Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Den Bovine Lung i biomedisinsk forskning: Visuelt Guidet Bronkoskopi, intrabronkial Pode og Published: July 3, 2014 doi: 10.3791/51557
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Molecular Pathogenesis, Friedrich-Loeffler-Institut

Summary

Denne artikkelen beskriver bronchoscopic teknikker i storfe lunge under eksperimentelle forhold, dvs. bronchoscopically guidet inokulasjon, bronchoalveolar kylling, bronkial børsting, og transbronchial lunge biopsi.

Abstract

Det er en pågående jakten på alternative dyremodeller i forskning av lungemedisin. Avhengig av målet med forskningen, store dyr som modeller av lungesykdom ofte ligner situasjonen for den menneskelige lunge mye bedre enn mus gjør. Arbeide med store dyr har også muligheten til å prøve det samme dyret gjentatte ganger over en viss løpet av tiden, noe som gjør at langtidsstudier uten å ofre dyrene.

Målet var å etablere in vivo prøvemetoder for bruk i en bovin modell av en respiratorisk Chlamydia psittaci infeksjon. Sampling bør utføres ved forskjellige tidspunkter i hvert dyr i løpet av studien, og prøvene bør være egnet for å studere vertsrespons, så vel som organismen under eksperimentelle betingelser.

Bronkoskopi er et verdifullt diagnostisk verktøy i human-og veterinærmedisin. Det er et trygt og minimalt inngrep. Dette article beskriver intrabronkial inokulering av leggene i tillegg til prøvetakingsmetoder for den nedre luftveier. Videoendoskopisk, fører intrabronkial inokulering i svært ensartede kliniske og patologiske funn i alle inokulerte dyr, og er derfor godt egnet for anvendelse i modeller av smittsomme lungesykdom. Prøvetakingsmetodene som er beskrevet er bronchoalveolar kylling, bronkial børsting og transbronchial lunge biopsi. Alle disse er verdifulle diagnostiske verktøy i human medisin, og kan bli tilpasset for eksperimentelle formål til kalver i alderen 6-8 uker. Prøvene ble målt var egnet for både patogen deteksjon og karakterisering av graden av lungebetennelse i verten.

Introduction

Verdiene av stort dyr Modeller i biomedisinsk forskning

I moderne tverrfaglig biomedisinsk forskning, dyremodeller er fortsatt uunnværlig for å belyse komplekse interaksjoner - knyttet til helse eller en sykdomsstatus - innenfor pattedyr organismer. Til tross for 17 nobelpriser blir gitt til forskere som har studert storfe, hester, sauer, eller fjærkre som modeller for biomedisinsk forskning 1, er i dag det store flertallet av dyreforsøk foretatt med gnagere, mens mindre enn 1% av studiene jobber med husdyr eller husdyr.

Små dyr har mange praktiske fordeler (dvs. lavpris, genetisk formbarhet, høy gjennomstrømning, tilgjengelighet av en rekke genetiske og immunologiske verktøy og kits), og genmodifiserte murine modeller er generelt akseptert å utføre mekanistiske studier oppdage spesielle molekylære stier. I biomedisinsk forskning av komplekse systemer, than biologisk relevans og kliniske nytten av muse modeller blir stadig mer og mer tvilsom. De kan være misvisende og bære risikoen for overforenkling av biologisk kompleksitet 2-9.

På grunn av inter-arter særegenheter, vil ingen enkelt dyrearter helt speile menneskets situasjon, og bruk av mer enn én modell synes å være gunstig i et tverrfaglig biomedisinsk forskning tilnærming. I sammenheng med translasjonell medisin, store dyr tilbyr muligheten til å tjene som sammenligningsmodeller som gir resultater med høy biologisk relevans for dual bruk for både mennesker og dyrs helse en. Bemerkelsesverdig er det humane genom mer lignet med det bovine genom enn av genomet av laboratorie gnagere. Det har også blitt bekreftet nylig at, sammenlignet med andre taksa, er genomet av mus mye mer omar 10-12.

Bruk av husdyr i en kompleks studie design, tilbyr unique mulighet for intra-individuelle, langsiktige studier av gjentatt samling av en rekke prøver i vivo fra en-og-det-samme Individuum uten å ofre dyr. Derfor kan funksjonelle, inflammatoriske og morfologiske endringer overvåkes på samme emne over en viss tidsperiode 13.

Den Bovine Lung som en egnet åndedretts Model

På grunn av det høye antallet signifikante forskjeller i lunge anatomi, luft fysiologi og lunge immunologi, trenger mus ikke reprodusere mange viktige patofysiologiske aspekter av menneskets lungesykdom. Dette må tas i betraktning når du bruker dem som dyremodeller av luftveissykdom 2,9,14-16. Selv om særegenheter i anatomi og struktur finnes for hver pattedyr lunge, funksjonelle egenskaper (dvs. lungevolum, luftmengder og luftveis mekanikk) er bedre sammenlignbar mellom voksne mennesker og kalver på grunn av tilsvarende kroppsvekt(50 til 100 kg).

