Name: O pulmão bovino em Investigação Biomédica: visualmente guiada Broncoscopia, intrabrônquico Inoculação e In Vivo Técnicas de Amostragem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda técnicas broncoscópicas em bezerros para estudar infecções respiratórias, incluindo inoculação intrabrônquica, lavagem broncoalveolar e biópsia pulmonar transbrônquica. Este modelo permite amostragem repetida e análise de interações hospedeiro-patógeno.

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Os autores são muito gratos ao Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF) da Alemanha pelo financiamento de seu trabalho. Além disso, os autores agradecem a Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolf Rücknagel e a todos os outros colegas que trabalham na equipe do biotério (FLI, Alemanha) pela assistência técnica com as broncoscopias. Eles são muito gratos a Maria-Christina Haase (FLI, Alemanha) por sua ajuda em fornecer publicações. Além disso, os autores desejam expressar sua gratidão à Dra. Angela Berndt (FLI, Alemanha) e Nicolette Bestul (Universidade de Wisconsin-River Falls) pela leitura crítica do manuscrito.

Declaração de Ética Este estudo foi realizado em estrita conformidade com Europeu e Nacional de Direito para o Cuidado e Uso de Animais. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal e Proteção Animal no Estado da Turíngia, Alemanha (Número da licença: 04-004/11). Todos os experimentos foram realizados sob a supervisão do agente institucional autorizado para a Proteção Animal. A broncoscopia foi rigorosamente realizada sob anestesia geral. Durante o estudo, todos os esforços foram feitos para minimizar o desconforto ou sofrimento. Observações gerais As técnicas descritas têm sido desenvolvidos para vitelos com cerca de 6-8 semanas de idade, pesando cerca de 60-80 kg. Para o uso em outras espécies de animais grandes ou bezerros diferentes em idade e peso corporal, as técnicas devem ser adaptados para se ajustarem ao tamanho e peso e ter em conta a anatomia do pulmão da espécie animal em particular. Tudomaterial utilizado deve ser estéril. Chlamydia psittaci é uma bactéria zoonótica que pode causar doença respiratória e em geral nos seres humanos. A não aviária C. psittaci tensão DC15 utilizado no presente protocolo deve ser tratado sob nível de biossegurança 2. Todo o trabalho com o patógeno e com animais infectados devem ser realizadas usando equipamentos de proteção individual, como um respirador, um macacão à prova de respingos de água, botas de borracha e luvas. Vestindo um respirador adequado é de grande importância, uma vez que a via natural de infecção por C. psittaci é Aerogen. Embalagem e rotulagem das amostras deve ser à prova de desinfecção uma vez que todas as coisas devem ser tratadas com um desinfetante eficaz contra clamídias de acordo com as instruções do fabricante antes de deixar a unidade de alojamento dos animais. 1. Preparando o animal para broncoscopia <ol><li> Determinar o peso do bezerro para a dosagem de anestésicos. </li><li> Coloque um intravenosa (IV) i acesson a veia jugular esquerda. </li><li> Em primeiro lugar, injecta-se lentamente xilazina (0,2 mg / kg de peso corporal) ao longo de aproximadamente 30 seg, em seguida, após sedação ocorre, injectar cetamina (2,0 mg / kg de peso corporal). </li><li> Levante o animal em cima da mesa e colocá-lo em decúbito lateral direito. Uma vez que o animal está devidamente posicionado sobre a mesa, verifique se o acesso IV ainda está em vigor e reajustar se necessário. Durante a anestesia, verificar regularmente o reflexo da pálpebra para determinar a profundidade da anestesia. </li><li> Uma vez que o animal está respirando de forma constante, ter alguém puxar a língua para fora e esticar o pescoço. Coloque um espéculo tubo de metal na boca do animal, usando movimentos leves de rotação. Empurre o espéculo para a frente sob o controle de vista, usando uma lanterna, até a laringe é visível. </li><li> Manter a anestesia ao longo de todo o procedimento endoscópico por injecção de um bolus de 7 mg de xilazina e 70 mg de cetamina, conforme necessário. </li></ol> . 2 a inoculação (Sites de inoculação: Figura 1) </p&gt; <ol><li> Preparar 3 seringas com inoculo, contendo 1, 2, e 5 ml de inoculo. </li><li> Insira um tubo de Teflon em canal de trabalho do endoscópio. O tubo não deve se projetam a partir da ponta do endoscópio. </li><li> Insira o endoscópio através do espéculo metal. Reajustes Ligeira do espéculo pode ser necessário para permitir a passagem da laringe. A traqueia brônquios, que se ramifica para o lado direito, ajuda a alinhar a imagem no monitor. </li><li> Introduzir a seringa com 5 ml de inoculo para a extremidade do tubo de Teflon. Navegue o tubo para os galhos onde o inóculo deve ser depositado e aplicar a quantidade desejada (pulmão direito: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml e 1,0 ml; Esquerda pulmão: cranial LoBus, Pars cranial : 0,5 ml, Pars caudal: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1,5 ml). Fixe a seringa com 1 &amp;# 160; ml de inóculo para o tubo, em seguida, navegue até a traqueia brônquios e depositar o inóculo (cranial LoBus, Pars caudalis: 1,0 ml). É útil sempre aproximar as localizações na mesma ordem. </li><li> Remover o endoscópio e o espéculo. </li><li> Spray de 1 ml do inoculo em cada narina com um actuador. </li><li> Trazer o animal de volta para o estábulo e colocá-lo em posição de bruços para acordar. Não deixe o animal sozinho ou na companhia de outros animais até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. A recuperação deve ser estável com ar-condicionado, uma vez que a habilidade do animal para a termorregulação é reduzida sob anestesia geral. NOTA: Os primeiros sinais clínicos deve ocorrer cerca de 24-36 horas após a inoculação, dependendo do agente patogénico utilizada. </li></ol> . 