nm (500 nm) e de 710-730 nm (720 nm), filtros de emissão (indicados como barras azuis). A p • • seg -1 cm -2 encontrado a partir do filtro de 720 nm para cada poço foi normalizado pela respectiva p • • seg -1 cm -2 intensidade bioluminescência do 500 nm do mesmo poço. A intensidade relativa de fluorescência resultante a partir de uma excitação de epifluorescência foi determinada usando 450-480 nm de excitação e de emissão de filtros 710-730 nm (indicado como barras vermelhas). Pouca ou nenhuma diferença no sinal bioluminescente ou fluorescente foi observada nas condições sujas (não-alvo Unwashed e alvejados Unwashed). Isto sugere que o limite e de livre flutuação QD705 foram igualmente animado com os fótons bioluminescentes. Após a lavagem, ninício de uma diferença de duas vezes no sinal vermelho em relação foi observada para as bactérias QD705-marcados (Targeted lavado) em comparação com o controle (não-alvejado lavado). A ausência de QD705 na não-alvejado Lavado foi confirmado pela falta de sinal fluorescente e verificou-se a rotulagem QD705 no estado Washed alvejado. Os dados são de quatro culturas independentes de K. pneumoniae. Para maior clareza, a legenda indica a fonte da excitação QD705. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fluoróforo Concentração mL PS (ul) λ max ex / em (nm) Filtro Emission (n m)
Alexa 555 37,2 mM 4,77 995,23 555/565 570-590
Alexa 568 37,2 mM 4,77 995,23 578/603 590-610
Alexa 633 37,2 mM 4,77 995,23 632/637 650-670
37,2 mM 4,77 995,23 702/723 710-730
Não fluorescente 2,62% de sólidos 9.72 990,28
μSph Rosa 5% de sólidos 4,77 995,23 580/605 610-630
μSph Amarelo 5% de sólidos 4,77 995,23 505/515 510-530
QD705 2 uM 5 995 465/705 710-730
2 uM 5 995 465/705 790-810
width: 108px; "> Alexa 700 height: 22px; width: 108px; "> QD800

Tabela 1. Propriedades de fluoróforos utilizados ao longo das manifestações de combustível.

Controle filtro fluoróforo Controle valor de p
p-sec -1 · cm -2 SD p-sec -1 · cm -2 SD
A555 PS 580 1,08 x 10 7 3,31 x 10 6 9,09 x 10 6 1,75 x 10 6 0,233
A568 PS 600 8,47 x 10 6 4,23 x 10 6 4,49 x 10 6 9,71 x 10 5 0,094
A633 PS 660 2,40 x 10 6 1,25 x 10 6 7,85 x 10 5 2,39 x 10 5 0,046
A700 PS 720 5,53 x 10 5 2,46 x 10 5 1,54 x 10 5 6,05 x 10 4 0,026
MSPH Amarelo μspheres não fluorescentes 520 1,19 x 10 8 4,85 x 10 7 5,79 x 10 7 1,99 x 10 7 0,057
MSPH Rosa μspheres não fluorescentes 620 2,37 x 10 7 1,36 x 10 7 2,16 x 10 6 8,00 x 10 5 0,026
QD705 μspheres não fluorescentes 720 1,76 x 10 7 7,33 x 10 6 2,08 x 10 5 7,16 x 10 4 0,007
QD800 μspheres não fluorescentes 800 7,79 x 10 6 4,72 x 10 6 3,60 x 10 4 1,52 x 10 4 0.023

Tabela 2. Identificação de fluoróforos e nanopartículas fluorescentes compatíveis com combustível.

Discussão

A manifestação fundamental do combustível pode ser alcançado simplesmente através da mistura de bactérias luminescentes com nanopartículas fluorescentes ou QDs. As duas entidades vão ser fisicamente separado e permanecem para além de qualquer distância RET eficiente. Mais difícil é a optimização do sinal COMBUSTÍVEL tanto in vitro como in vivo. Sob condições in vitro, com ou sem um absorvedor óptico presente, geralmente a adição de excesso de fluoróforo será suficiente para maximizar a resposta COMBUSTÍVEL. No entanto, em concentrações elevadas, tais como os fenómenos de têmpera ou de colisão estática pode levar a uma perda de sinal fluorescente. Realizando uma série de diluições variando independentemente da concentração da fonte luminescente e o fluoróforo irá contribuir para optimizar as concentrações desejadas. A criação e otimização de combustível sob nas concentrações in vivo é muito mais difícil e precisa ser tratada numa base caso-a-caso. Pode ser difícil criar um condition em que a entidade fluorescente pode ser acedida opticamente pela fonte luminescente. Como tal, a começar pelo co-injeções diretas dos dois grupos pode fornecer informações sobre o sucesso do combustível em condições ideais.