De artsspesifikke egenskaper ved storfe lunge oppsummeres som følger: venstre lunge består av to lapper (Lobus cranialis, som er delt inn i to segmenter, og Lobus caudalis), mens høyre lunge består av fire lapper (Lobus cranialis, Lobus medius, Lobus caudalis, og Lobus accessorius). I motsetning til lungen anatomien til de fleste andre pattedyr, bronkie av de riktige kraniale lobe grener direkte fra den høyre laterale siden av luftrøret. Med hensyn til subgross anatomi, presenterer bovin lunge en høy grad av lobulation og en høy prosentandel av interstitielle vev 17,18 fører til en forholdsvis lav spesifikk lungesamsvar og en høyere pulmonal vev motstand 19.. Derfor er den nødvendige pusteaktiviteten ganske høy sammenlignet med andre arter 20,21. Den høye graden av lobulation fører til sterk uavhengighet av segmentene. Dermed inflammatory prosesser er begrenset av bindevev septa, og syke og friske segmenter ligger ofte innenfor samme lapp. På grunn av manglende sikkerhet i luftveiene, er det storfe lunge spesielt egnet til å speile obstruktive lunge dysfunksjoner 13. Angå vaskulaturen i bovin lunge, de små lungearteriene viser meget fremtredende glatte muskellagene. Derfor kan kalven også tjene som et godt etablert dyremodell av pulmonal hypertensjon eller vaskulær remodeling 22-24.

Med hensyn til luftveisinfeksjoner, naturlig forekommende sykdommer finnes i husdyr som har mange likhetstrekk med tilsvarende sykdom hos menneske. Typiske eksempler er bovin tuberkulose 25, syncytialt virus (RSV) infeksjoner hos kalver 26-28, eller naturlig ervervet klamydia-infeksjoner 29. Dermed trenger store dyremodeller ligner forholdene i den naturlige verten. Derfor er de mest useful for å studere host-patogen interaksjoner og de ​​komplekse patofysiologien av den tilsvarende sykdom i mennesker 30,31.

Som en biologisk relevant modell av luft Chlamydia psittaci-infeksjon, ble kalver valgt fordi bovines representere naturlige verter for dette patogenet 32-35. Informasjon oppnådd fra denne modellen, med hensyn på patogenesen av sykdommen eller mulige overføringsveier mellom mennesker og dyr, vil bidra til å utvide vår kunnskap med virkningen for begge kveg og mennesker. Modellen kan også bidra til å verifisere allment aksepterte og alternative terapeutiske muligheter for eliminering av lunge C. psittaci infeksjoner, som er, igjen, av interesse både i veterinær-og humanmedisin.

Teknikker som brukes på og prøver skaffes fra Bovine Luftveiene

Dette notatet beskriver og illustrerer teknikker og diagnostiske metoder kan påførese til bovin lunge og benyttet i vår modell for å evaluere både virkningene av patogenet på pattedyr lunge og effekten av terapeutiske inngrep.

Bronkoskopi er utført i humanmedisin siden 1960-tallet og regnes som en sikker prosedyre 36. I kalver, ble eksperimentelle bronkoskopi beskrevet i 1968 for første gang 37. Den intrabronkial anvendelse av patogener ble foreslått av Potgieter et al. Som en pålitelig metode for å produsere nedre luftveissykdom hos kalver 38 og er nå en utbredt metode i bovin forskning 34,39,40. Intrabronkial inokulering av en definert mengde av organismen i henhold videoendoskopisk kontrollen kan for selektiv plassering av mikroorganisme i lungen. Dette fører til konsekvent kliniske og patologiske funn i alle dyr 34 og tillater målrettet prøvetaking av lunge regioner som forventes å bli endret på grunn av patogen eksponering.

Bronchoalveolar lavage fluid (Balf) er en godt beskrevet indikator for tilstedeværelsen og alvorligheten av lungebetennelse. Den bronchoalveolar lavage (BAL) er en standard prosedyre i humanmedisin for diagnose av en rekke sykdommer i luftveiene 41. I levende storfe, ble BAL introdusert av Wilkie og Markham i slutten av syttitallet av forrige århundre 42. Det ble ansett som en trygg og repeterbare teknikk for å studere den nedre luftveiene hos storfe. På grunn av mangel på tilstrekkelige data om Balf parametere i friske dyr, i 1988 Pringle et al. Utført BAL på friske kalver med en fleksibel fiberoptiske bronkoskop. Forfatterne pekte også på behovet for å standardisere BAL protokoller under eksperimentelle forhold til å tilegne seg sammenlignbare resultater 43. BAL brukes fortsatt som en in vivo prøvetakingsmetoden i kalver 44-46.

Bronkial børsting er ofte brukt i human medisin som endiagnostisk verktøy for å smake neoplastiske lesjoner eller for mikrobiologisk analyse 36. For forskningsformål, kan primære cellekulturer av epitelceller høstes av cytologisk børsting fås 47. I kveg, har bruken av bronkial brushings for mikrobiologisk analyse blitt beskrevet for å karakterisere mikrobielle miljøet i lungen 43.