3 Procedimentos de amostragem (locais de amostragem: Figura 2) <ol><li> Prepare o animal, tal como descrito nos passos 1,1-1,6. </li><li> O lavado broncoalveolar <ol><li> Colocar 5 seringas, contendo cada um 20 ml de solução salina isotónica estéril, em um banho de água e permitir que aqueça até cerca de 38 ° C. </li><li> Insira um cateter de lavagem em canal de trabalho do endoscópio, em seguida, insira o endoscópio para o espéculo de metal e navegar para a frente no brônquio principal do pulmão esquerdo até a posição &quot;cunha&quot; é alcançado onde o endoscópio não pode ser empurrado para mais longe à frente. </li><li> Um após o outro, coloque as seringas com a solução quente NaCl ao cateter lavagem, incutir o fluido e aspirar diretamente. O fluido de lavagem bronco-alveolar deverá ser armazenada em garrafas de vidro siliconados e colocar em gelo imediatamente após a recuperação para evitar que os macrófagos alveolares de unir à superfície do vidro. Nota tanto a quantidade de solução salina e instilados a quantidade de líquido recuperado. </li><li> Remover o cateter lavagem do canal de trabalho. </li></ol></li><li> Escovação brônquica<ol><li> Navegar no endoscópio para o local de amostragem pretendido, no protocolo descrito este é o Bifurcatio traqueias. </li><li> Cubra a escova com o tubo antes de inseri-lo em canal de trabalho do endoscópio até a ponta do pincel aparece no monitor. </li><li> Empurrar a escova com o tubo de plástico para a frente de cerca de 5 cm, e descobrir que a partir do tubo de plástico, empurrando o cabo, em seguida, ele navegue para a localização que está a ser escovado. </li><li> Esfregue fora chamadas epiteliais por gentilmente empurrando e puxando a escova para trás e para a frente durante a navegação do endoscópio para garantir o contato entre o pincel ea parede do brônquio. Pare de esfregar quando ocorre sangramento. Cubra a escova com o tubo antes de puxá-lo para fora do canal de trabalho. </li><li> Prepare-se para cinco esfregaços em lâminas de microscópio por suavemente ondulado a escova sobre o slide. Fixar os esfregaços em metanol frio por 10 min, o ar seco e armazenar a -20 ° C. </li><li> A escova pode ser lavado emdiversos meios de comunicação, dependendo da finalidade das células da amostra. Se tomar vários escovações com o mesmo pincel, certifique-se apenas lave-o nos meios de comunicação, que não irritam a mucosa. </li></ol></li><li> A biópsia pulmonar transbrônquica <ol><li> Navegar no endoscópio para o local de amostragem pretendido, no protocolo descrito este é o caudal Pars dos cranial LoBus. Antes de colocar a pinça de biópsia para o canal de trabalho aberto e fechá-lo um par de vezes para garantir que ele está funcionando sem problemas. </li><li> Empurre a pinça de biópsia para o ramo caudal do brônquio traqueal até encontrar uma resistência ocorre. Puxe 2-3 cm, abrir a pinça, empurrar para a frente cerca de 2 cm, fechar a pinça, puxar para trás e retire a pinça do canal de trabalho. Isso requer um pouco de prática. </li><li> Cuidadosamente remover o tecido a partir de uma pinça de biópsia, utilizando uma agulha ou uma pequena pinça. Em função da utilização do tecido, armazená-lo em nitr líquidoogen ou um meio de fixação adequado. Isso deve acontecer logo após a remoção para evitar processos de autólise. </li></ol></li><li> Tratamento pós-procedimento <ol><li> Trazer o animal de volta para o estábulo e colocá-lo em posição de bruços para acordar. Não deixe o animal sozinho ou na companhia de outros animais até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. A recuperação deve ser estável com ar-condicionado, uma vez que a habilidade do animal para a termorregulação é reduzida sob anestesia geral. </li><li> Monitorar o animal de perto para sinais de pneumotórax para a próxima 24 horas. Fornecer alimentação e água fresca quando o animal recuperou a consciência plena. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um método de broncoscopia de inoculação foi desenvolvida e vários métodos de amostragem broncoscopia foram adaptados para serem utilizados em animais de grande porte, em condições experimentais. As técnicas descritas são fáceis de aprender, mesmo para examinadores com pouca experiência em endoscopia. O processo de broncoscopia é minimamente invasiva e sem efeitos adversos associados com os métodos da inoculação, bem como os métodos de amostragem descritos (BAL, biopsia pulmonar transbrônquica, escovagem brônquica), nunca foram observados em qualquer um dos animais. As complicações associadas com biópsias pulmonar transbrônquica em humanos estão sangrando e pneumotórax 48, nenhum deles foram observadas nos bezerros que foram submetidos a esse procedimento. A biópsia pulmonar transbrônquica é mais demorado e exige mais equipamentos do que o método transcutâneo, mas é menos invasivo e não assumir o risco de infecção da ferida. O método visualmente controlada, endoscópico de inoculaçãoião