Kvantificering Single mikrokardannelse Permeability i Isoleret Blood-perfunderet rottelunge Forberedelse

Summary

Den isolerede lunge forberedelse blod perfunderet gør det muligt at visualisere mikrokar net på lungeoverfladen. Her beskriver vi en metode til at kvantificere permeabilitet af enlige mikrokar i isolerede lunger ved hjælp af real tid fluorescens billeddannelse.

Abstract

Den isolerede lunge forberedelse blod-perfunderet er almindeligt anvendt til at visualisere og definere signalering i enkelt mikrokar. Ved at koble dette præparat med real time scanning, bliver det muligt at bestemme ændringer permeabilitet i de enkelte pulmonale mikrokar. Heri beskrives trin for at isolere rottelunger og perfundere dem med autologt blod. Så vi skitsere skridt til at indgyde fluorophores eller agenter via en microcatheter ind i en lille lunge region. Ved hjælp af disse procedurer, der er beskrevet, vi bestemt permeabiliteten vokser i rottelunge mikrokar reaktion på infusioner af bakteriel lipopolysaccharid. De data viste, at lipopolysaccharid øget lækage på tværs af både venular og kapillær mikrokardannelse segmenter. Således er denne metode gør det muligt at sammenligne svarene permeabilitet blandt vaskulære segmenter og dermed definere nogen heterogenitet i svaret. Mens almindeligt anvendte metoder til at definere lunge permeabilitet kræver efterbehandle af lungevæv prøver, denanvendelse af tidstro billeddannelse overflødiggør dette krav som det fremgår af den foreliggende fremgangsmåde. Således isolerede forberedelse lunge kombineret med real time scanning giver flere fordele i forhold til traditionelle metoder til at bestemme lunge mikrovaskulære permeabilitet, men alligevel er en enkel metode til at udvikle og implementere.

Introduction

Øget mikrovaskulære permeabilitet i lungerne fører til udvikling af alveolær ødem og kompromitteret gasudveksling og er en stor karakteristisk for akut lungeskade (ALI) ^1-3. Overslag over vaskulær permeabilitet er vigtige ved fastlæggelse af omfanget af lungeskader og effekt af de foreslåede terapeutiske indgreb. Gravimetrisk analyse såsom blod gratis lunge våd-til-tørre-forhold og mikrovaskulære filtrering koefficient er almindeligt anvendte metoder til at estimere permeabilitet ^4,5. Andre metoder omfatter kvantificering af tilbageholdelse af radioaktivt eller fluorescerende prober i lungevæv ^6-8. Men de ovennævnte metoder kræver postexperiment behandling af lunge vævsprøver mod belyse data permeabilitet. Eftersom et dyr kan kun anvendes til en enkelt behandling protokol, kan der være behov for en fuldstændig undersøgelse stort antal dyr. En fælles egenskab ved de ovennævnte fremgangsmåder er, at de bestemmer middelværdien vaskulær permeabilitet foralle blodkar i vævsprøven. Det er imidlertid velkendt, at pulmonale mikro-og makro-skibe er fænotypisk forskellige ^9. Derfor kan svarene permeabilitet være heterogen blandt de forskellige skibstyper såvel ^9,10. Således kvantificerer gennemsnitlige gennemtrængelighed af alle pulmonale fartøjer i en vævsprøve, kan ikke i tilstrækkelig grad afspejler denne heterogenitet.

I den isolerede lunge forberedelse blod perfunderet kan blodkar på lungeoverfladen visualiseres ved en opretstående mikroskop ^4,11,12. Dette gør det muligt kendetegner reaktioner i enkelte skibe, og dermed løse eventuelle heterogenitet i svarene ^13. Desuden ved at udnytte fluorescensimagografi af mikrokar fluorescens assays kan inkorporeres. Endvidere kan en venstre atrial mikrokateter anvendes til at levere midler og fluorescens prober i blodkar ^11,14. Mikrokateteret begrænser levering til en lille lunge regionen og således exkun at frembyde blodkarrene i regionen til de infused agenter og fluorophores. Dette tillader flere små områder inden for samme lunge skal bruges til separate eksperimenter, hvilket fører til en samlet reduktion i dyr, der er nødvendige for en undersøgelse.