Transbronchial lunge biopsi gir lunge vevsprøver og er et verdifullt diagnostisk verktøy for diffuse lungesykdommer hos mennesker. Iatrogen pneumothorax og prosedyrerelaterte blødninger er komplikasjoner forbundet med denne teknikken. Deres forekomst er rapportert å være mindre enn én prosent i menneskelige pasienter 48. Transbronchial lunge biopsi er ikke en vanlig metode for bruk i storfe, på grunn av den høye kostnaden for utstyret som kreves og tiden det tar å få biopsier. I stedet transkutane lunge biopsi er mer praktisk under feltforhold 49-51.

Protocol

Etikk Erklæring
Denne studien ble gjennomført i henhold til europeisk og nasjonal lovgivning for omsorg og bruk av dyr. Protokollen ble godkjent av Komiteen for etikk av dyreforsøk og beskyttelse av dyr i Thüringen, Tyskland (Permit Number: 04-004/11). Alle forsøkene ble utført under oppsyn av autorisert institusjonelle Agent for dyrevern. Bronkoskopi ble strengt utføres under generell anestesi. I løpet av studien, ble forpliktet til å redusere ubehag eller lidelse.

Generelle bemerkninger
De beskrevne teknikker er blitt utviklet for kalver på ca 6-8 uker gamle, som veier omtrent 60 til 80 kg. For bruk i andre store dyrearter eller kalver forskjellige i alder og kroppsvekt, må teknikker bli tilpasset for å passe størrelse og vekt og ta hensyn til den tette anatomi av den spesielle dyreart. Alleutstyret som brukes skal være sterilt. Chlamydia psittaci er en zoonotisk bakterie som kan forårsake luftveis og generell sykdom hos mennesker. Den ikke-avian C. psittaci belastning DC15 brukes i denne protokollen må håndteres under biosikkerhet nivå to. Alt arbeid med patogen og med infiserte dyr må utføres iført personlig verneutstyr, slik som en respirator, en skvett vann bevis kjeledress, gummistøvler og hansker. Iført en egnet åndedrettsvern er av stor betydning, siden den naturlige smitteveien for C. psittaci er Aerogen. Emballering og merking av prøver må være desinfiserende bevis siden alle ting må behandles med en desinfiserende effekt mot Chlamydia i henhold til produsentens instruksjoner før du forlater dyret boenhet.

En. Klar Animal for Bronkoskopi

  1. Bestem vekten av leggen for dosering av anestetika.
  2. Plasser en intravenøs (IV) tilgang in venstre halsvene.
  3. Først sakte injisere xylazin (0,2 mg / kg kroppsvekt) i løpet av ca 30 sek, da, etter sedasjon skjer, injisere ketamin (2,0 mg / kg kroppsvekt).
  4. Løft dyret på bordet og plassere den i høyre lateral recumbency. Når dyret er tilstrekkelig plassert på bordet, sjekk om IV-tilgang er fortsatt på plass og juster den om nødvendig. Under anestesi, regelmessig sjekke øyelokk refleks for å bestemme dybden av anestesi.
  5. Når dyret puster jevnt og trutt, har noen trekke tungen ut og strekke halsen. Plasser et metallrør spekulum i dyrets munn ved hjelp av små roterende bevegelser. Skyv spekulum frem henhold syn kontroll, ved hjelp av en lommelykt, til strupehodet er synlig.
  6. Oppretthold anestesi gjennom hele endoskopisk inngrep ved å injisere en bolus av 7 mg xylazin og ketamin 70 mg etter behov.

. 2 vaksinasjonen (vaksinasjonen nettsteder: Figur 1)

  • Forbered 3 sprøyter med inokulum, som inneholder 1, 2, og 5 ml av podestoffet.
  • Sett inn en Teflon rør inn endoskopets arbeidskanal. Røret bør ikke stikke fra endoskopets tips.
  • Sett endoskopet gjennom metall spekulum. Små justeringer av spekulum kan være nødvendig for å muliggjøre bestått av strupehodet. Bronkie trachealis, som grener av til høyre side, bidrar til å justere bildet på skjermen.
  • Fest sprøyten med 5 ml inokulum til enden av teflonrøret. Naviger røret i grenene der pode skal deponeres og påfør ønsket mengde (Høyre lunge: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, caudalis Lobus: 0,5 ml og 1,0 ml; Venstre lunge: Lobus cranialis, Pars cranialis : 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, caudalis Lobus: 1,5 ml). Fest sprøyten med en &# 160; ml podestoff til røret, og deretter navigere til bronkie trachealis og deponere pode (Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml). Det er nyttig å alltid nærme lokaliseringer i samme rekkefølge.
  • Fjern endoskopet og spekulum.
  • Spray 1 ml av podestoff inn i hvert nesebor med en aktuator.
  • Ta med dyret tilbake til stallen og plassere den i liggende stilling for å våkne opp. Ikke la dyret uten tilsyn eller i selskap med andre dyr før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Utvinningen stabile bør være luftavkjølt, da dyrets evne til termoregulering er redusert under generell anestesi.
    MERK: Første kliniske tegn bør skje om 24-36 timer etter vaksinasjonen, avhengig av patogenet som brukes.