permite a deposição de uma quantidade definida de agente patogénico em sítios específicos do pulmão. Assim, resulta em achados clínicos e patológicos muito consistentes em todos os animais inoculados 32-34. No entanto, isso não se assemelha a todas as características de infecção natural em bovinos. Em um modelo de um C. respiratória infecção psittaci, a técnica descrita de inoculação levou a lesões pulmonares associadas aos locais de colocação patógeno 34, que, em infecções adquiridas naturalmente bezerros geralmente se desenvolvem pneumonia dos lobos apicais. Este facto tem que ser levado em conta ao interpretar a relevância dos resultados experimentais no contexto de infecções pulmonares naturais adquiridos em bovinos. Videoendoscópica BAL permite a amostragem de uma área definida do pulmão. Para fins experimentais, esta é uma vantagem em comparação com a utilização de um cateter nasal sob condições cegas. Devido à anatomia do pulmão de bovino, o cateter inserido cegamente seria impulsoed para o lóbulo direito do diafragma, na maioria dos casos, 53,54 e o examinador não tem nenhuma influência sobre a área do pulmão que está lavados. Outra vantagem da BAL endoscópica em bezerros anestesiados em decúbito lateral é a elevada taxa de recuperação média de fluido instilado de mais do que 80%. A comparação com outros estudos revelam que, em pé, bezerros sedados, uma recuperação de 133,3 ± 1,6 ml 46 e 127,13 ± 3,53 ml 45 após a instilação de 240 ml de líquido para o lobo caudal é relatado. Em vitelas sedados em decúbito esternal 51% do fluido instilado pode ser recuperado a partir do lobo cranial e 62% a partir do lobo caudal 43. Isto significa que aproximadamente a metade do líquido instilado poderia ser recuperado em posição vertical da panturrilha. Dependendo da quantidade de BALF necessário para posterior preparação de amostras, isso pode não deixar material suficiente para realizar todos os experimentos desejados. BAL em gado tem sido utilizado por vários grupos de pesquisa e muitosdiferentes parâmetros foram examinados sob várias condições. A maior parte dos autores realizaram lavagem dos lóbulos basais 43,45,46, mas a quantidade de líquido utilizada para a lavagem difere entre os grupos de pesquisa. Isto leva a inconsistências na diluição das células recuperadas, proteínas e outras substâncias, o que torna difícil comparar os resultados de diferentes publicações. Portanto, para o uso em bovinos, recomenda-se a lavagem com cinco fracções de 20 ml (ou seja, de 100 ml no total) do corpo quente, solução salina isotónica, que são recuperados imediatamente após a instilação. Quando se utiliza um cateter lavado com um grande diâmetro (isto é,&gt; 2 mm), o volume de cada fracção precisa de ser ligeiramente aumentada, dependendo da quantidade de líquido que permanece no cateter. A anatomia altamente segmentado do pulmão bovino leva a uma limitação metódico; os resultados obtidos a partir de uma parte do pulmão pode não ser verdadeiro para o resto do pulmão. Uma vez que não há écontrole de vista a área de todo pulmão sondado por biópsia transbrônquica e lavado, o examinador não pode saber se as áreas amostradas eram saudáveis ​​ou doentes. Portanto, é muito importante amostrar locais onde o fungo foi inoculado antes, a fim de ter uma taxa de recuperação mais elevada do agente patogénico e que têm uma possibilidade mais elevada de amostragem áreas pulmonares doentes. Outra limitação é o aumento do risco anestésico em animais de má condição clínica. Os métodos descritos devem ser utilizados apenas em modelos de doença leve a moderada para manter o peso para os animais tão baixas quanto possível. Anestesia geral em ruminantes deve sempre ser o mais curto possível, como o desenvolvimento de gás no rúmen aumenta o risco anestésico nestas espécies. Os animais devem ser colocados em decúbito ventral, imediatamente após a broncoscopia para permitir o efluxo do gás desenvolvido e tem de ser cuidadosamente monitorizado até que sejam completamente recuperado da anestesia. Além disso, as técnicas descritas não são suitasável por amostragem intervalos de menos de 24 horas. O protocolo descrito pode ser adaptado a outros agentes infecciosos. Inoculação endoscópica de vários agentes patogénicos tem sido descrito, tal como C. psittaci 32-34, Pasteurella haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55, e vírus da diarréia viral bovina 44. Além disso, os locais de depósito do patógeno no pulmão pode ser adaptada para o modelo desejado. Ao escolher os locais de amostragem, alguns fatos importantes devem ser levados em conta: locais (i) A amostragem deve ser escolhido com base nos locais de inoculação e nos achados patológicos esperados. (Ii) Quando a necropsia deve ser realizada é preciso ter cuidado para deixar suficientes áreas pulmonares não amostrados para ex vivo de amostragem. (Iii) os locais de pontos de amostragem deve ser escolhida de modo que pode ser alcançado com o equipamento. Especialmente para a biópsia pulmonar transbrônquica, há limitações devido ao comprimento da pinça de biópsia. (Iv) Tele ordem de amostragem é importante, escovado brônquico e biópsia pulmonar transbrônquica pode levar a pequenos sangramentos, o que contaminaria a LBA. Portanto, LBA deve ser sempre obtido em primeiro lugar. Quando se utiliza o protocolo de outras espécies, a anatomia do pulmão específica da espécie devem ser tidas em conta.

