Triagem de Tecidos e Congelamento de modelos de doença do músculo esquelético

Resumo

A análise dos tecidos musculares esqueléticos para determinar as propriedades estruturais, funcionais e bioquímicas é muito facilitada pela preparação adequada. Este protocolo descreve métodos apropriados para preparar o tecido muscular esquelético para uma ampla gama de estudos de fenotipagem.

Resumo

O músculo esquelético é um tecido único devido à sua estrutura e função, o que requer protocolos específicos para coleta de tecido para se obter os melhores resultados a partir de avaliações funcionais, celulares, moleculares e patológicas. Devido à sutileza de algumas anomalias patológicas observadas em doenças musculares congênitas eo potencial de fixação de interferir com o reconhecimento destas características, a avaliação patológica do músculo congelado é preferível muscular fixo ao avaliar o músculo esquelético para a doença muscular congênita. Além disso, o potencial para a produção de artefatos de congelamento graves no músculo exige precauções específicas quando o congelamento do músculo esquelético para exame histológico que não são comumente usados ​​quando o congelamento outros tecidos. Este manuscrito descreve um protocolo de congelação rápida do músculo esquelético usando isopentano (2-metilbutano), arrefecido com azoto líquido para preservar a morfologia óptima músculo esquelético. Este processo também é eficaz para freezing tecido destina-se a estudos de expressão genética ou de proteína. Além disso, integramos nosso protocolo de congelação em um processo mais amplo, que também descreve os métodos preferidos para a triagem de curto prazo de tecido para (1) fibra única estudos funcionais e (2) cultura de células mioblastos, com um foco no esforço mínimo necessário para coletar tecidos e transportá-lo para pesquisa ou laboratórios de referência especializados para concluir estes estudos. No geral, este manuscrito fornece um esboço de como tecido fresco pode ser efetivamente distribuído para uma variedade de estudos fenotípicos e, assim, fornece procedimentos operacionais padronizados (POPs) para estudos patológicos relacionados com a doença muscular congênita.

Introdução

O músculo esquelético é um tecido único devido à sua estrutura e função, o que pode apresentar uma série de desafios na avaliação de sua patologia. Embora seja suficiente, e muitas vezes até ideal, avaliar a maioria dos tecidos após a fixação da formalina e a inclusão de parafina, esse processo leva à produção de artefatos de encolhimento celular que prejudicam a avaliação de fenótipos críticos na doença muscular congênita (incluindo tamanho e forma da miofibra). Além disso, o músculo congelado é necessário ao realizar muitas colorações histoquímicas (incluindo o dinucleotídeo de nicotinamida adenina reduzido (NADH), citocromo oxidase (COX), succinato desidrogenase (SDH), adenosina trifosfatase (ATPase) e colorações Oil Red O) que são essenciais para a detecção de anormalidades patológicas específicas necessárias para diagnosticar uma variedade de miopatias congênitas, miopatias mitocondriais e doenças de armazenamento. Muitos anticorpos e ferramentas moleculares usados para caracterizar a morfologia e função muscular foram, consequentemente, desenvolvidos e otimizados apenas para tecido congelado, o que limita ainda mais a utilidade das preparações de tecido fixo em estudos de biologia do músculo esquelético. Como resultado, tornou-se prática padrão congelar amostras de músculo esquelético para a maioria das indicações clínicas e de pesquisa no campo da doença muscular congênita, apesar dos desafios técnicos que o congelamento apropriado pode representar.

O congelamento do músculo esquelético pode ser tecnicamente desafiador devido à alta probabilidade de formação de cristais de gelo dentro das miofibras quando um protocolo de congelamento inadequado é seguido¹. Na maioria dos casos, os artefatos de congelamento são encontrados quando o teor de água do tecido é muito alto ou quando o processo de congelamento é muito lento. O teor de água do tecido pode ser acidentalmente aumentado por imersão em fluido, como o transporte do músculo em solução salina; ou congelamento pode ser comprometido se o tecido tiver sido totalmente imerso em OCT. Ambos os procedimentos podem levar a artefatos catastróficos de congelamento no tecido muscular. Além disso, vários pequenos erros no processo de congelamento podem causar congelamento lento ou descongelamento acidental de amostras após o congelamento apropriado, e esses problemas podem complicar a avaliação patológica da mesma forma.