    • . 3 Prøvetakingsprosedyrer (prøvetakingssteder: Figur 2)

    1. Forbered dyret som beskrevet i trinn 1.1 til 1.6.
    2. Bronchoalveolar kylling
      1. Plasser 5 sprøyter som hver inneholder 20 ml steril isoton saltoppløsning, i et vann-bad og tillate dem å varme opp til om lag 38 ° C.
      2. Sett inn en lavage kateter inn endoskopets arbeidskanal, deretter sette endoskopet inn i metall spekulum og navigere videre inn i hoved bronkie av venstre lunge, til "kile posisjon" er nådd der endoskopet ikke kan skyves noe ut i tid.
      3. En etter en, fest sprøyter med den varme NaCl løsning på kylling kateter, innpode væsken og aspirer det direkte. Den bronchoalveolar lavage væske må oppbevares i silikoniserte glassflasker og lagt på is umiddelbart etter utvinning for å hindre de alveolære makrofager fra fester til glassflaten. Legg merke til både mengden av innpodet saltvann, og mengden av utvunnet fluid.
      4. Fjern lavage kateteret fra arbeidskanalen.
    3. Bronkial børsting
      1. Bla endoskopet til den ønskede samplings sted, i den beskrevne protokoll er dette Bifurcatio tracheae.
      2. Dekk børsten med røret før du setter det inn i endoskopet er arbeidskanalen til børsten i spissen vises på skjermen.
      3. Skyv børsten med plastrør frem ca 5 cm og avdekke den fra plastrøret ved å skyve håndtaket, deretter navigere den til det stedet som er å bli børstet.
      4. Gni av epitel-anrop ved å skyve og trekke børsten frem og tilbake under navigeringen av endoskopet for å sikre at kontakten mellom børsten og veggen av bronkie. Slutte å gni når blødning oppstår. Dekk børsten med røret før trekke den ut av arbeidskanalen.
      5. Forbered opptil fem flekker på objektglass av bølgende penselen over raset. Fiksere de smøres i kald metanol i 10 min, lufttørke og oppbevar ved -20 ° C.
      6. Børsten kan skylles iforskjellige medier, avhengig av det formål de avsøkte cellene. Hvis du tar flere brushings over samme kam, sørg for å bare skylle det i media som ikke irritere slimhinnene.
    4. Transbronchial lunge biopsi
      1. Naviger endoskopet til ønsket prøvetaking plassering, i den beskrevne protokollen dette er Pars caudalis av Lobus cranialis. Før du setter de biopsitang inn i arbeidskanal åpner og lukker den et par ganger for å sikre at det fungerer greit.
      2. Skyv biopsitang inn i hale grenen av bronkie trachealis til en lett motstand oppstår. Trekk tilbake 2-3 cm, åpne tang, presse frem ca 2 cm, lukke tang, trekke seg tilbake og fjerne tang fra arbeidskanal. Dette krever litt øvelse.
      3. Fjern forsiktig vev fra biopsitang, ved hjelp av en nål eller små tenger. Avhengig av den videre bruken av vevet, lagre det i flytende n Alleogen eller et egnet fikseringsmedium. Dette bør skje rett etter fjerning for å hindre autolytiske prosesser.
    5. Post-prosessuelle behandling
      1. Ta med dyret tilbake til stallen og plassere den i liggende stilling for å våkne opp. Ikke la dyret uten tilsyn eller i selskap med andre dyr før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Utvinningen stabile bør være luftavkjølt, da dyrets evne til termoregulering er redusert under generell anestesi.
      2. Overvåk dyret nøye for tegn på pneumothorax for den neste 24 hr. Gi fôr og friskt vann når dyret har gjenvunnet full bevissthet.

    Representative Results

    Course of Disease

    Effekten av organismen på dyrenes helse kan vurderes ved klinisk undersøkelse. I våre luftveisinfeksjon modeller, ble dyrene undersøkt to ganger daglig og kliniske observasjoner ble registrert med et poengsystem. Ytterligere informasjon ble tatt til fange ved å utføre andre in vivo utvalgsmetoder, for eksempel innsamling av blod og vattpinner eller lungefunksjon måling. Patologiske undersøkelser ble utført på ulike tidspunkt etter vaksinasjonen for å beskrive utviklingen av infeksjonen 32-34.

    Balf Recovery Rate

    Utvinningsgraden av innpodet væske var 83,05 ± 4,58% (gjennomsnitt ± SD).