Real time scanning muliggør opsamling af dynamiske ændringer i vaskulær og ekstravaskulære fluorescens af enlige mikrokar af de isolerede forberedelse lunge. For hvert mikrokar i et billede felt, kan registreres ændringer i fluorescens under infusion af fluoroforer og afvaskningsstation og kvantificeret offline ^14. Brug værdierne for det maksimalt og resterende vaskulær fluorescens, kan et indeks gennemtrængelighed for hver mikrokardannelse i Billedfeltet bestemmes. For at bestemme ændringer permeabilitet som reaktion på inflammation eller skadelige stoffer, kan den ønskede middel administreres først, og derefter indeksere permeabilitet bestemt. Desuden kan billedfeltet sættes overalt i lungen region infunderesmicrocatheter, således at en høj grad af fleksibilitet i valg af den ønskede vaskulære netværk. Således isolerede forberedelse lunge blod-perfunderet i tandem med realtid billedbehandling giver en attraktiv eksperimentel model til at kvantificere permeabilitet i enkelt lunge mikrokar.

Protocol

Alle eksperimenter udført på dyr var som godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Tennessee Health Science Center.

1.. Tubing for perfusing rottelunge Forberedelser

1. Forbered et rørsystem med Tygon slanger (# 18) til blodperfusion som vist i figur 1.. Slut tryktransducere (P23XL) og placere slangen på mikroskopet scenen.
2. Indstil vandbadstemperatur på 37 ° C.
3. Forbind lunge ind-og udtag midlertidigt med Tygon slange.

Figur 1. Blodperfusion slange. Den skematiske viser slangen opsætning anvendes til at cirkulere blod gennem isolerede præparation lungen. Også indikeret er forbundet komponenter hvorigennem slangen is routes. En skematisk af hjerte og lunger er medtaget for at vise steder af forbindelsen mellem slangen og pulmonal arterie (PA), og venstre forkammer (LA) kanyle (blå stiplede linier).

2.. Udarbejdelse af Isolerede rottelunger

1. Bedøver rotter (Sprague-Dawley Rats, 250-300 g) med ketamin (80-100 mg / kg) og med xylazin (5-10 mg / kg). Efter at have sikret en kirurgisk plan anæstesi, dyret i en liggende stilling.
2. Udfør trakeostomi, indsætte en trachealkanyle (PE-90) og fastgør den med kirurgisk sutur.
3. Indgyde heparin (100-200 U) ind i hjertet af hjertepunktur (21 G butterfly nål), vent 60 sek og exsanguinate blod (~ 12-15 ml blod).
4. Forbered to kanyler (Tygon slanger, 3 mm i diameter, 4 cm lang, blussede i den ene ende), og fyldes med saltvand.
5. Udfør en torakotomi. Lave et snit (3 mm) på højre hjertekammer og skub udvidede ende af en kanyle ind i indsnittet mod pulmonalarterie. Sikker kanyle til lungepulsåren med kirurgiske suturer.
6. Incise (3 mm) spidsen af ​​den venstre ventrikel og skub blussede enden af ​​den anden kanyle ind i snittet. Før kanylen ind i venstre atrium. Fastgør kanyle til den venstre ventrikel med en navlestreng båndet (2 mm bredde).
7. Dissekere enhver bindevæv, og fjern lunge og hjerte sammen med de vedlagte kanyler. Placer lunge og hjerte på en petriskål. Flyt lungen så diafragma overflade er på toppen. De tre kanyler skal vende i samme retning.
8. Anbring præparatet lunge på en scene, der kan manipuleres i XY retninger. Enhver scene, der kommer med et mikroskop kan modificeres til at holde slangen eller en skræddersyet scene bygget, hvis det er nødvendigt.

3.. Blodperfusion af isolerede rottelunger

1. Bland afblødt blod med et lige volumen albumin (5%) opløsning og tilføje til reservoiret. Start peristaltikpumpen og indstille flow rspiste til 14 ml / min. Lad blodet fylde slangen.
2. Med shunt åben, fjernes den midlertidige lunge indløb-stikkontakt stik. Fastgør lungepulsåren og venstre forkammer kanyle til lungerne indløb og udløb, hhv. Sørg for, at der ikke er luftbobler i slangen.
3. Slut trakealkanylen til en tredje tryktransducer (P23XL). Pump lungerne med 30% ilt via trakealkanylen og opretholde presset på 5 cm H ₂ O.
4. Luk shunten med en klemme til at begynde lunge perfusion. Bevar lungepulsåren og venstre forkammer pres på ~ 10 og 3 cm _H2O hhv.