Os Valores de grandes modelos animais na investigação biomédica Na pesquisa biomédica interdisciplinar moderno, modelos animais ainda são indispensáveis ​​para elucidar interações complexas - relacionado à saúde ou um estado da doença - dentro de organismos de mamíferos. Apesar de 17 prêmios Nobel a ser concedido a cientistas que estudaram o gado, cavalos, ovelhas, ou aves como modelos para a investigação biomédica 1, hoje em dia a grande maioria das experiências com animais sejam realizados com roedores, enquanto que menos de 1% dos estudos estão a trabalhar com os animais domésticos ou pecuária. Pequenos animais oferecem muitas vantagens práticas (ou seja, de baixo custo, maleabilidade genética, alta produtividade, disponibilidade de numerosos genética e ferramentas imunológicas e kits), e modelos murinos geneticamente modificados são geralmente aceitos para realizar estudos sobre os mecanismos descobrindo caminhos moleculares específicos. Na pesquisa biomédica de sistemas complexos, tele relevância biológica e utilidade clínica dos modelos de ratos está se tornando cada vez mais questionável. Eles poderiam ser enganosa e assumir o risco de excessiva simplificação da complexidade biológica 2-9. Devido às peculiaridades inter-espécies, há espécies animais individuais irá espelhar completamente a situação humana, e a utilização de mais de um modelo parece ser benéfica em uma abordagem de pesquisa interdisciplinar biomédica. No contexto da medicina translacional, animais de grande porte oferecem a oportunidade de servir como modelos comparativos fornecendo resultados com alta relevância biológica de dupla utilização para a saúde humana e animal 1. Notavelmente, o genoma humano está mais intimamente se assemelhavam com o genoma bovino de pelo genoma de roedores de laboratório. Também foi recentemente confirmado que, em comparação com outros taxa, o genoma dos ratos é muito mais rearranjado 10-12. Em um projeto de estudo complexo, o uso de animais oferece a unique oportunidade de, estudos intra-individuais de longa duração por recolha repetida de uma variedade de amostras in vivo a partir de um e de o mesmo individuum sem sacrificar o animal. Portanto, as alterações funcionais, inflamatórias e morfológicas podem ser monitorizados para o mesmo indivíduo ao longo de um certo período de tempo 13. O pulmão bovino como um modelo respiratório adequado Devido ao elevado número de diferenças significativas na anatomia do pulmão, fisiologia respiratória, e imunologia pulmonar, os ratos não se reproduzem muitos aspectos fisiopatológicos importantes da doença pulmonar humana. Isto deve ser tomado em conta quando se utiliza como modelos animais de doença respiratória 2,9,14-16. Embora peculiaridades da anatomia e estrutura que existem para cada pulmão de mamíferos, características funcionais (ou seja, os volumes pulmonares, fluxos de ar e mecânica respiratória) são mais comparáveis ​​entre seres humanos adultos e bezerros devido ao peso corporal semelhantes(50-100 kg). As características do pulmão bovino específicos das espécies, estão resumidos como se segue: o pulmão esquerdo consiste em dois lóbulos (cranialis LoBus, que é dividido em dois segmentos, e lobus caudalis), enquanto o pulmão direito consiste de quatro lóbulos (lobus cranial, lobus medius, lobus caudalis e lobus accessorius). Ao contrário da anatomia do pulmão da maioria dos outros mamíferos, os brônquios dos ramos lobo cranial direito diretamente da lateral direita da traquéia. No que diz respeito ao subgross anatomia, o pulmão de bovino apresenta um elevado grau de lobulação e uma elevada percentagem de tecido intersticial 17,18 conduzindo a um nível relativamente baixo da complacência pulmonar específica e uma resistência do tecido pulmonar superior 19. Portanto, a actividade de respiração necessário é bastante elevado em comparação com outras espécies de 20,21. O elevado grau de lobulação conduz a uma forte independência dos segmentos. Assim, infprocessos lammatory são limitados por septos do tecido conjuntivo, e segmentos doentes e saudáveis, muitas vezes se encontram dentro do mesmo lobo. Devido à falta de vias colaterais, o pulmão de bovino é particularmente adequada para espelhar disfunções pulmonares obstrutivas 13. Em relação à vasculatura do pulmão de bovino, as pequenas artérias pulmonares mostram camadas de músculo liso muito proeminentes. Portanto, o vitelo pode também servir como um modelo animal bem estabelecido para a hipertensão pulmonar ou remodelação vascular 22-24. Com relação às infecções respiratórias, doenças que ocorrem naturalmente existem em gado que compartilham muitas semelhanças com a doença comparável no homem. Exemplos típicos são a tuberculose bovina 25, o vírus sincicial respiratório (VSR) infecções em bezerros 26-28, ou infecções de clamídia naturalmente adquiridas 29. Assim, as grandes modelos animais que se assemelham a situação no hospedeiro natural. Portanto, eles são mais useful para o estudo de interações patógeno-hospedeiro e complexa fisiopatologia da doença correspondente em seres humanos 30,31. Como um modelo biologicamente relevante de infecção Chlamydia psittaci respiratória, os bezerros foram escolhidos por bovinos representam hospedeiros naturais para este patógeno 32-35. As informações obtidas a partir deste modelo, com relação a patogênese da doença ou possíveis vias de transmissão entre animais e seres humanos, vai ajudar a ampliar o nosso conhecimento com impacto tanto para o gado eo homem. O modelo também pode ajudar a verificar se as opções terapêuticas alternativas geralmente aceites e para a eliminação de C. pulmonar infecções psittaci, que é, mais uma vez, de interesse em medicina veterinária e humana. Técnicas aplicadas e amostras obtidas a partir do Sistema Respiratório Bovino Este artigo descreve e ilustra as técnicas e métodos de diagnóstico applicable para o pulmão de bovino e utilizados no nosso modelo para avaliar ambos os efeitos do patogénio no pulmão de mamífero e a eficácia da intervenção terapêutica. A broncoscopia foi realizada na medicina humana desde os anos 1960 e é considerado um procedimento seguro 36. Em vitelas, broncoscopia experimental foi descrita em 1968, pela primeira vez 37. A aplicação intrabrônquico de patógenos foi sugerido por Potgieter et al. Como um método confiável para a produção de doença do trato respiratório inferior em bezerros 38 e é agora um método generalizado na pesquisa bovina 34,39,40. Inoculação intrabronquial de uma quantidade definida do patógeno sob controlo videoendoscópico permite a colocação selectiva do agente infeccioso no pulmão. Isto leva a achados clínicos e patológicos consistentes em todos os animais 34 e permite amostragem orientada de regiões pulmonares que se espera que sejam alteradas devido à exposição de patógenos. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; broncoalveolar fluido de lavagem (LBA), é um indicador bem descrita para a presença e gravidade de inflamação pulmonar. A lavagem broncoalveolar (BAL) é um procedimento padrão na medicina humana, para o diagnóstico de uma variedade de doenças respiratórias 41. Em bovinos vivos, BAL foi introduzido por Wilkie e Markham no final dos anos setenta do século passado 42. Considerou-se uma técnica segura e reprodutível para estudar o tracto respiratório inferior de gado. Devido à falta de dados suficientes sobre os parâmetros LBA em animais saudáveis, em 1988 Pringle et al. Realizada BAL em bezerros saudáveis ​​com um broncoscópio de fibra óptica flexível. Os autores também apontou a necessidade de padronizar os protocolos de BAL em condições experimentais para a aquisição de resultados comparáveis ​​43. BAL é ainda usado como um método in vivo de amostragem em bezerros 44-46. Escovação brônquica é comumente usado em medicina humana como umferramenta de diagnóstico para provar lesões neoplásicas ou para análise microbiológica 36. Para os fins da pesquisa, as culturas de células primárias de células epiteliais colhidas por escovagem citológica pode ser obtido 47. Em gado, o uso de escovagens brônquicas para análise microbiológica foi descrito para caracterizar o ambiente microbiano do pulmão 43. A biópsia pulmonar transbrônquica fornece amostras de tecido do pulmão e é uma valiosa ferramenta de diagnóstico para doenças pulmonares difusas em seres humanos. Pneumotórax iatrogênica e hemorragia relacionada ao procedimento são as complicações associadas com esta técnica. A sua incidência é relatado como sendo inferior a um por cento em pacientes humanos 48. Biopsia do pulmão transbrônquica não é um método comum para a utilização em bovinos, devido ao elevado custo do equipamento necessário e o tempo necessário para obter biópsias. Em vez disso, biópsias pulmonares transcutânea são mais convenientes em condições de campo 49-51.