    Patogen Detection

    Rekultiveringen av organismen kan utføres fra bronkial brushings. Dessuten er PCR-screening av forskjellige prøver mulig å detektere patogen, for eksempel tissue biopsi, cytologi børste sample, Balf-celler 52 eller svelg-vattpinne. Visualisering av organismen er mulig ved å utføre immunohistokjemi av frosne seksjoner av lunge biopsier og sedimenteringsmidler av de Balf-cellene (figur 3). I tidligere eksperimenter, ble PCR av blodprøver og vattpinner (konjunktival, fekal, nasal) utført for å karakterisere spredningen og utstøtingen av patogen 32..

    Markører for lokal betennelse i lungevevet

    I Balf, kan ulike parametere av lungebetennelse skal studeres. Det totale celletall og andelen av nøytrofiler vanligvis øke når lungebetennelse er til stede. For celledifferensiering, kan sedimente preparater av Balf-celler bli farget i henhold til Giemsa og differensiert bruke olje nedsenking (figur 4). Cellular and flytende proporsjoner av Balf blir separert ved sentrifugering (300 x g, 20 min). Den Balf-Supernatant inneholder ulike markører som endres i løpet inflammatoriske prosesser i lungene og kan studeres under eksperimentelle forhold. Eksempler er total protein og eikosanoider 29,34.

    En skjematisk oversikt over den potensielle videre anvendelse av de beskrevne eksempler er vist i figur 5..

    Figur 1
    Figur 1. Scheme av storfe lunge med inokuleringsprose områder (gule). Tallene angir rekkefølgen som pode administreres inn i forskjellige bronkiene. R: right; L: venstre. Høyre lunge: 1 Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 Lobus caudalis: 0,5 ml og 4 1,0 ml; Venstre lunge: Lobus cranialis, Pars cranialis: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1,5 ml, 8 Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml.

    Fig. 2
    . Figur 2 Scheme av storfe lunge med inokuleringsprose sider (gul) og prøvetakings nettsted:. Bronchoalveolar lavage (blå), bronkial børsting (grønn), og lunge biopsi (oransje) Legg merke til at alle prøvene er hentet fra områder der patogen ble deponert før. R: høyre, L: venstre.

    Figur 3
    Figur 3. A) Lung biopsi fra en kalv inokulert med CHL amydia psittaci 4 dager etter vaksinasjonen (dpi), b) cellulær sediment av Balf fra en kalv inokulert med C. psittaci 9 dpi. Immunhistokjemisk merking for Chlamydia. Chlamydial slutninger (piler) er til stede i lungen (a) og i alveolære makrofager (b). Hematoxylin counterstain.

    Figur 4
    Figur 4 Cellular sediment av Balf fra en kalv inokulert med C.. psittaci 9 dpi. alveolære makrofager (#) er den dominerende celletype i Balf. Mengden av nøytrofile granulocytter (*) øker når inflammatoriske prosesser er til stede. Modifisert Pappenheim farging.

    es.jpg "width =" 600 "/>
    Figur 5. Mulige metoder for prøveopparbeidelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Discussion

    En bronkoskopi-metode for inokulering ble utviklet og forskjellige bronkoskopi-samplingsmetoder er innrettet til å brukes i store dyr under eksperimentelle betingelser. De beskrevne teknikkene er lette å lære, selv for sensorer med liten erfaring i endoskopi. Prosessen med bronkoskopi er minimal invasiv og ingen skadelige effekter forbundet med fremgangsmåtene ifølge inokulering, så vel som de som er beskrevet metoder for prøvetaking (BAL, transbronchial lunge biopsi, bronkial børsting) ble sett i noen av dyrene. Komplikasjoner forbundet med transbronchial lunge biopsi hos mennesker er blødning og pneumothorax 48, ingen av disse ble sett i leggene som gjennomgikk denne prosedyren. Den transbronchial lunge biopsi er mer tidkrevende og krever mer utstyr enn transkutan metoden, men det er mindre invasiv og ikke bærer risikoen for sårinfeksjon.

    Den visuelt kontrollert, endoskopisk metode for inoculation tillater avsetning av en definert mengde av patogen på bestemte områder av lungen. Dermed resulterer det i svært konsistente kliniske og patologiske funn i alle inokulerte dyr 32-34. Men det betyr ligner ikke alle funksjonene i naturlig infeksjon i leggene. I en modell av en respiratorisk C. psittaci-infeksjon, den beskrevne teknikken for vaksinasjon førte til lunge lesjoner assosiert med nettstedene til patogen plassering 34, mens i naturlig infeksjoner kalver vanligvis utvikler lungebetennelse av de apikale fliker. Dette faktum må tas i betraktning når man tolker relevansen av eksperimentelle funnene i sammenheng med naturlige ervervet lungeinfeksjoner hos storfe.