4.. Forberedelse Lung for Mikrovaskulære Infusion

1. Løft bagenden af ​​forlængelsen rør til kateteret over niveauet for lungerne og sikker.
2. Forbered en infusion kateter ved at indsætte omkring 30 cm af en 40 cm lang PE10 slangen i en ~ 30 cm lange PE90 slange. Forbind den udsatte ende af PE10 slange til en nål (30 g) vedfastspændt til en sprøjte (1 cc).
3. Indsætning af kateteret kombination i den hævede bageste ende af forlængelsen slangen. Før kateteret kombination ned gennem venstre forkammer og ind i lungen, indtil den møder modstand. Skub derefter PE10 kateteret alene længere ind i lungerne, indtil den møder modstand. Bemærk at anvende overdreven kraft, mens du indsætter kateteret vil skade lungerne.
4. Fyld 1 ml sprøjte med Ringers opløsning og tillægger en sprøjtepumpe. Indstil infusionshastigheden til 10 ul / min.
5. Infusionsstedet bliver bleg i forhold til resten af ​​lungen.
6. Fugt lungen med saltvand og dækker lungen med plastfolie med et hul stort nok til at forlade infusionsstedet udækket.
7. Svaber nogle stophane fedt på bunden af ​​en O-ring (skræddersyet), og placere et dækglas (# 1.5, diameter 22 mm) i bunden af ​​O-ringen. Forsigtigt placere O-ringen med dækglasset på infusionsstedet. Fastgør O-ring med en standard test-tube holder. Dækglasset / O-ring kombination ikke fordrejer bicellestrukturer nedenunder, som for nylig rapporteret ^15.
8. Placer en objektiv (20X) af et fluorescensmikroskop over O-ringen og fokusere på lungeoverfladen.

5.. Imaging Fluorescent Dextran Transit gennem mikrokar

1. Forbered mikroskop til billedbehandling FITC fluorescens.
2. Vælg en region, der skal afbildes og hente billeder med en hastighed på 1/minute hjælp billede erhvervelse software.
3. Begynd infusion af FITC-dextran 20 kD (0,5 mg / ml) ved hjælp af sprøjtepumpen. Fluorescens i blodkarrene vil gradvist stige og nå et maksimum. Fortsæt infusion i 60 min.
4. Derefter skifte til Ringers infusion til at vaske luminale fluorescens. Oprethold infusion over 10 minutter. Fortsæt billede erhvervelse ved 1/min under afvaskning.

6.. Image Analysis

1. Åbn billedet erhvervelse fil.
2. Place regioneraf renter over mikrokar indenfor billedrammen.
3. Afspil billedfilen frame-by-frame og registrere fluorescens intensitet ved hver region af interesse for alle rammer.
4. Plot ændringen i fluorescensintensitet for hver region af interesse som en funktion af tiden.
5. Kvantificere den maksimale fluorescensintensitet og den resterende fluorescensintensitet efter 10 min af afvaskningsstation.
6. Beregn forholdet mellem maksimum til residual fluorescens intensitet ved hver region af interesse at få indeksere gennemtrængelighed for mikrokar forbundet med denne region af interesse.

Representative Results

En isoleret lunge forberedelse blod perfunderet tilsluttet perfusionsslange og beslægtet udstyr er vist i fig. 2. Til demonstrationsformål, vi anvendte en Sprague Dawley rotte, selvom fremgangsmåderne beskrevet heri, kan anvendes med enhver rottearten. Infusioner gennem en venstre forkammer mikrokateter nå kun et lille område af lungen. Det infunderede region kan identificeres ved infusion-induceret misfarvning (figur 3). Fremstillingen lungen som positioneret for real-time imaging er vist i fig. 4.

Figur 2. Isoleret lunge forberedelse blod perfunderet. Billedet viser isolerede rottelunger tilsluttet til perfusionsslange og perfunderet med autologt blod. Bemærk, at diafragma overflade af lungen faces mistativet for mål.

