O pulmão bovino em Investigação Biomédica: visualmente guiada Broncoscopia, intrabrônquico Inoculação e

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar as interações entre hospedeiro e patógeno em um modelo bovino de infecção respiratória. Isso é alcançado induzindo uma infecção respiratória em bezerros por inoculação intra-brônquica com o patógeno de interesse durante o curso da doença. O animal é amostrado repetidamente por lavagem broncoalveolar.

A seguir, escovados brônquicos e biópsias pulmonares transbrônquicas são obtidos para recuperar células epiteliais e amostras de tecido alveolar ou pulmonar, respectivamente. Em última análise, pode-se confirmar doenças respiratórias específicas do agente patogênico, por exemplo, por meio de alterações inflamatórias no lavado, citologia e detecção imuno-histoquímica do patógeno. Nas biópsias pulmonares transbrônquicas está a principal vantagem deste modelo de grande animal em comparação com outros modelos animais existentes e roedores, que é a possibilidade de estudar a evolução da doença ao longo de um longo período de tempo no mesmo indivíduo por meio de amostragens repetidas.

Embora este método possa fornecer informações sobre as interações entre hospedeiro e patógeno in vivo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como patógenos alternativos ou espécies hospedeiras. A manutenção da anestesia e a assistência na coleta de amostras serão realizadas por uma pesquisadora, que é veterinária do nosso laboratório. Antes de iniciar o procedimento, encha três seringas com um, dois e cinco mililitros do inóculo.

Em seguida, após a confirmação da anestesia, puxe a língua do animal e estique o pescoço. A seguir, usando movimentos leves de rotação, coloque um espéculo metálico na boca do bezerro. Empurre o espéculo para frente sob controle visual, utilizando uma lanterna para determinar quando a laringe se tornar visível.

Em seguida, insira um tubo de teflon no canal operativo de um endoscópio. O tubo não deve protrudir da ponta do endoscópio. Insira o endoscópio através do espéculo.

Pode ser necessário realizar pequenos ajustes no espéculo para permitir a passagem do endoscópio. Para ultrapassar a laringe, utilize o brônquio traqueal, que se ramifica para o lado direito do pulmão, a fim de ajudar a alinhar a imagem no monitor. Em seguida, conecte a seringa contendo cinco mililitros de inóculo à extremidade do tubo de teflon.

Navegue pelo tubo até os ramos onde o inóculo será depositado e administre a quantidade apropriada de inóculo. Em seguida, conecte a seringa contendo um mililitro de inóculo ao tubo. Navegue até o brônquio traqueal e deposite o inóculo no ramo coddle.

Remova o endoscópio e o espéculo. Em seguida, acople a última seringa a um atuador e pulverize um mililitro do inóculo em cada narina. Coloque o animal de volta em sua baia na posição prona para despertar.

O estábulo de recuperação deve ser climatizado. Como a capacidade do animal de termorregulação está reduzida sob anestesia geral, aqueça cinco seringas, cada uma contendo 20 mililitros de solução salina estéril isotônica, em banho-maria a 38 graus Celsius, para coletar amostras valvares no momento desejado. Em seguida, insira um cateter de lavagem no canal de trabalho do endoscópio e introduza o endoscópio no especulo metálico.

Em seguida, avance pelo brônquio principal do pulmão esquerdo até alcançar a posição em cunha, momento em que o endoscópio não pode ser avançado mais. Então, uma a uma, conecte as seringas com a solução morna de cloreto de sódio ao cateter de lavagem para instilar e aspirar diretamente o fluido.

Armazene o fluido de lavagem broncoalveolar em frascos de vidro silanizados sobre gelo imediatamente após a recuperação, para impedir que os macrófagos alveolares adiram à superfície de vidro. Anote tanto a quantidade de salina instilada quanto a quantidade de fluido recuperado. Em seguida, remova o cateter de lavagem do canal de trabalho para coletar as células epiteliais.

Em seguida, direcione o endoscópio até o local desejado para coleta. Por exemplo, neste experimento, até a bifurcação da traqueia; quando o endoscópio estiver posicionado, cubra uma escova brônquica com o tubo e insira-a no canal de trabalho do endoscópio até que a ponta da escova apareça no monitor. Empurre a escova e o tubo plástico cerca de cinco centímetros para frente.

Em seguida, empurre o cabo da escova para retirá-la do tubo plástico. Quando a escova estiver posicionada, conduza-a até o local que deve ser escovado. Então, empurre e puxe suavemente a escova para frente e para trás enquanto conduz o endoscópio.

Para garantir o contato entre a escova e a parede do brônquio, esfregando as células epiteliais. Interrompa a fricção quando ocorrer sangramento. Em seguida, cubra a escova com o tubo e retire-a do canal de trabalho.

Rolando suavemente as cerdas revestidas com células epiteliais sobre até cinco lâminas de microscópio, fixe os esfregaços em metanol frio durante 10 minutos. Em seguida, após permitir que as lâminas sequem ao ar, armazene-as a menos 20 graus Celsius para realizar uma biópsia pulmonar transbrônquica. A seguir, conduza o endoscópio até o local de coleta desejado.

Por exemplo, a pars Alis das LOAs crans conforme neste experimento, antes de inserir a pinça de biópsia no canal de trabalho, abra e feche a pinça algumas vezes para garantir seu funcionamento adequado e, em seguida, empurre a pinça até o ramo coddle da traqueia brônquica até que ocorra uma leve resistência. Agora, recue dois a três centímetros e abra a pinça. Empurre a pinça para frente novamente, cerca de dois centímetros, e então feche-a.

Puxe para trás e remova a pinça do canal de trabalho. Use uma agulha para remover cuidadosamente o tecido da pinça de biópsia e armazene-o em um meio de fixação apropriado para evitar a formação de processos autolíticos. Por fim, após permitir que o bezerro se recupere em seu compartimento, monitore novamente o animal quanto a pneumotórax nas próximas 24 horas, fornecendo alimento e água fresca.

Quando o animal recuperar plenamente a consciência, cortes congelados de biópsias pulmonares transbrônquicas podem ser corados imunohistoquimicamente. Para visualizar o patógeno inoculado, observe as inclusões marrons de clamídia no pulmão deste animal que foi inoculado com clamídia C quatro dias antes da coleta da amostra. A coloração imunohistoquímica das células do lavado permite a visualização de patógenos intracelulares.

Por exemplo, nesta imagem, inclusões clamidiais estão presentes nos macrófagos alveolares coletados de um bezerro. Nove dias após a inoculação intra-brônquica com chlamydia, pode-se observar CTAC. As células do lavado broncoalveolar podem ser diferenciadas por coloração citológica.

Os macrófagos alveolares são o tipo celular predominante no fluido de lavagem. No entanto, o número de granulócitos neutrófilos aumenta na presença de processos inflamatórios. Uma vez dominada, a inoculação pode ser realizada em 10 a 15 minutos e a coleta em 20 a 30 minutos, se realizada corretamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar inoculação intrabronquial em bezerros e de como coletar fluido broncoalveolar, escovados brônquicos e biópsias pulmonares transbrônquicas no animal anestesiado.