    Videoendoskopisk BAL tillater prøvetaking et definert område av lungen. For eksperimentelle formål er dette en fordel i forhold til bruken av et nesekateter i henhold til blindbetingelser. På grunn av anatomien i bovin lunge, ville det blindt innsatt kateter være trykked til høyre magen lapp i de fleste tilfeller 53,54 og sensor har ingen innflytelse på det området av lungen som er lavaged. En annen fordel med endoskopisk BAL i bedøvede kalver i lateral recumbency er den høye gjennomsnittlige utvinningsgrad på innpodet fluid på mer enn 80%. En sammenligning med andre studier viser at, i stående, bedøvede kalver, en bedring på 133,3 ± 1,6 ml 46 og 127,13 ± 3,53 ml 45 etter drypping av 240 ml væske inn i hale lapp er rapportert. I sederte kalver i sternal recumbency 51% av den innpodet væske kunne utvinnes fra kranie lapp og 62% fra hale lobe 43. Det vil si at omtrent halvparten av den innpodet fluid kunne utvinnes i oppreist stilling på leggen. Avhengig av hvor mye Balf nødvendig for videre prøveopparbeidelse, dette kan ikke la nok materiale til å gjennomføre alle ønskede eksperimenter. BAL hos storfe har blitt brukt av mange forskningsgrupper og mangeulike parametre har blitt undersøkt under ulike forhold. De fleste forfattere utført kylling av de basale fliker 43,45,46, men mengden av væske som brukes til skylling skiller mellom forskningsgruppene. Dette fører til inkonsistens i fortynning av de gjenvundne celler, proteiner og andre stoffer, noe som gjør det vanskelig å sammenligne resultatene fra forskjellige publikasjoner. Derfor, for bruk i kveg er det anbefalt å lavage med fem fraksjoner på 20 ml (det vil si 100 ml totalt) kroppen varm, isotonisk saltløsning, som er utvunnet umiddelbart etter instillasjon. Når man bruker en lavage kateter med en stor diameter (dvs.> 2 mm), må volumet av hver fraksjon som skal noe økt, avhengig av mengden av væske som forblir i kateteret.

    Den svært segmentert anatomi av storfe lunge fører til en metodisk begrensning; Resultatene som oppnås fra en del av lungen kan ikke være sant for resten av lungen. Siden det ikke er noensynet kontroll over hele lungen området undersøkt av transbronchial biopsi og kylling, kan sensor ikke vet om de samplet områdene var friske eller syke. Derfor er det svært viktig å prøve steder hvor patogenet ble inokulert før for å ha en høyere utvinningsgrad av organismen og for å ha en større mulighet for prøvetaking syke lungeområdene. En annen begrensning er økt bedøvelse risiko i dyr av dårlig klinisk tilstand. De beskrevne fremgangsmåter bør bare benyttes i modeller av mild til moderat sykdom for å holde belastningen for dyrene så lavt som mulig. Generell anestesi i drøvtyggere skal alltid holdes så korte som mulig, fordi gassutvikling i vomma øker bedøvelse risikoen i disse artene. Dyr må plasseres i liggende stilling umiddelbart etter bronkoskopi å tillate effluks av den utviklede gassen og må overvåkes nøye til de er helt restituert fra anestesi. Også de beskrevne teknikker er ikke suitagjengelig for prøvetaking intervaller på mindre enn 24 timer.

    Den beskrevne protokollen kan tilpasses andre smittestoffer. Endoskopisk inokulering av forskjellige patogener har blitt beskrevet, for eksempel C. psittaci 32-34, Pasteur haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55, og bovin virus diaré virus 44. Dessuten kan de steder av patogen innskudd i lungen være tilpasset den aktuelle modellen. Ved valg av prøvetakingssteder, noen viktige fakta må tas i betraktning: (i) prøvetakingssteder bør velges basert på plasseringen av vaksinasjonen og på de forventede patologiske funn. (Ii) Når obduksjon skal utføres omsorg må tas for å forlate nok Uprøvde lungeområder for ex vivo prøvetaking. (Iii) Prøvetaking nettstedet steder må velges slik at de kan nås med utstyret. Spesielt for transbronchial lunge biopsi, er det begrensninger på grunn av lengden av biopsitang. (Iv) Than rekkefølgen av prøvetaking er viktig, bronkial børsting og transbronchial lunge biopsi kan føre til mindre blødning, noe som ville forurense Balf. Derfor Balf må alltid innhentes først. Ved bruk av protokollen i andre arter, må artsspesifikke lunge anatomi tas i betraktning.

    Disclosures

    Forfatterne har ingenting å avsløre.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2.2 mm, working length 140 cm
    Lavage catheter Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
    Actuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
    Biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
    Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
    Cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10 working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
    iv acess Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter: 1.2 mm; length: 43 mm
    Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
    Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
    Isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
    SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
    Metal tube speculum n/a n/a diameter: 3.5 cm; length: 35 cm
    Flashlight n/a n/a
    Siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
    Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
    Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
    Sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
    Inoculum n/a dilute pathogen in 8 ml buffer

