Aip1p Dynamics são alteradas pela R256H Mutação em actina

Resumo

Mutações causadoras de doenças em actina pode alterar a função do citoesqueleto. Dinâmica do citoesqueleto são quantificados através de imagens de proteínas fluorescentes marcados através de microscopia de fluorescência total de interna. Como exemplo, a proteína do citoesqueleto, Aip1p, alterou a localização e movimento em células que expressam a isoforma da actina mutante, R256H.

Resumo

Mutações em actina causar uma variedade de doenças humanas devido a alterações moleculares específicos que muitas vezes alteram a função do citoesqueleto. Neste estudo, a imagiologia por fluorescência utilizando proteínas marcadas com fluorescência interna total (TIRF) microscopia é usado para visualizar e quantificar as alterações na dinâmica do citoesqueleto. Microscopia TIRF e a utilização de marcadores fluorescentes também permite a quantificação das alterações na dinâmica do citoesqueleto causadas por mutações em actina. Usando esta técnica, a quantificação da função do citoesqueleto em células vivas complementa um valioso em estudos in vitro da função da proteína. Como um exemplo, as mutações que afectam a missense resíduo R256 actina foram identificadas três isoformas de actina em humanos, sugerindo este aminoácido desempenha um papel importante nas interacções reguladoras. Os efeitos da mutação R256H actina do citoesqueleto em movimentos foram estudadas utilizando o modelo de levedura. A proteína, AIP1, que é conhecido por auxiliar cofilina na despolimerização da actina, estavamarcado com proteína verde fluorescente (GFP) na extremidade N-terminal e rastreados in vivo utilizando microscopia TIRF. A taxa de movimento Aip1p, tanto do tipo selvagem e mutantes foi quantificada. Em células que expressam R256H actina mutante, Aip1p movimento é restringido e a velocidade do movimento é quase metade da velocidade medida em células do tipo selvagem (0,88 ± 0,30 mM / seg em células R256H em comparação com 1,60 ± 0,42 mM / seg em células de tipo selvagem, p <0,005).

Introdução

A actina é a proteína predominante, compreendendo o citoesqueleto e participa em processos celulares importantes, incluindo a divisão celular, movimento organelo, motilidade celular, a contracção, e de sinalização. Ao longo da última década, as mutações que causam doenças em actina foram descobertos em cada uma das seis isoformas de actina humanos que conduzem a uma variedade de desordens, a partir de miopatias para doença da artéria coronária ^1-7. Os processos pelos quais as mutações que conduzem à doença de actina continuar a ser elucidados. O modelo de levedura continua sendo o padrão ouro para o estudo dos efeitos bioquímicos de mutações na função acti....

Protocolo

1. Clonagem no plasmídeo PB1996

1. Planejar e ativar primers de DNA de um oligonucleotídeo empresa de fabricação que ladeiam a sequência alvo e contêm sítios de restrição únicos no plasmídeo pai selecionado. NOTA: neste caso, os iniciadores foram concebidos para amplificar os pares de base 400 na extremidade 5 'da sequência de AIP1. O local de restrição Xhol, foi incorporado no iniciador de cerca de 20 pb antes da sequência de AIP1, e Xmal foi incluído de cerca de 20 pb após a sequência alvo AIP1. O plasmídeo utilizado para a clonagem era PB1996, que contém uma marca 3XGFP por fluorescência, um gene URA para selecção da estirpe de levedura, e um gene de r....

Resultados

Um método para a imagem dinâmica das proteínas do citoesqueleto da célula é apresentado. A proteína de ligação à actina, Aip1p, foi marcado com GFP. O projeto para o plasmídeo que codifica para o produto marcado é mostrado na Figura 1. O plasmídeo foi então transformado em células de levedura. Expressão do fluorescentemente marcado Aip1p permitiu a visualização do comportamento da proteína na célula. Aip1p normalmente localiza a patches de actina em locais de endocitose ^22. Para quantificar o.......

Discussão

Uma estratégia eficaz para visualizar a dinâmica do citoesqueleto e a utilidade em investigações sobre mutações patogénicas tem sido descrito aqui. Modalidades de imagem avançadas criaram novas oportunidades para entender o movimento intracelular de proteínas, perto da membrana celular. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) é uma técnica sensível para estudos funcionais em células vivas. TIRF usa um laser de excitação angular que cria um campo evanescente, devido à diferença nos índices de refr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	rpi	9012-36-6
Bromofenol Azul	Amresco	115-39-9
BSA	NEB	B9001S
Change-IT Kit de mutagênese dirigida por local de mutação múltipla	USB Corporation	4166059
CutSmart Buffer	NEB	B7204S
DNA, fita simples de testículos	de salmãoSigma	9007-49-2
EDTA pH 7.4	Sigma	93302
Brometo de etídio	Invitrogen	15585-011	Atenção! Irritação prejudicial
Kit de DNA fúngico / bacteriano	Symo Research	D6005
HpaI	NEB	R0105S
Acetato de lítio	AlfaAesar	6108-17-4
Escada de baixa massa de DNA	Invitrogen	10068-013
NE Buffer # 4	NEB	B7004S
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	Invitrogen	12532-016
Kit Miniprep	Qiagen	27106	Qualquer kit funcionará
Kit de ligação rápida	NEB	M2200S
Azida de sódio	Sigma	26628-22-8
PBS	Invitrogen	10010-023
PEG	Amresco	25322-68-3
Base Tris Ultrapure	rpi	77-86-1
Sistema de Limpeza de Gel e PCR Wizard	SV Promega	06/01/2015
XhoI	NEB	R0146S
XmaI	NEB	R0180S
YPD media	LabExpress	3011-URA
Media	LabExpress	3010
Máquina de PCR	Invitrogen	4359659	Qualquer máquina de PCR funcionará
Microscópio TIRF	Olympus IX81
Hamamatsu ORCA-R câmera	Hamamatsu