À medida que novos modelos e tratamentos para doenças do músculo esquelético são desenvolvidos, será cada vez mais útil usar procedimentos operacionais padrão (SOPs) para avaliar os fenótipos do músculo esquelético e a eficácia do tratamento. Isso é particularmente importante para a avaliação patológica de doenças musculares congênitas, pois o reconhecimento de fenótipos sutis observados em muitos desses distúrbios pode ser prejudicado pela preparação inadequada do tecido. Este relatório representa um esforço de um Consórcio de Doenças Musculares Congênitas para estabelecer um SOP de congelamento do músculo esquelético para o estudo de modelos de doenças musculares congênitas.

O protocolo apresentado aqui descreve uma estratégia usada em nossos laboratórios clínicos e de pesquisa para otimizar a avaliação da patologia muscular congelada, além de ser adequado para uma variedade de estudos genéticos e baseados em proteínas. Estratégias específicas para preparar espécimes de músculo esquelético para microscopia eletrônica também são apresentadas. Além disso, como o teste funcional de fibra única de tecido congelado é possível^2,3, especialistas nessas técnicas forneceram detalhes sobre os protocolos ideais de manuseio de tecidos. Infelizmente, o isolamento de linhagens celulares de mioblastos não pode ser realizado de forma eficaz em tecido pré-congelado, portanto, uma estratégia é apresentada aqui para o armazenamento e transporte de curto prazo de tecido muscular para estabelecimento de cultura de mioblastos em laboratórios externos. No geral, os métodos descritos aqui fornecem diretrizes para o processamento apropriado do tecido muscular para uma variedade de estudos patológicos, funcionais, moleculares e celulares, independentemente das capacidades no local de um determinado laboratório.

Protocolo

Rotular os recipientes a serem utilizados para o armazenamento de músculo com identificadores apropriados para o animal e colhido do músculo. Pré-resfriar os sacos / recipientes e instrumentos para prevenir congelamento / descongelamento do tecido quando ele é adicionado.

1. Considerações Estudo de design para a Coleta de tecido muscular

1. Para as pequenas modelos animais (murina) de doença muscular, use um músculo inteiro para o estudo desde pequenos modelos animais muitas vezes exigem avaliação de um músculo inteiro para proporcionar amostragem myofiber suficiente para estudos patológicos. Para grandes modelos animais (caninos) de doença muscular, usar porções musculares que são pelo menos 0,3 x 0,3 cm ou mais na sua transversal (transversal) aspecto.
   NOTA: biópsias núcleo também pode ser usado, mas podem ser sub-óptima em estudos de caracterização primárias devido a problemas de amostragem.
2. Para estudos envolvendo sarcómero, a medição do comprimento ultraestrutural sarcómero pode compreender um parâmetro crítico e pode requira especializada manuseio. Isso geralmente só é relevante em doenças onde elementos dos comprimentos inadequados sarcômero mostra, como em algumas causas de nemalínica miopatia. Alguns laboratórios preferir corrigir o músculo em seu estado não-contratado ou esticado, ao invés de executar essas medidas no músculo não-tensionadas ou não esticado.
   1. Se o comprimento do sarcômero não serão medidos, fixar o tecido muscular, sem pré-alongamento do músculo, colocando-o diretamente para o fixador EM desejado (ver Reagentes).
   2. Se comprimentos de sarcômero será medido, pode ser usado várias técnicas para pré-estiramento no músculo (ver discussão):
      1. Usar um dispositivo de aperto para segurar o músculo na sua tensão de repouso enquanto ela ainda está no animal, excisar o músculo à volta do exterior do grampo, e colocá-la directamente para o fixador EM desejada (ver Reagentes).
      2. Esticar e fixar o músculo a uma superfície (tal como um pedaço de cortiça) com um comprimento semelhante ao observado in vivo após ter sido extraído a partir do animal.

2. Sub-dividir o Músculo Esquelético isolada em fragmentos que são apropriados para os Estudos desejado (Figura 1)

1. Para histologia muscular congelados:
   1. Inclua o máximo de um determinado músculo quanto possível para minimizar o viés de amostragem (veja o passo 1.1), mas os espécimes devem ser <1,5 centímetros para evitar o congelamento artefatos.
   2. Tratar todos os músculos do mesmo estudo semelhante para evitar diferenças artefatuais no tamanho das fibras devido a diferenças no manuseamento.
2. Para a microscopia eletrônica (EM):
   1. Cortar uma ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 centímetros da faixa de músculo a partir da amostra, com o eixo longitudinal da amostra paralela ao eixo longitudinal do músculo inicial.
      NOTA: O fixador não penetram adequadamente pedaços mais grossos do tecido, mantendo assim a espessura da amostra ou menos 2 milímetros é crucial para a obtenção de resultados adequados. Adicionalmente,como orientação de tais pequenos fragmentos de músculo é muitas vezes difícil, é aconselhável a utilização de um fragmento de tecido que imita a orientação real do músculo (por exemplo, o aspecto mais longo da amostra é fixa a orientação longitudinal do músculo / miofibras) para minimizar o manuseio e confusão durante o processamento de EM.
3. Para a cultura de células:
   1. O rendimento das células desejado pode afetar a quantidade de músculo necessária para estabelecimento de cultura celular. Músculos individuais (ou porções de músculos) de pequenos animais pode fornecer o número de células suficientes para estabelecer culturas de células, de modo que, se necessário, o tecido piscina de vários músculos.