<table><tbody><tr><td>Videoendoscópio Veterinário</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Alemanha</td><td>PV-SG 22&ndash; 140</td><td>diâmetro: 9 mm, canal de trabalho: 2,2 mm, comprimento de trabalho 140 cm</td></tr><tr><td>Cateter de lavagem</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Alemanha</td><td></td><td>diâmetro: 2 mm; comprimento: 180 cm, Atuador adaptador Luer-lock</td></tr><tr><td></td><td>WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Alemanha</td><td>32660</td><td>comprimento: 60 mm</td></tr><tr><td>Pinça de biópsia</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Alemanha</td><td>REF 60180LT</td><td>1,8 mm, serrilhada, oval</td></tr><tr><td>Omnifix 20 ml, Luer-Lock</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha</td><td>4617207V</td><td></td></tr><tr><td>Escova de citologia</td><td>mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Alemanha</td><td>110240-10</td><td>comprimento de trabalho 180 cm, comprimento da escova: 15 mm, diâmetro 1,8 mm</td></tr><tr><td>iv acesso</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hamburgo, Alemanha</td><td>370-211</td><td>diâmetro: 1,2 mm; comprimento: 43 mm</td></tr><tr><td>Rompun 2% (xilazina)</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemanha</td><td></td><td>0,2 mg/kg de peso corporal</td></tr><tr><td>Ketamin 10% (cetamina)</td><td>bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Alemanha</td><td></td><td>2,0 mg/kg de peso corporal</td></tr><tr><td>Solução salina isotônica</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha</td><td></td><td></td>3200950</tr><tr><td>SUB 6 banho-maria</td><td>CLF analytische Laborger&auml; te GmbH, Emersacker, Alemanha</td><td>n/a</td> Espéculo de tubo metálico n/a <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>n/a</td><td>diâmetro: 3,5 cm; comprimento: 35 cm</td></tr><tr><td>Lanterna</td><td>n/</td><td>a n/a</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de vidro siliconizadas</td><td>n/</td><td>a n/a</td><td>siliconizar com Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix Luer 5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha</td><td>4616057V</td><td></td></tr><tr><td>Tampões de vedação</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hamburgo, Alemanha</td><td>900-3057</td><td></td></tr><tr><td>Inóculo</td><td></td><td>n/a</td><td>patógeno diluído em tampão de 8 ml</td></tr></tbody></table>

