Este protocolo descreve a detecção de qPCR de citomegalovírus em tecido de biópsia fixado em formalina e embebido em parafina, que é rápido, sensível, específico e útil para interpretar padrões de coloração ambíguos de hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica.
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Artigo de método
qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded
Neste artigo
Resumo
Resumo
É crucial para identificar a infecção por citomegalovírus (CMV) no trato gastrointestinal (TGI) de pacientes imunossuprimidos, dada a sua maior risco de desenvolver infecção grave. Muitos métodos laboratoriais para a detecção de infecção por CMV têm sido desenvolvidos, incluindo sorologia, a cultura viral, e métodos moleculares. Muitas vezes, esses métodos refletem o acometimento sistêmico com CMV e não identificam especificamente o envolvimento do tecido local. Portanto, a detecção de infecção por CMV no tracto GI é frequentemente feito por histologia tradicional de tecidos de biopsia. Hematoxilina e eosina (H & E) em conjunto com a coloração imuno-histoquímica (IHQ) mantiveram-se os principais pilares de examinar essas biópsias. H & E e IHC, por vezes, resultar em atípicos (ambíguos) padrões de coloração, tornando difícil interpretação. Foi mostrado que a polimerase de reacção em cadeia quantitativa (qPCR) por CMV pode ser realizada com sucesso em, tecidos de biopsia (FFPE) em parafina e fixado em formalina para muitoalta sensibilidade e especificidade. O objetivo deste protocolo é para demonstrar como realizar testes de qPCR para a detecção de CMV no tecido biópsia FFPE em um ambiente de laboratório clínico. Este método é susceptível de ser de grande benefício para o paciente, em caso de coloração equívoca para CMV em biópsias GI.
Introdução
Interpretação da infecção por citomegalovírus (CMV) em amostras clínicas é criticamente importante. O CMV é um membro da subfamília Betaherpesvirinae de herpesvírus. Semelhante a outros vírus de herpes, CMV tem a capacidade de estabelecer infecção persistente ou latente caracterizada por uma falta de replicação viral activa 1. A reativação do vírus pode ocorrer durante momentos de estresse ou outra imunossupressão, levando a replicação viral activa caracterizada pela liberação virion, que pode ser acompanhada de manifestações da doença 2-4. Gastrointestinal (GI) os sintomas da doença CMV freqüentemente incluem dor abdominal e / ou fezes com sang....
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Protocolo
Com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional, foi realizada uma pesquisa no banco de dados do laboratório de eletrônica para identificar fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) blocos que representam casos de infecção pelo citomegalovírus (CMV) em gastrintestinal (GI) biópsias diagnosticados por histopatologia (hematoxilina e eosina (H & E) e / ou imuno-histoquímica (IHQ)).
1. Processamento de tecidos de biopsia de tecido FFPE GI
- Colete FFPE GI blocos de tecido para biópsia citomegalovírus (CMV) polimerase quantitativa reação em cadeia (qPCR). Estes blocos são armazenados à temperatura ambiente.
- Tub....
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Resultados
Um total de 228 blocos de tecido foram testadas por reação de polimerase em cadeia quantitativa (qPCR), que foi composta por 91 citomegalovírus (CMV) casos positivos com base na histologia e imuno-histoquímica positiva (IHC), 18 com equívoco CMV IHC, e 79 controles negativos. Tal como ilustrado na Figura 2, os casos positivos que demonstraram CMV CMV inclusões típicas virais (A) e / ou coloração IHC positivo (B). Casos duvidosos teria demonstrado, não-clássicas surgem p.......
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Discussão
Muitos métodos laboratoriais estão disponíveis para o diagnóstico da infecção pelo citomegalovírus (CMV), incluindo sorologia, cultura viral, ensaios moleculares de viremia, histologia do material da biópsia e, como demonstrado recentemente, ensaios moleculares de, a biópsia fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE) 5,6 tecido. Sorologia, uma vez que um dos pilares do diagnóstico, identifica apenas confiável exposição e não se correlaciona bem com a infecção por CMV aguda 7. A cultura viral,.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Reconhecemos Amy Thomasson por sua assistência com a preparação deste manuscrito, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy por seus esforços na preparação das figuras.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de microfuga de 1,7 ml | Costar | 3620 | |
| Serviços | microscopia eletrônica | 62086-1S | Micro fórceps MF-1 |
| Centrífugas de mesa (microfuga) | Eppendorf | 5424 | |
| Xileno | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 galão |
| de etanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Micrótomo | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Kit de Tecido | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Kit de Suplemento | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler Roche | 75005087 | ||
| LightCycler Bloco de Resfriamento | Roche | ||
| LightCycler Ferramenta de Cobertura | Roche | 3357317 | |
| Kit de Compensação de Cor | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μ l Capilares | Roche | 1 909 339 | |
| Lâminas | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge perfil baixo |
Referências
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day ....
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Reimpressões e permissões