Existem protocolos padrão para as bactérias de rotulagem e células eucarióticas com entidades fluorescentes, como a série Alexa e QDs. Muitas vezes, isto requer a funcionalização da superfície ou a activação com os anticorpos, o que pode levar a efeitos indesejados, como reduziu a viabilidade celular ou a actividade metabólica alterada. Para superar isto, é importante para determinar a quantidade óptima de anticorpo ou agente de activação necessário que minimiza as perturbações celulares e maximizar a marcação fluorescente. O uso de QDs é vantajoso por causa do seu amplo espectro de excitação caracteristicamente, os espectros de emissão e estreita sintonizável, e a possibilidade de um grande deslocamento de Stokes. No entanto, QDs pode ser citotóxico e pode não ser desejável em alguns casos.

FUEL é um fenômeno que está presente em muitos experimentos BRET 13 e é aplicável a uma variedade de fontes luminescentes e fluorescentes. Até agora, os fótons resultantes da FUEL foram considerados o produto de interações não-específicas ou um sinal de fundo infeliz resultante de experiências BRET mal concebidos. É somente com o tipo de experiências demonstraram aqui que foram capazes de identificar a utilidade deste sinal indesejado. Nos exemplos mostrados, as bactérias luminescentes agir como uma fonte de excitação difusa capaz de desencadear uma resposta fluorescente padrão a partir de uma grande variedade de entidades fluorescentes. Além disso, devido à distância de trabalho substancial, é seguro concluir que, enquanto combustível pode ser construída sem a ocorrência de BRET, em BRET geral não pode ser observado sem a contribuição do combustível. Mais importante, devido à falta de um requisito de segmentação, o combustível pode ser usada para cobrir a abertura do espaço que existe entre BRET e ctécnicas de imagem de todo o onventional animais.

Divulgações

Os autores declaram a competir interesses financeiros. JD, SB, KLR e SLS contribuiu para EP10290158.4 Europeu de Patentes e Organização Mundial da Propriedade Intelectual pedido de patente WO/2011/117847.

Agradecimentos

Os autores gostariam de alargar a sua gratidão pelo apoio financeiro da Fundação Pasteur de Nova York (a JD, CS, CS), a UE-FP7 Programa "Automação" (a SLS), o Programa de Carnot Institut 11 (de JD, AH , AR, RT, SLS) e Projeto IMNOS (a RT, SLS), a Fundação de Caridade Conny-Maeve (SLS), o mestrado europeu em Imagem Molecular (a ele), os programas Região Ile de France MODEXA (SLS), gergelim (SLS) e DimMalInf (SLS, RT), a ANR Programa Grandes Investissement de l'avenir Infraestruturas Nationales en Biologie-Santé: França LifebioImaging (FLI) França Vida Imagem (RT, SLS), França Bioimaging (JD, SLS) eo Institut Pasteur, Paris. Além disso, os autores gostariam de agradecer, José Bengoechea e Herbert Schweizer para reagentes. Além disso, os autores gostariam de agradecer a Cindy Fevre que gerou os anticorpos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Escherichia coli expressando o luxABCDE gentilmente cedido por José A. Bengoechea com permissão de Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145 52145 é uma estirpe de referência do serotipo K2
Luria Bertani (LB) mídia de crescimento padrão
Q-Tracker 705 Ciências da VidaQ21061MP
Q-Tracker 800Ciências da VidaQ21071MP
Alexa 555Ciências da VidaS21381
Alexa 568Ciências da VidaS11226
Alexa 633Ciências da VidaS21375
Alexa 700Ciências da VidaS21383
Microesferas não fluorescentesPolysciences, Inc15913
Microesferas rosaLife SciencesF888740 nm de diâmetro
Microesferas amarelasLife SciencesF888840 nm de diâmetro
Ivis SpectrumPerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinaThermo Scientific Pierce21425
Zeba Spin Dessalinização Colunas 7K MWCOThermo Scientific Pierce21425
HABA Thermo Scientific Pierce28005
Ensaio BradfordBio-Rad500-0201
Kit de ensaio

Referências

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