o pulmão bovino em investigação biomédica: visualmente guiada broncoscopia, intrabrônquico inoculação e<em&gt; in vivo</em&gt; técnicas de amostragem

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Há uma busca permanente de modelos animais alternativos na pesquisa da medicina respiratória. Dependendo do objetivo da pesquisa, os grandes animais como modelos de doença pulmonar muitas vezes se assemelham a situação do pulmão humano muito melhor do que os ratos fazem. Trabalhando com grandes animais também oferece a oportunidade de saborear o mesmo animal várias vezes ao longo de um determinado curso de tempo, o que permite que os estudos a longo prazo, sem sacrificar os animais. O objetivo foi o de estabelecer métodos in vivo de amostragem para o uso em um modelo de bovinos de uma infecção Chlamydia psittaci respiratório. A amostragem deve ser efectuada em vários pontos de tempo em cada animal durante o estudo, e as amostras devem ser adequados para estudar a resposta do hospedeiro, bem como o agente patogénico, em condições experimentais. A broncoscopia é uma valiosa ferramenta de diagnóstico em medicina humana e veterinária. É um procedimento seguro e minimamente invasivo. Este article descreve a inoculação intrabrônquico de bezerros, bem como métodos de amostragem para o trato respiratório inferior. Videoendoscópica, inoculação intrabrônquico leva a achados clínicos e patológicos muito consistentes em todos os animais inoculados e é, portanto, adequado para uso em modelos de doença pulmonar infecciosa. Os métodos de amostragem descritos são lavado bronco-alveolar, escovado brônquico e biópsia pulmonar transbrônquica. Todos estes são valiosas ferramentas de diagnóstico em medicina humana e poderiam ser adaptados para fins experimentais para bezerros com idade de 6-8 semanas. As amostras obtidas foram adequados para a detecção de agentes patogénicos e caracterização da gravidade da inflamação do pulmão no hospedeiro.

Curso da doença O efeito do patógeno sobre a saúde dos animais pode ser avaliada por exame clínico. Nos nossos modelos de infecção respiratória, os animais foram examinados duas vezes ao dia e de observações clínicas foram registadas utilizando um sistema de pontuação. Informações adicionais foram capturados através da realização de outros métodos in vivo de amostragem, por exemplo, coleta de sangue e swabs ou medição da função pulmonar. Exames patológicos foram realizados em diferentes pontos de tempo após a inoculação, para descrever o progresso da infecção 32-34. BALF Taxa de Recuperação A taxa de recuperação do líquido instilado foi 83,05 ± 4,58% (média ± DP). Pathogen Detection Recultivo do agente patogénico pode ser realizada a partir de escovagens brônquicas. Além disso, a PCR de rastreio de várias amostras é possível detectar o agente patogénico, por exemplo, tibiópsia ssue, amostra citologia, células-LBA 52 ou faringe cotonete. A visualização do patógeno é possível através da realização de imuno-histoquímica de secções congeladas de biópsias pulmonares e preparações de sedimentação das células-LBA (Figura 3). Em experiências anteriores, por PCR de amostras de sangue e compressas (conjuntival, fecal, nasal) foram realizados para caracterizar a propagação e disseminação de agente patogénico 32. Marcadores de inflamação local do tecido pulmonar No LBA, vários parâmetros de inflamação pulmonar pode ser estudada. A contagem total de células e a percentagem de neutrófilos aumenta geralmente quando a inflamação pulmonar está presente. Para a diferenciação de células, preparações de sedimentação de células-LBA pode ser corado com Giemsa e diferenciadas com imersão em óleo (Figura 4). Proporções celulares e líquida da LBA são separadas por centrifugação (300 xg, 20 min). O LBA-Sobrenadante contém vários marcadores que mudam durante processos inflamatórios no pulmão e podem ser estudadas em condições experimentais. Exemplos são a proteína total e eicosanóides 29,34. Uma visão geral esquemática do potencial utilização posterior das amostras descritas é mostrada na Figura 5. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Esquema do pulmão de bovino com locais de inoculação (amarelo). Os números indicam a ordem em que o inoculo é administrado em diferentes brônquios. R: right; L: esquerda. Pulmão direito: 1 Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 LoBus caudalis: 0,5 ml e 1,0 ml 4; Pulmão esquerdo: cranial LoBus, <strong&gt; 5 Pars cranial: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1,5 ml, 8 cranial LoBus, Pars caudalis: 1,0 ml. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig2highres.jpg" width="500" /> . Figura 2 Esquema do pulmão bovino com os locais de inoculação (amarelo) e os locais de amostragem:. Lavado bronco-alveolar (azul), escovação brônquica (verde), e biópsia pulmonar (laranja) Note-se que todas as amostras são obtidas de regiões onde o patógeno foi depositado antes. R: direita, L: esquerda. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. A) A biópsia pulmonar a partir de um bezerro inoculado com Chl<html> amydia psittaci 4 dias após a inoculação (dpi), b), os sedimentos celulares de FLBA de um bezerro inoculados com C. psittaci 9 dpi. Imunohistoquímica para clamídias. Inclusões por clamídia (setas) estão presentes no pulmão (a) e em macrófagos alveolares (b). Contracorante hematoxilina. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Sedimento celular de LBA de um bezerro inoculados com C. psittaci 9 dpi. macrófagos alveolares (#) são o tipo de célula predominante no LBA. A quantidade de granulócitos neutrófilos (*) aumenta quando os processos inflamatórios estão presentes. Coloração Pappenheim Modificada. &quot;width =&quot; 600 es.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Possíveis métodos para a preparação de amostras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51557/51557fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este artigo descreve técnicas de broncoscopia no pulmão bovino em condições experimentais, ou seja, a inoculação broncoscopicamente guiada, lavado bronco-alveolar, escovado brônquico e biópsia pulmonar transbrônquica.