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ireland, J. J., Roberts, R. M., Palmer, G. H., Bauman, D. E., Bazer, F. W. A commentary on domestic animals as dual-purpose models that benefit agricultural and biomedical research. Journal of animal science. 86, 2797-2805 (2008).
    2. Persson, C. G. Con: mice are not a good model of human airway disease. American journal of respiratory and critical care medicine. 166, 6-7 (2002).
    3. Haley, P. J. Species differences in the structure and function of the immune system. Toxicology. 188, 49-71 (2003).
    4. Hein, W. R., Griebel, P. J. A road less travelled: large animal models in immunological research. Nature reviews. Immunology. 3, 79-84 (2003).
    5. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
    6. Elferink, R. O., Beuers, U. Are pigs more human than mice. Journal of hepatology. 50, 838-841 (2009).
    7. Jawien, J., Korbut, R. The current view on the role of leukotrienes in atherogenesis. Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society. 61, 647-650 (2010).
    8. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3507-3512 (2013).
    9. Pabst, R. Allergy and Allergic Diseases. 1, (2009).
    10. Bovine Genome, S., et al. The genome sequence of taurine cattle: a window to ruminant biology and evolution. Science. 324, 522-528 (2009).
    11. Tellam, R. L., et al. Unlocking the bovine genome. BMC genomics. 10, 193 (2009).
    12. Graphodatsky, A. S., Trifonov, V. A., Stanyon, R. The genome diversity and karyotype evolution of mammals. Molecular cytogenetics. 4, 22 (2011).
    13. Kirschvink, N., Reinhold, P. Use of alternative animals as asthma models. Current drug targets. 9, 470-484 (2008).
    14. Coleman, R. A. Of mouse and man--what is the value of the mouse in predicting gene expression in humans. Drug discovery today. 8, 233-235 (2003).
    15. Kips, J. C., et al. Murine models of asthma. The European respiratory journal. 22, 374-382 (2003).
    16. Coraux, C., Hajj, R., Lesimple, P., Puchelle, E. In vivo models of human airway epithelium repair and regeneration. European Respiratory Review. 14, 131-136 (2005).
    17. McLaughlin, R. F., Tyler, W. S., Canada, R. O. A Study of the Subgross Pulmonary Anatomy in Various Mammals. American Journal of Anatomy. , 149-165 (1961).
    18. Robinson, N. E. Some functional consequences of species differences in lung anatomy. Adv Vet Sci Comp Med. 26, 1-33 (1982).
    19. Lekeux, P., Hajer, R., Breukink, H. J. Effect of Somatic Growth on Pulmonary-Function Values in Healthy Friesian Cattle. Am J Vet Res. 45, 2003-2007 (1984).
    20. Veit, H. P., Farrell, R. L. The anatomy and physiology of the bovine respiratory system relating to pulmonary disease. Cornell Vet. 68, 555-581 (1978).
    21. Gallivan, G. J., McDonell, W. N., Forrest, J. B. Comparative pulmonary mechanics in the horse and the cow. Res Vet Sci. 46, 322-330 (1989).
    22. Hunter, K. S., et al. In vivo measurement of proximal pulmonary artery elastic modulus in the neonatal calf model of pulmonary hypertension: development and ex vivo validation. Journal of applied physiology. 108, 968-975 (2010).
    23. Stenmark, K. R., et al. Severe pulmonary hypertension and arterial adventitial changes in newborn calves at 4,300 m. Journal of applied physiology. 62, 821-830 (1987).
    24. Tian, L., et al. Impact of residual stretch and remodeling on collagen engagement in healthy and pulmonary hypertensive calf pulmonary arteries at physiological pressures. Annals of biomedical engineering. 40, 1419-1433 (2012).
    25. Van Rhijn, I., Godfroid, J., Michel, A., Rutten, V. Bovine tuberculosis as a model for human tuberculosis: advantages over small animal models. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 711-715 (2008).
    26. Otto, P., et al. A model for respiratory syncytial virus (RSV) infection based on experimental aerosol exposure with bovine RSV in calves. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 19, 85-97 (1996).
    27. Gershwin, L. J., et al. A bovine model of vaccine enhanced respiratory syncytial virus pathophysiology. Vaccine. 16, 1225-1236 (1998).
    28. Gershwin, L. J. Immunology of bovine respiratory syncytial virus infection of cattle. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 35, 253-257 (2012).
    29. Jaeger, J., Liebler-Tenorio, E., Kirschvink, N., Sachse, K., Reinhold, P. A clinically silent respiratory infection with Chlamydophila spp. in calves is associated with airway obstruction and pulmonary inflammation. Veterinary research. 38, 711-728 (2007).
    30. Martinez-Olondris, P., Rigol, M., Torres, A. What lessons have been learnt from animal models of MRSA in the lung. The European respiratory journal. 35, 198-201 (2010).
    31. Sadowitz, B., Roy, S., Gatto, L. A., Habashi, N., Nieman, G. Lung injury induced by sepsis: lessons learned from large animal models and future directions for treatment. Expert review of anti-infective therapy. 9, 1169-1178 (2011).
    32. Ostermann, C., et al. Infection, Disease, and Transmission Dynamics in Calves after Experimental and Natural Challenge with a Bovine Chlamydia psittaci Isolate. PloS one. 8, (2013).