Figur 3. Mikrokateteret infusion region. En microcathether indsat via venstre forkammer blev anvendt til at tilføre Ringers opløsning i udarbejdelsen lungen. Billedet viser regionen venstre lunge (cirkel), der modtager Ringers infusion. Som Ringers infusion fortrænger blodet perfusion gennem blodkarrene, bleg infunderes region sammenlignet med de andre lunge regioner. Bemærk, at Ringers infusion er begrænset til et lille klart afgrænset område af lungen.

Fig. 4. Imaging position for isolerede præparation lunge. Fotografiet shows en isoleret forberedelse lunge placeret under et mikroskop objektiv klar til billeddannelse. Bemærk, at lungeoverfladen er dækket med en plastfolie for at holde lungeoverfladen fugtig. En O-ring fastholder lungeoverfladen vandret under billedbehandling.

I denne undersøgelse har vi bestemt ændringer i vaskulær permeabilitet som reaktion på behandlinger med bakterielt lipopolysaccharid (LPS, serotype 0111: B4), en udbredt model af ALI. Mod dette, vi infunderes LPS (100 pg / ml) i mikrokar i 30 minutter efterfulgt af en Ringers vask i 60 minutter ^11. Derefter infunderes vi FITC dextran 20 kD at kvantificere indeks permeabilitet. Resterende FITC fluorescens var lav i mikrokar behandlet med Ringers, men høj i gruppen behandlet med LPS (figur 5A-D). Desuden i forhold til Ringers infusion LPS infusion forårsagede en betydelig reduktion i indeks permeabilitet, hvilket tyder på en global stigning i permeabilitet i alle fartøjer i billedet field (figur 5E). Indeks Permeabiliteten kvantificeret særskilt for vener og kapillærer foreslog, at stigningen på LPS-induceret permeabilitet var lavere i små blodkar end i kapillærer, selvom forskellen var ikke signifikant (figur 5F).

Figur 5. LPS forøger vaskulær permeabilitet. Pulmonale mikrokar blev behandlet med enten Ringers eller LPS (100 pg / ml) i 30 minutter. Efter 60 minutter blev FITC dextran 20 kD infunderes efterfulgt af en Ringers vask og fluorescens ændringer fanget af real time scanning. Så indeks permeabilitet af blodkar i det behandlede område af lungen blev bestemt som forholdet mellem det maksimale for at resterende FITC dextran fluorescens. AD) Billederne viser maksimum (A, C) og resterende (B, D) FITC Fluorescence i Ringer's-(A, B) og LPS-behandlede (C, D) lunge mikrokar. E) LPS infusion faldt indekset permeabiliteten betydeligt i alle skibstyper indenfor billedrammen. F) LPS behandling forårsagede en reduktion i indeks permeabilitet i både vener og kapillærer (* p <0,05 sammenlignet med Ringers kontrol gentages tre gange, middelværdi ± SEM). Kapillærer (cap) og vener (VEN) blev identificeret ved beholderens mål opnået fra en brightfield billede taget før infusion af FITC dextran 20 kD. Billederne er en beskåret del af en 850 x 850 mM billedramme. n = antallet af fartøjer.

Discussion

Den isolerede lunge forberedelse blod-perfunderet kombineret med realtids billedbehandling giver et simpelt værktøj til bestemmelse af ændringer permeabilitet i enkelt lunge mikrokar. Vi anvendte denne fremgangsmåde til at definere ændringer permeabilitet som reaktion på infusion af LPS. Vores data tyder klart på, at LPS infusion forårsagede en stigning i den mikrovaskulære permeabilitet. Yderligere data viser også, at ændringer i permeabilitet induceret af LPS var ens i begge vener og kapillærer. Således er en stor fordel ved denne teknik er muligheden for at definere utæthed af enkelt mikrokar samt et globalt netværk af fartøjer. Da denne teknik giver også ændringer globale permeabilitet, er det muligt at sammenligne disse værdier, der opnås ved hjælp af andre almindeligt anvendte metoder, såsom gravimetriske analyse. Den foreliggende fremgangsmåde giver også mulighed for sammenligning af væskelækage information mikrovaskulære som rapporteret i andre studier.

I forhold til denmere udbredt teknikker til at bestemme ændringer vaskulær permeabilitet, realtids billedbehandling metode kræver ingen efterbehandling af lunge vævsprøver. Omfanget af fluoroforen tilbageholdelse er fanget under infusionen og efterfølgende afvaskningsstation af fluoroforen. Dette eliminerer klart bevare vævsprøver og eventuelle fejl i forbindelse med deres håndtering. Ud over at etablere individuel mikrokardannelse gennemtrængelighed via indeks permeabilitet, den nuværende metode letter også definere omfanget af sporstof fluorescens stiger, bifasisk karakter af hastigheden af ​​ændringen af ​​sporstof fluorescens, og hastigheden af ​​sporstof fluorescens henfald i løbet af vaske. Disse yderligere parametre kan anvendes til at sammenligne reaktioner på forskellige behandlinger, såvel som mellem segmenterne forskelle i mikrokar, som beskrevet i vores tidligere rapport ^14.

Vi har heri beskrevne procedurer til at bestemme ændringer permeabilitet som reaktion på en inflammatoriskagent leveret af vaskulær infusion. Imidlertid er det muligt at tilpasse procedurerne for at bestemme ændringer permeabilitet til agenter, der leveres af andre veje såvel. Således har vi tidligere bestemt mikrokardannelse permeabilitet stiger til syre leveret af alveolær instillation ^14.

Som det fremgår af lunge fotografier, mikrokateteret baseret leveringsmetode begrænser det leverede produkt til et lille område af lungen. Således, ved at manipulere mikrokateteret forskellige lungeregioner, kan udføres en række forsøg i samme lunge. Således er denne fremgangsmåde har en betydelig indvirkning på det antal dyr, der er nødvendige for en fuldstændig undersøgelse. Data i denne og andre rapporterede undersøgelser har udnyttet flere infusioner i samme lunge ^{4,11,12,14,16.} Mens var indlysende ingen forskelle i svarene fra de forskellige regioner på grund af mulig recirkulation af tilført midler via perfusatet i nærværende undersøgelse, bør denne mulighed være ulemperidered i den eksperimentelle design. Således når man bruger forskellige regioner i samme lunge til eksperimenter, kan det være gavnligt at afgøre, om baseline permeabilitet er ens i de forskellige lunge regioner.

Succesen med den nuværende metode afhænger kritisk om nedsættelse af et godt perfusion lunge forberedelse. Forberedelsen lunge skal være af ensartet farve uden røde pletter, væske kommer ud af trachealtube, blodlækage, eller høje lungepulsåren pres, som alle indikerer en beskadiget lunge. Endvidere bør der udvises forsigtighed under indføring af microcathether i lungerne, som tvinger indsættelsen vil føre til venulen punktering og skader på lungerne.

Den nuværende intakt lunge metode grænser visualisering til pleurale og subpleurale skibe, og dermed giver mulighed for skøn permeabilitet fra kun en delmængde af pulmonale kar. Til visualisering af dybere fartøjer, kan to-foton mikroskopi billeddannelse være et muligt alternativ. Indsætion mikrokateterets via venstre forkammer kanyle begrænser infusioner i vener og kapillærer i retrograd retning. En mulig måde at ophæve denne begrænsning vil være at indsætte kateteret gennem lungepulsåren kanyle. Den eneste ændring er nødvendig for denne alternative fremgangsmåde er at fastgøre en udvidelse rør til kateteret på lungen indløbssiden.

Disse procedurer blev udviklet ved hjælp af rottelunge som model. Dog kan de samme trin med nogle mindre ændringer blive brugt til at bestemme ændringer permeabilitet i muselunge mikrokar. For muselunge eksperimenter kan agonist og sporstof tilsættes til perfusatet og permeabiliteten kvantificeret som svarer til den for rottelunger. Endvidere kan en anden fluorescens sporstof erstattes at passe mulighederne i brugerens mikroskop. Størrelsen af ​​dextranmolekyle kan ændres afhængigt af den forventede størrelse stigning permeabilitet agonistinduceret og bør fastsættesbaseret på data fra indledende forsøg. Således samlet den isolerede forberedelse lunge sammen med fluorescens billeddannelse giver et kraftfuldt værktøj til at bestemme enkelt fartøj gennemtrængelighed i standard dyremodeller af ALI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21 G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4