O pulmão bovino em Investigação Biomédica: visualmente guiada Broncoscopia, intrabrônquico Inoculação e<em&gt; In Vivo</em&gt; Técnicas de Amostragem

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar as interações entre hospedeiro e patógeno em um modelo bovino de infecção respiratória. Isso é alcançado induzindo uma infecção respiratória em bezerros por inoculação intra-brônquica com o patógeno de interesse durante o curso da doença. O animal é amostrado repetidamente por lavagem broncoalveolar.A seguir, escovados brônquicos e biópsias pulmonares transbrônquicas são obtidos para recuperar células epiteliais e amostras de tecido alveolar ou pulmonar, respectivamente. Em última análise, pode-se confirmar doenças respiratórias específicas do agente patogênico, por exemplo, por meio de alterações inflamatórias no lavado, citologia e detecção imuno-histoquímica do patógeno. Nas biópsias pulmonares transbrônquicas está a principal vantagem deste modelo de grande animal em comparação com outros modelos animais existentes e roedores, que é a possibilidade de estudar a evolução da doença ao longo de um longo período de tempo no mesmo indivíduo por meio de amostragens repetidas.Embora este método possa fornecer informações sobre as interações entre hospedeiro e patógeno in vivo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como patógenos alternativos ou espécies hospedeiras. A manutenção da anestesia e a assistência na coleta de amostras serão realizadas por uma pesquisadora, que é veterinária do nosso laboratório. Antes de iniciar o procedimento, encha três seringas com um, dois e cinco mililitros do inóculo.Em seguida, após a confirmação da anestesia, puxe a língua do animal e estique o pescoço. A seguir, usando movimentos leves de rotação, coloque um espéculo metálico na boca do bezerro. Empurre o espéculo para frente sob controle visual, utilizando uma lanterna para determinar quando a laringe se tornar visível.Em seguida, insira um tubo de teflon no canal operativo de um endoscópio. O tubo não deve protrudir da ponta do endoscópio. Insira o endoscópio através do espéculo.Pode ser necessário realizar pequenos ajustes no espéculo para permitir a passagem do endoscópio. Para ultrapassar a laringe, utilize o brônquio traqueal, que se ramifica para o lado direito do pulmão, a fim de ajudar a alinhar a imagem no monitor. Em seguida, conecte a seringa contendo cinco mililitros de inóculo à extremidade do tubo de teflon.Navegue pelo tubo até os ramos onde o inóculo será depositado e administre a quantidade apropriada de inóculo. Em seguida, conecte a seringa contendo um mililitro de inóculo ao tubo. Navegue até o brônquio traqueal e deposite o inóculo no ramo coddle.Remova o endoscópio e o espéculo. Em seguida, acople a última seringa a um atuador e pulverize um mililitro do inóculo em cada narina. Coloque o animal de volta em sua baia na posição prona para despertar.O estábulo de recuperação deve ser climatizado. Como a capacidade do animal de termorregulação está reduzida sob anestesia geral, aqueça cinco seringas, cada uma contendo 20 mililitros de solução salina estéril isotônica, em banho-maria a 38 graus Celsius, para coletar amostras valvares no momento desejado. Em seguida, insira um cateter de lavagem no canal de trabalho do endoscópio e introduza o endoscópio no especulo metálico.Em seguida, avance pelo brônquio principal do pulmão esquerdo até alcançar a posição em cunha, momento em que o endoscópio não pode ser avançado mais. Então, uma a uma, conecte as seringas com a solução morna de cloreto de sódio ao cateter de lavagem para instilar e aspirar diretamente o fluido.Armazene o fluido de lavagem broncoalveolar em frascos de vidro silanizados sobre gelo imediatamente após a recuperação, para impedir que os macrófagos alveolares adiram à superfície de vidro. Anote tanto a quantidade de salina instilada quanto a quantidade de fluido recuperado. Em seguida, remova o cateter de lavagem do canal de trabalho para coletar as células epiteliais.Em seguida, direcione o endoscópio até o local desejado para coleta. Por exemplo, neste experimento, até a bifurcação da traqueia; quando o endoscópio estiver posicionado, cubra uma escova brônquica com o tubo e insira-a no canal de trabalho do endoscópio até que a ponta da escova apareça no monitor. Empurre a escova e o tubo plástico cerca de cinco centímetros para frente.Em seguida, empurre o cabo da escova para retirá-la do tubo plástico. Quando a escova estiver posicionada, conduza-a até o local que deve ser escovado. Então, empurre e puxe suavemente a escova para frente e para trás enquanto conduz o endoscópio.Para garantir o contato entre a escova e a parede do brônquio, esfregando as células epiteliais. Interrompa a fricção quando ocorrer sangramento. Em seguida, cubra a escova com o tubo e retire-a do canal de trabalho.Rolando suavemente as cerdas revestidas com células epiteliais sobre até cinco lâminas de microscópio, fixe os esfregaços em metanol frio durante 10 minutos. Em seguida, após permitir que as lâminas sequem ao ar, armazene-as a menos 20 graus Celsius para realizar uma biópsia pulmonar transbrônquica. A seguir, conduza o endoscópio até o local de coleta desejado.Por exemplo, a pars Alis das LOAs crans conforme neste experimento, antes de inserir a pinça de biópsia no canal de trabalho, abra e feche a pinça algumas vezes para garantir seu funcionamento adequado e, em seguida, empurre a pinça até o ramo coddle da traqueia brônquica até que ocorra uma leve resistência. Agora, recue dois a três centímetros e abra a pinça. Empurre a pinça para frente novamente, cerca de dois centímetros, e então feche-a.Puxe para trás e remova a pinça do canal de trabalho. Use uma agulha para remover cuidadosamente o tecido da pinça de biópsia e armazene-o em um meio de fixação apropriado para evitar a formação de processos autolíticos. Por fim, após permitir que o bezerro se recupere em seu compartimento, monitore novamente o animal quanto a pneumotórax nas próximas 24 horas, fornecendo alimento e água fresca.Quando o animal recuperar plenamente a consciência, cortes congelados de biópsias pulmonares transbrônquicas podem ser corados imunohistoquimicamente. Para visualizar o patógeno inoculado, observe as inclusões marrons de clamídia no pulmão deste animal que foi inoculado com clamídia C quatro dias antes da coleta da amostra. A coloração imunohistoquímica das células do lavado permite a visualização de patógenos intracelulares.Por exemplo, nesta imagem, inclusões clamidiais estão presentes nos macrófagos alveolares coletados de um bezerro. Nove dias após a inoculação intra-brônquica com chlamydia, pode-se observar CTAC. As células do lavado broncoalveolar podem ser diferenciadas por coloração citológica.Os macrófagos alveolares são o tipo celular predominante no fluido de lavagem. No entanto, o número de granulócitos neutrófilos aumenta na presença de processos inflamatórios. Uma vez dominada, a inoculação pode ser realizada em 10 a 15 minutos e a coleta em 20 a 30 minutos, se realizada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar inoculação intrabronquial em bezerros e de como coletar fluido broncoalveolar, escovados brônquicos e biópsias pulmonares transbrônquicas no animal anestesiado.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós descrevemos uma técnica de pesquisa para fibrobroncoscopia e lavado bronco-alveolar utilizando baixa pressão de sucção. A técnica é utilizada para colher células do sistema imunológico das superfícies broncoalveolar de pulmão. A anestesia local e sedação consciente leve (midazolam) é usado. Assuntos toleram bem o procedimento e experimentar efeitos colaterais mínimos.

Lavagem Broncoalveolar (BAL) de Investigação; Obtenção adequada Rendimento Amostra

Este vídeo descreve uma abordagem intrabrônquica para administrar um agente experimental seletivamente nos pulmões distal direito e esquerdo. No protocolo apresentado, administraremos bleomicina intrabrônquica em um camundongo para obter um melhor modelo de fibrose pulmonar.

Entrega intrabrônquica: uma técnica para administrar um agente experimental seletivamente em um pulmão de camundongo

Neste vídeo, descrevemos um procedimento cirúrgico para extrair tecidos bronquiolares de um pulmão de porco colhido. O tecido bronquiolar ex vivo pode ser usado para desenvolver modelos de infecção para o estudo de infecções pulmonares crônicas.

Extração de tecido bronquiolar de porco: um procedimento para dissecar seções de tecido bronquiolar de pulmões suínos

Este vídeo demonstra o estabelecimento de infecção pulmonar em um modelo de roedor imunocompetente por meio de intubação e instalação de suspensões bacterianas nos lobos pulmonares. Este modelo permite estudos de eficácia antibacteriana em animais imunocompetentes.

Instilação Intrabrônquica de Streptococcus pneumoniae em Modelos de Roedores Imunocompetentes

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O estado de saúde do pulmão é refletido pelo tipo e número de células imunes que estão presentes nos bronquíolos do pulmão. Descrevemos uma técnica de lavagem broncoalveolar que permite o isolamento e estudo de células não aderentes e fatores solúveis do trato respiratório inferior de camundongos.

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A administração intratraqueal (TI) de agentes experimentais em camundongos geralmente resulta em parto assimétrico para os pulmões distais.  Neste relatório, nós descrevemos uma aproximação intrabronchial direta (IB) para canular cada pulmão em ratos vivos não-operatively.  Essa abordagem pode ser usada para administrar seletivamente agentes a um pulmão ou pode ser adaptada para melhorar a entrega do agente simétrico para ambos os pulmões.

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A bateria de testes (IMAP) para a realização de uma avaliação aprofundada das capacidades cognitivas auditivas e contribuindo para a capacidade de ouvir é descrito. É rápido para administrar, criança-amigável e livre de confunde linguística. Geração de estímulo e gerenciamento de protocolos são controlados através de uma plataforma de software (IHR-STAR) para garantir procedimentos replicáveis.

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Método de Isolado<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão pulmonar em um modelo de rato: Lições aprendidas com o desenvolvimento de um Programa PPEV Rat

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