3. Fixação do tecido e Processamento de Microscopia Eletrônica (EM)

1. Coloque um pedaço de músculo não superior a 2 mm na sua dimensão mais fina diretamente para o fixador EM desejado (ver Reagentes).
2. Coloque o músculo em tampão fixador EM (ver Reagentes) após 2-48 horas de FIXAÇÃOna. Fixação prolongada (semanas ou meses) pode resultar na perda de pormenor ultra-estrutural em estudos de EM.
3. Enviar para uma instalação de núcleo EM para processamento.

4. Congelamento músculo por histológica, bioquímica e estudos moleculares

1. Remover a humidade excessiva na amostra por blotting cuidadosamente a amostra com uma toalha de papel até que o tecido é ligeiramente aderente à toalha. A umidade excessiva irá produzir artefatos de congelamento significativas no músculo.
   NOTA: Os tecidos podem ser mais secos por implantá-la em pó de bebê. Este passo não é geralmente necessário para os músculos a menos que tenham sido em um ambiente excessivamente úmido.
2. Coloque outubro (ou um adesivo semelhante, tal como goma de tragacanto) no fundo de um cryomold superficial ou em cortiça, com apenas o suficiente OCT para fornecer uma base para o músculo orientada (Figura 2C). Rotular a cortiça ou cryomold antes de congelamento pode ser útil para o rastreamento de amostras.
3. Carefully colocar o músculo no molde na orientação desejada, com a maior parte do músculo que se projeta da outubro de modo a que o músculo em corte não está em contacto com outubro (Figura 2C).
4. Adicionar isopentano a uma taça de metal, até atingir uma profundidade de cerca de 3-4 cm.
5. Coloque luvas de segurança térmica e retire a tampa de Dewar.
6. Coloque ou segurar o copo de metal em contacto com o azoto líquido, de modo que o nível de azoto líquido sobre o exterior do copo está acima do nível do isopentano no interior do copo. Estratégias para arranjar esses recipientes são mostrados na Figura 2.
   1. Não permita que o nitrogênio líquido para entrar no copo de metal, uma vez que produz uma espuma borbulhante que pode ser complicado para trabalhar com (e também não é suficientemente fria para congelamento).
7. Observar o isopentano para determinar quando se atingiu a temperatura adequada. À temperatura apropriada (optimamente entre -140 a -149 ° C), de modotampa seixos brancos de isopentano congelado irá formar (depois de alguns minutos, e depois o nevoeiro inicial desapareceu acima do isopentano) no fundo do copo, ou a solução terá geralmente mais espesso para a consistência de melaço. Congelamento antes desta fase irá produzir atifacts congelamento.
   1. Se o isopentano completamente congela, descongelar e chill-lo a temperaturas de congelamento novamente antes do uso subseqüente.
8. Utilizando uma pinça pré-refrigerados, abaixe o espécime e cortiça / molde para o isopentano por cerca de 10-20 segundos.
9. Coloque a amostra congelada em um recipiente pré-resfriada.
10. Mantenha a amostra e o recipiente em gelo seco em todos os momentos até à transferência para um congelador a -80 ° C.

5. Se Artefato congelamento está presente no tecido já congelados, é possível melhorar o grau de Artefato congelamento usando o seguinte "Thaw e recongelar" Procedimento

1. Tome blocos fora do freezer, um de cada vez, E mantê-los em gelo seco. O timing deste protocolo é fundamental. Só descongelar e voltar a congelar um bloco de cada vez.
2. Mova amostra de gelo seco para RT.
3. Se a amostra foi incorporada em outubro, retire a outubro circundante tão completamente quanto possível, utilizando um bisturi.
4. Deixar a amostra a descongelar à temperatura ambiente até ao ponto em que ele é completamente descongelado, mas não até ao ponto em que está a secar para fora.
   1. Prod suavemente a amostra com uma pinça para garantir que a amostra é totalmente descongelada antes de avançar para o passo seguinte.
5. Congelar o músculo, como especificado em passos 4,1-4,10.

6. Preparação de músculo por painel simples Fibra Testes Funcionais

1. O processo de armazenamento para o músculo depende de quando o músculo / fibra está a ser utilizado para as experiências.
   1. Para uso dentro de algumas semanas, coloque o músculo em uma solução de 50% glycerol/50% solução relaxante (ver Reagentes), e armazenar a -20 ° C.
   2. Para utilização réer algumas semanas, colocar o músculo em uma solução de 75% glycerol/25% solução repouso (ver Reagentes), e armazenar a -80 ° C.
   3. Alternativamente, deixe muscular seca, pinos para cortiça, e armazenar em grânulos de sílica a -80 ° C. Estes músculos desidratado pode ser utilizado durante anos.

7. Preparação de músculo fresco para a expedição de Cultura de Células para laboratórios externos

Protocolos para o estabelecimento de culturas de células têm sido bem descritos em outra parte ^4-7.

1. Encha um tubo de 50 ml estéril com meio de cultura completo estéril.
2. Adicione o tecido muscular para o tubo usando uma pinça estéril, completamente submergindo o tecido na mídia.
   1. Encher o restante do tubo com os meios para evitar a secagem durante a expedição.
3. Adicionar blocos de gelo para a caixa de isopor e coloque o tubo cônico perto de vários blocos de gelo.
   1. Por favor, note que apenas blocos de gelo (e não gelo seco) deve ser utilizadopara evitar danos de congelação do líquido e do tecido.
4. Pacotes de navio S / N, mas os tecidos podem duração de 2 dias, sob estas condições.

Resultados

Para dar exemplos dos artefatos visto com o congelamento imprópria, vários músculos do quadríceps rato foram congelados utilizando diferentes técnicas (Figura 3) para replicar os erros comumente encontrados. Como mostrado na Figura 3A, o músculo esquelético adequadamente congelada mostra uma aposição apertada de miofibras que o tecido circundante (normalmente outras fibras musculares, mas, por vezes, o espaço entre endomisial miofibras é preenchido com fibrose ou células inflamatórias numa variedade de doenças ou processos de lesão) e um compartimento citoplasmático claramente visível. Para a análise patológica, a capacidade de visualizar o espaço intracelular é muitas vezes mais importante do que o compartimento endomísio, como é normalmente crítico para identificar claramente a presença de alterações degenerativas, alterações regenerativas, ou outros achados patognomônicos (núcleos centrais, inclusões intracelulares) neste espaço. Assim, a presença de cristais de gelo no compartimento intracelular representa amproblema ajor na avaliação patológica do músculo.

Congelação adequada do tecido muscular requer ambas as temperaturas suficientemente frias e uma velocidade suficiente de congelação para evitar a formação de cristais de gelo. Mesmo quando respondendo por ambos os fatores, considerável artefato congelamento ainda pode ocorrer devido a umidade excessiva dentro do tecido muscular. Este problema é mais comumente encontrado no tecido muscular que tinha sido previamente imersos em solução salina e insuficientemente secas ou quando o músculo está em contato direto com outubro meios de montagem no local de corte (Figura 3B, 3E). Enquanto algum contato com outubro é geralmente inevitável, como consequência do processo de montagem, devem ser feitos todos os esforços para evitar o contato entre as áreas que serão avaliadas histologicamente e os PTU utilizados para a montagem. Em contraste, as amostras congeladas utilizando um congelador a -80 ° C (Figura 3C) e do azoto líquido (Figura 3D) fornecer exemplos de artefacto de congelação que é produzido pela temperatura sub-óptima ou a velocidade de congelação. O processo de congelação lenta encontrado colocando o tecido em um congelador a -80 ° C fornece um exemplo extremo de congelamento artefato. Quando utilizando azoto líquido, o principal problema é que o contacto entre o azoto líquido e o tecido provoca uma bainha de azoto gasoso para formar na interface tecido-líquido, e esta interface gasosa não é suficientemente frio para produzir músculo rápido congelamento ^1. Isto pode produzir artefato congelação significativa perto da superfície da amostra, mas as áreas internas do espécime são mais propensos a piscar por congelação a uma taxa adequada e pode ser totalmente poupada de congelação artefato. Enquanto a simples imersão do tecido muscular em nitrogênio líquido está longe de ser tão útil quanto o processo de congelamento isopentano, ele pode ser útil para o congelamento de grandes espécimes musculares em situações onde isopentano não está disponível (tais como amostras de autópsia clínicos em instituições comlaboratórios de patologia muscular clínicos fora). Resultados usando esta estratégia são geralmente melhor quando se utiliza grandes porções de tecido (> 2 cm de várias dimensões).

Enquanto a evitar artefato congelamento proporciona óptimos resultados histológicos, a técnica também tem sido desenvolvido (e aqui descrito) que substancialmente inverte congelação artefactos para permitir a avaliação de tecido congelado de forma inadequada. Tecido que está indevidamente congelado (Figura 3E) pode ser descongelada e recongelada sob condições rigorosamente controladas (Figura 3F) para permitir que a redistribuição de água no interior das fibras, e o grau de preservação morfológica que é obtido pode ser excelente. Na nossa experiência, este processo preserva a morfologia intracelular do tecido de uma forma notável, mas, muitas vezes produz um artefacto de separação das fibras no interior do espaço endomisial. Como muitos pontos de extremidade patológicas são encontrados no espaço intracelular e aqueles emo espaço endomisial é melhor visualizada através de colorações especiais (tanto para destacar fibrose ou para identificar outros tipos de células), essas mudanças de artefatos não são susceptíveis de prejudicar verdadeiramente a avaliação patológica do músculo.

Figura 1. Triagem de tecidos para estudos estruturais, funcionais e celulares do músculo esquelético. Dependendo dos tipos de estudos desejados, o tecido do músculo esquelético recolhido pode ser processada numa variedade de maneiras para obter os melhores resultados. Os protocolos descritos neste documento descreve métodos para triagem ou processamento de amostras de músculo esquelético para estudos fora do local para otimizar os resultados que podem ser obtidos a partir de instalações de centrais de especialistas.

Figura 2. Exemplos de aparelhos utilizados para o congelamento do músculo. Tal como descrito no protocolo de congelação óptima muscular requer a imersão do tecido muscular em isopentano que é a sua temperatura de congelação. Um meio seguro e eficiente de obtenção de isopentano arrefecido em gelo envolve o uso de um recipiente metálico para o isopentano que é arrefecida num Dewar contendo azoto líquido circundante. Como muitas vezes é conveniente ter ambas as mãos livres, é possível a utilização de uma cinta, tal como um anel de suporte (A) para segurar o recipiente isopentano no azoto líquido, evitando-se a mistura dos dois líquidos. Alternativamente, o recipiente também pode ser realizada no nitrogênio líquido manualmente (B). Em ambos os casos, o tecido não deve ser colocado no isopentano até o isopentano é visivelmente congelação na parte inferior do recipiente (normalmente como seixos brancos opacos), e em seguida, deve ser imersa durante 10-20 segundos para permitir que o congelamento completo. Isopentane à temperatura de congelamento produz mínimo "nevoeiro", (ou seja, a temperatura é insuficiente se considerável nevoeiro está presente). Uma vez que o tecido é congelado, coloque-o diretamente em recipientes pré-refrigerado (e, em seguida, diretamente em um refrigerador ou no freezer) para evitar o descongelamento acidental após o congelamento. Músculo congelado (C) apropriadamente montada deve ter a maior parte do tecido muscular que sobressai a partir de uma base de gelado outubro

Figura 3. Exemplos de congelação artefacto, e eficaz de descongelação / recongelação. Imagens representativas de (A), apropriadamente de isopentano músculo congelado, (B), apropriadamente músculo congelado em isopentano, mas ao mesmo tempo em contacto com o meio de montagem outubro, (C) músculo congelado em um congelador a -80 ° C, e (D ) músculo congelado em azoto líquido, os quais exibem diferentes graus de congelação artefato. Como mostrado em (B), o alto teor líquido de outubro produz artefato congelamento significativo no músculo que está em contato com ele, portanto, apenas a quantidade mínima de outubro necessário para a montagem deve ser usado, eo músculo para avaliação histológica deve ser "em pé out "de sua superfície. A lentidão do processo de congelamento, utilizando um (C) -80 ° C congelador ou (D) de azoto líquido (em relação à velocidade de congelação em gelo isopentano frio) podem conduzir à produção do produto manufacturado congelação significativa. Painéis E e F mostram o músculo do mesmo espécime que era (E) inicialmente subótimamente congelado (devido ao contacto excessivo com OCT) e (F) descongelado e novamente congelado usando a técnica aqui descrita. Embora se possa observar uma certa separação entre artifactual fibras na amostra refrozen, o i melhorian morfologia intracelular das fibras musculares é facilmente perceptível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O músculo esquelético é um tecido estrutural e funcionalmente única, e os procedimentos de preparação especializadas são necessárias para permitir a avaliação ótima de parâmetros estruturais e funcionais. Enquanto uma variedade de tecidos são normalmente congeladas para estudos patológicos em contextos clínicos e de pesquisa, os protocolos de congelação para não-tecidos musculares usualmente envolvem a imersão total do tecido em OCT, antes da congelação. Como mostrado na Figura 3, um tal protocolo é inadequado para a avaliação patológica do músculo esquelético e no entanto é bastante parecido com o protocolo descrito aqui que este é um erro normalmente encontrado. O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo simples para o tratamento adequado da musculatura para evitar problemas como este. Conselho também foi compilado no tratamento adequado dos músculos para fora do local fisiológico e estudos celulares, em um esforço para facilitar a aquisição de dados de alta qualidade pelos laboratórios centrais de fora em casos where estudos no local não são preferíveis ou possível.

Conforme observado neste protocolo, elementos que são absolutamente essencial no processamento adequado do músculo para estudos patológicos incluem minimizar o conteúdo de água do tecido, diminuindo a temperatura a que o músculo está congelado, e aumentando a velocidade a que é atingido o congelamento. A umidade excessiva dentro do tecido ou lentidão excessiva do processo de congelamento (produzido por temperaturas insuficientes ou pela falta de contato direto entre o agente de congelamento e do tecido, como é encontrado com nitrogênio líquido) vai levar a congelamento artefatos que podem prejudicar a análise patológica. Como outubro fornece uma fonte adicional de humidade nos tecidos, muitos laboratórios usam outros adesivos como goma tragacanth como substrato incorporação. Mesmo nos casos em que o congelamento é realizado de forma adequada, cuidados devem ser tomados para evitar posteriormente descongelar acidentalmente espécimes através do contato com recipientes ou instrumentos RT.Assim, um processo de congelação bem sucedida requer um grau de planeamento, que inclui um pré-refrigeração de todos os instrumentos e os recipientes a ser usados. Quando artefactos de congelamento são encontrados, existe um método aqui descrito, para a recuperação do tecido que é suficiente para a maioria das avaliações patológicas. No entanto, este ciclo de congelamento / descongelamento não oferece histologia perfeito e tem o potencial de prejudicar a outros estudos moleculares ou enzimáticas do tecido (para além do tempo necessário para voltar a congelar o tecido), de modo usando práticas apropriadas de congelamento inicial é muito preferível . Nos casos em que o congelamento artefacto é encontrado no tecido pré-congelado, no entanto, a técnica aqui descrita pode ser extremamente útil.

Fixação e processamento de tecido para EM podem oferecer desafios técnicos específicos que exigem planejamento antes da coleta do tecido. O erro mais comum ao coletar espécimes para EM envolve o uso de fragmentos de tecidos que são muito espessas para glutaraldehyde para penetrar. Como glutaraldeído só penetra aproximadamente 0,1 cm no tecido muscular de uma superfície dada, cuidados devem ser tomados para garantir que uma das dimensões das amostras de EM não é mais espessa do que 0,2 cm. Além disso, como o EM é um excelente meio de avaliar diretamente o aparelho contrátil, alguns pesquisadores têm desenvolvido estratégias de pré-tensão ou pré-estiramento no músculo antes da fixação para permitir a medição de elementos contráteis a uma tensão fisiologicamente relevante. Não existe um protocolo padrão para o pré-tensionamento, mas duas estratégias são descritas resumidamente neste protocolo. Deve notar-se que as tentativas de pré-tensionamento do músculo pode produzir resultados imprevisíveis a menos que sejam feitas de uma forma muito específica, e que pode ser preferível fixar os músculos no estado de folga para evitar alterações de comprimento artefatuais sarcómero por meio de um não-padrão procedimento de pré-tensionamento ^8,9. Para os músculos em que tais medidas específicas não são necessárias (incluindo mais biopsies realizadas para fins clínicos), os esforços de pré-tensão do músculo em geral, não são feitas, e o principal efeito sobre a morfologia do músculo é um espaçamento não uniforme das sarcomeres no músculo.

Este trabalho representa o primeiro de uma série para fornecer SOPs para a realização de ensaios de campo doença muscular congênita, e representa os esforços de mais de 20 especialistas na área doença congênita do músculo que rotineiramente celular, molecular e funcional, fisiológico e investigação patológica. Uma gama de SOPs publicados serão disponibilizados ao longo do ano que vem, e os protocolos necessários e formatos de publicação apropriadas para cada foram discutidos em uma Muscle Congênita Doenças Consórcio Oficina realizada em abril de 2013, em Washington DC O objetivo deste esforço SOP é fornecer um roteiro para os testes necessários e análise de amostras no campo congênita doença muscular a 1) padronizar as práticas e os terminais utilizados em nosso campo como muito possível, e 2) fornecer instruções sobre as práticas padrão para novos pesquisadores em nosso campo. Acreditamos que esses recursos vão facilitar a entrada de novos pesquisadores em nosso campo de sub-estudado e, assim, melhorar o âmbito da investigação que podem ser executadas. Além disso, a padronização das práticas será extremamente útil para comparar os dados entre os estudos e identificar os pontos de extremidade quando o planejamento e realização de ensaios pré-clínicos e clínicos.

Embora o foco principal deste artigo está relacionado ao congelamento e preparo de tecido apropriado para uma variedade de estudos, o nosso grupo colaborativo também discutiu os parâmetros úteis para a análise patológica de amostras musculares. No momento, não há consenso oficial sobre a abordagem a tomar quando se realiza a análise patológica, e uma variedade de diferentes estudos são realizados para relacionar as novas descobertas de publicações anteriores para cada uma das doenças visadas. Assim, pensamos que seria útil parapropor algumas diretrizes gerais para o planejamento de endpoints patológicas no músculo patologia caracterização. Antes de quantificar a patologia em um estudo, o pensamento considerável deve ser colocado em 1) o método de medição do tamanho da fibra, 2) a possibilidade de anomalias de fibra de tipo específico, ou os efeitos do tratamento, 3) a possibilidade de anormalidades ou efeitos que são restritos de músculos individuais, e 4) uma estratégia para quantificar alterações patológicas que são característicos para a doença sob estudo. Tamanho da fibra é um ponto final necessário para a maioria dos estudos, e, infelizmente, há extensa variação na forma como é quantificado. Muitos estudos relatam esses resultados usando métodos de quantificação automatizados fornecidos pelo software de imagem proprietário, mas muitos desses programas tomar atalhos (como assumindo que as fibras são círculos ou elipses) que podem tornar essas medições automatizadas impreciso. É necessário entender como esses programas automatizados fazer suas medições bntes de ter confiança nas medidas, e nós encorajamos os investigadores para incluir esses detalhes nos métodos de papel. Além disso, a medida específica usada para indicar o tamanho da fibra é extremamente variável, e algumas medições são preferíveis a outros ^10,11. Uma medida comumente utilizada de tamanho da fibra é a área da seção transversal da fibra (CSA), principalmente porque os investigadores realizam estudos fisiológicos padronizar os resultados das medições CSA obtidos utilizando os seus instrumentos. Infelizmente, enquanto que as medições de CSA pode reflectir com precisão o tamanho da fibra, em secções transversais perfeitos, eles são largamente dependente da orientação da fibra (na medida em que as fibras longitudinais ou obliquamente seccionados terá medições CSA artificialmente altos) e são, assim, as medições não ideais para o tamanho da fibra. A medição do tamanho preferível de fibra que é menos dependente de fibra de área de secção transversal é o diâmetro de Feret mínimo (diâmetro MinFeret), que é a medida de the diâmetro menor na célula muscular ^12. Esta medida é apenas um pouco dependente de orientação das fibras e geralmente é o padrão-ouro para a medida clínica da fibra, e os investigadores são encorajados a se mover para o uso desta técnica. Estas medições podem frequentemente ser feitos usando o mesmo software que gera medições CSA ^13, e também são fáceis de medir manualmente. Com relação à avaliação dos dados patológicos de acordo com o tipo de fibra, músculo específico, e no contexto de achados patológicos relacionados com a doença específica, estas são questões menos controversas que devem apenas ser considerados durante o planejamento de um estudo. O tipo de fibra pode ser avaliada usando coloração imuno-histoquímica ou ATPase, mas é útil considerar que os músculos específicos e espécies animais têm misturas específicas desses tipos de fibras (necessitando, assim, expectativas diferentes e testar estratégias). Envolvimento patológico específico muscular ou a eficácia do tratamentopodem ocorrer, e peso do músculo do total em comparação com os controlos podem ser utilizados para identificar o grau de heterogeneidade da doença antes de decidir sobre os músculos para avaliar patologicamente. Finalmente, é bem sabido que muitas doenças musculares estão associadas a anomalias patológicas específicas (tais como barras de nemaline em miopatia nemalínica ^14,15), e por isso também é útil para determinar se estas anormalidades são encontradas num tipo de fibra muscular ou -específica de distribuição ao realizar a análise ^16,17. Em geral, embora nós não propor um conjunto inflexível de normas para a avaliação do músculo, nós acreditamos que estas questões devem ser consideradas antes da realização de estudos patológicos de qualquer doença do músculo esquelético.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Para congelamento de
Dewar de nitrogênio líquido com um dispositivo de retirada de líquidos	Custom Biogenic Systems	Lab-5 Series	Qualquer outro dewar de nitrogênio líquido pode substituir.
Recipiente condutor a frio	Fisher	02-583A
Recipiente isolado largo capaz de conter nitrogênio líquido	Nalgene	4150-2000
Termômetro termopar Oakton Temp 10	Thomas Scientific	1228Y01	Opcional, mas pode ser muito útil para identificar o ponto em que o isopentano está congelando.
			funcionais de fibra única
Placa de Petri	Fisher Scientific	08-757-11
Revestimento Sylgard	Ellsworth Adhesives	3-6636
Estereomicroscópio de dissecção	Aparelho de Harvard	693101	Qualquer outro microscópio de dissecção pode substituir.
Para cultura de
Capa de fluxo laminar estéril	Thermo Scientific	51022485	Qualquer outra capa de cultura de células pode substituir.
Para congelamento de lenços
de papel Sacos de plástico/recipientes	Nasco	B01009WA
Luvas de segurança térmicas	Denville	G4162
Protetor facial	Fisher Scientific	S47640
Fórceps longo	Fisher Scientific	12-460-807
Marcador	Grampos	125328
Para cultura
Tubos cônicos estéreis de 50 ml	Denville	C1060-P
, 500 ml, 0.22 µ m	Denville	F5227
Pinça estéril	Fisher Scientific	644320
Bolsas de gelo	Fisher Scientific	NC9909223
Caixa de isopor isolada	Polar Tech	207F
Fita de embalagem	Grampos	795570
Congelamento
Nitrogênio líquido	Airgas	NI NF160LT350	Armazene nitrogênio líquido em recipientes projetados para líquidos de baixa temperatura
Isopentano (2-metilbutano)	Sigma	M32631-4L	Armazene Isopentano em um armário de materiais inflamáveis.
Fixador EM (escolha um)			Os tampões sem fixador também devem estar disponíveis, pois os tecidos fixados em EM devem ser transferidos do fixador para o tampão após várias horas ou dias, se não forem processados imediatamente para EM.
2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,1M	Ciências de Microscopia Eletrônica	16537-15
Fixador de Karnovsky (3% de glutaraldeído + 2% de paraformaldeído em tampão de fosfato 0,1M)	Ciências de Microscopia Eletrônica	15732-10
Para estudos funcionais (se desejado)
Solução relaxante, contendo (em mmol / L)
40 BES	Sigma	B9879
10 EGTA	Sigma	E4378
6,56 MgCl2	Sigma	M8266
5.88 Na-ATP	Sigma	A3377
;         1.0	TDT RPI	D11000
46.35 K-propionato			Faça uma solução misturando ácido propriônico (Sigma P1386) e KOH (Fisher P250) 1:1
15 fosfato de creatina, pH 7,0	Sigma	P7936
;         0,4 leupeptina	Calbiochem	10895
0.1 PMSF	Sigma	P7676
Solução de esfolamento, contendo
Solução relaxante (Veja acima)
0,5% Triton X-100	Sigma	T8787
Indicando grânulos
Pedaços planos de cortiça (1 x 1 polegada)	Ciências de Microscopia Eletrônica	63305
Glicerol	Sigma	G2025
Para cultura de células (se desejado)
Meio de Crescimento Completo, contendo (para 500 ml)			Esterilizar filtrando a solução através de um 0,22 µ m Unidade de filtro PES.  Armazene a 4° C e use dentro de 1 mês.
395 ml de glicose elevada Dulbecco» s Águia Modificada' s Medium (DMEM)	Sigma	D5671
100 ml de soro fetal bovino (FBS)	Sigma	F6178
5 ml de Penicilina-Estreptomicina-Glutamina 100X (PSG)	Sigma	G1146
Consulte a ficha de dados de segurança dos materiais (MSDS) para todos os outros reagentes para especificações

tecidosPara testes célulasde células Unidade de filtro PES de tecidosde sílica de armazenamento