    33. Ostermann, C., Schroedl, W., Schubert, E., Sachse, K., Reinhold, P. Dose-dependent effects of Chlamydia psittaci infection on pulmonary gas exchange, innate immunity and acute-phase reaction in a bovine respiratory model. Vet J. 196, (2012).
    34. Reinhold, P., et al. A bovine model of respiratory Chlamydia psittaci infection: challenge dose titration. PloS one. 7, (2012).
    35. Reinhold, P., Sachse, K., Kaltenboeck, B. Chlamydiaceae in cattle: commensals, trigger organisms, or pathogens. Vet J. 189, 257-267 (2011).
    36. Dionisio, J. Diagnostic flexible bronchoscopy and accessory techniques. Revista portuguesa de pneumologia. 18, 99-106 (2012).
    37. Hilding, A. C. Experimental bronchoscopy: resultant trauma to tracheobronchial epithelium in calves from routine inspection. Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol. 72, 604-612 (1968).
    38. Potgieter, M. M., Hopkins, F. M., Walker, R. D., Guy, J. S. Use of fiberoptic bronchoscopy in experimental production of bovine respiratory tract disease. Am J Vet Res. 45, 1015-1019 (1984).
    39. Ackermann, M. R., Kehrli Jr, M. E., Brogden, K. A. Passage of CD18- and CD18+ bovine neutrophils into pulmonary alveoli during acute Pasteurella haemolytica pneumonia. Veterinary pathology. 33, 639-646 (1996).
    40. Malazdrewich, C., Ames, T. R., Abrahamsen, M. S., Maheswaran, S. K. Pulmonary expression of tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-8 in the acute phase of bovine pneumonic pasteurellosis. Veterinary pathology. 38, 297-310 (2001).
    41. Wells, A. U. The clinical utility of bronchoalveolar lavage in diffuse parenchymal lung disease. European respiratory review : an official journal of the European Respiratory Society. 19, 237-241 (2010).
    42. Wilkie, M. R. Sequential titration of bovine lung and serum antibodies after parenteral or pulmonary inoculation with Pasteurella haemolytica. Am J Vet Res. 40, 1690-1693 (1979).
    43. Pringle, J. K., et al. Bronchoalveolar lavage of cranial and caudal lung regions in selected normal calves: cellular, microbiological, immunoglobulin, serological and histological variables. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 52, 239-248 (1988).
    44. Silflow, R. M., Degel, P. M., Harmsen, A. G. Bronchoalveolar immune defense in cattle exposed to primary and secondary challenge with bovine viral diarrhea virus. Veterinary immunology and immunopathology. 103, 129-139 (2005).
    45. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Caswell, J. L. Alterations in the bovine bronchoalveolar lavage proteome induced by dexamethasone. Veterinary immunology and immunopathology. 118, 283-293 (2007).
    46. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Siwicky, M., Caswell, J. L. Stress alters the cellular and proteomic compartments of bovine bronchoalveolar lavage fluid. Veterinary immunology and immunopathology. 125, 111-125 (2008).
    47. Lordan, J. L., et al. Cooperative effects of Th2 cytokines and allergen on normal and asthmatic bronchial epithelial cells. J Immunol. 169, 407-414 (2002).
    48. Tukey, M. H., Wiener, R. S. Population-based estimates of transbronchial lung biopsy utilization and complications. Respiratory medicine. 106, 1559-1565 (2012).
    49. Braun, U., Estermann, U., Feige, K., Sydler, T., Pospischil, A. Percutaneous lung biopsy in cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association. 215, 679-681 (1999).
    50. Burgess, B. A., et al. The development of a novel percutaneous lung biopsy procedure for use on feedlot steers. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 75, 254-260 (2011).
    51. Sydler, T., Braun, U., Estermann, U., Pospischil, A. A comparison of biopsy and post-mortem findings in the lungs of healthy cows. Journal of veterinary medicine. A, Physiology, pathology clinical medicine. 51, 184-187 (2004).
    52. Voigt, K., et al. PCR examination of bronchoalveolar lavage samples is a useful tool in pre-clinical diagnosis of ovine pulmonary adenocarcinoma (Jaagsiekte). Research in Veterinary Science. 83, 419-427 (2007).
    53. Caldow, G. Bronchoalveolar lavage in the investigation of bovine respiratory disease. In Practice. 1, 41-43 (2001).
    54. Heilmann, P., Müller, G., Reinhold, P. Bronchoscopy and Segmental Bronchoalveolar Lung Lavage of Anesthetised Calf. Monatsh. Veterinärmed. 43, 79-84 (1988).
    55. Gogolewski, R. P., et al. Protective ability and specificity of convalescent serum from calves with Haemophilus somnus pneumonia. Infection and immunity. 55, 1403-1411 (1987).

    Tags

    Medisin translasjonell medisin luftveis modeller storfe lunge bronkoskopi transbronchial lunge biopsi bronchoalveolar kylling bronkial børsting cytologi børste
    Den Bovine Lung i biomedisinsk forskning: Visuelt Guidet Bronkoskopi, intrabronkial Pode og<em&gt; I Vivo</em&gt; sampling teknikker
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M.,… More

    Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter