O objectivo do protocolo é a utilização de métodos mais eficientes para estimular as vias sensoriais citoplasmáticos de ADN em células e in vivo. Isto é conseguido através da melhoria da geração de ADN de comprimento, de cadeia dupla, durante a ligação das extremidades cegas. As células ou os ratinhos são depois transfectadas utilizando um reagente de transfecção de lípidos.
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Artigo de método
Estimulação da Citoplasmáticas DNA Sensing Pathways
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fim de estimular eficazmente uma resposta imune inata, o DNA tem de ser de comprimento e pureza suficientes. Apresenta-se um método em que o ADN de cadeia dupla (dsDNA), que possui as características necessárias para estimular o ADN citoplasmática vias sensoriais pode ser gerada de forma barata e com facilidade. Pelo concatemerization de oligonucleótidos curtos, sintéticos (que não têm motivos CpG), dsDNA pode ser gerado para ser de comprimento suficiente para activar a via citosólica detecção de ADN. Este protocolo envolve a ligação de extremidades rombas de oligonucleótidos na presença de polietileno glicol (PEG), que proporciona um ambiente eficaz para a ligação ocorra. Os concatemeros dsDNA pode ser usado, após purificação por extracção com fenol / clorofórmio, para simular a resposta imune inata in vitro por protocolos de transfecção convencionais. Este ADN pode também ser utilizada para estimular a imunidade inata in vivo por injecção intradérmica no pavilhão auricular de um rato, por exemplo. Porpadronizar o processo concatemerization e os protocolos de estimulação posterior, uma activação fiável e reprodutível do sistema imune inato pode ser produzido.
Introdução
DNA é um componente vital de todos os organismos e células eucariontes, que manter em compartimentos específicos. Uma das funções do sistema imune inata é identificar quando tais compartimentalização quebra ou quando o material estranho é introduzido no organismo por meio de uma quebra de barreiras físicas externas. No corpo humano, há um certo número de proteínas que existem para ajudar a degradar pequenas quantidades de ADN, que pode escapar da compartimentação correcta; DNAse I, II, III e quebrar o DNA no plasma, endossoma, e citosol, respectivamente. No entanto, foi demonstrado que ratinhos que carecem de DNAse II morrem de anemia grave causada pela prod....
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Protocolo
1. Concatemerization
- Ressuspender iniciadores Fw e Rv (ver Tabela de Materiais para as sequências de iniciadores) a uma concentração de 10 mg / mL em biologia molecular, grau de H 2 O. Em seguida, misturar 5 ul de Fw e 5 ul de iniciador Rv em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Mistura de iniciadores de recozimento por meio de aquecimento para a temperatura de emparelhamento correcto (75 ° C para os iniciadores aqui descritos) para 15 min. Deixar no banco para esfriar em temperatura ambiente (RT). Prepare o PEG8000 60% durante esta incubação por dissolução em ddH 2 O.
- Adicionar 50 ul de 60% PEG8000 (....
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Resultados
Os resultados abaixo indicam que o DNA concatemerized pode ser gerado com relativa facilidade e é capaz de estimular uma resposta imune inata e robusto nas células em ratinhos. Com o uso de PEG8000, que pode ser claramente visto que o comprimento do ADN a ser gerado é significativamente mais longa e igualmente capazes de induzir a transcrição de CXCL10. Como se pode ver pela análise em gel de agarose, o concatemerization padrão tem comprimentos de ADN de mais de 800 pares de bases (pb), enquanto que para a amostra.......
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Discussão
Os protocolos aqui descritos são utilizados para gerar dsDNA para estimular a resposta imune inata citosólica com resultados reprodutíveis em uma ampla gama de tipos de células e in vivo. Uma vez que o principal reagente de substrato utilizado é um oligonucleótido sintético, não há flexibilidade no presente sistema para a utilização de sequências de ADN alternativos ou modificações químicas. É possível, por exemplo, para substituir a cadeia de oligonucleótido descrito adiante neste protocolo com uma que contém .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores não têm confirmações.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Primário | direto Integrated DNA Technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGA CTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGT CATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Água de grau de biologia molecular | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 polinucleotídeo quinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| Fenol: clorofórmio | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Clorofórmio | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel buffer de carregamento | New England Biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Seringa Hamilton | 80901 Modelo 1705 | ||
| 30 G agulhas | BD Bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III transcriptase reversa | Life Technologies | 56575 | |
| Primeiro tampão de síntese de cDNA de fita | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 primer murino direto | Integrated DNA Technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 primer reverso murino | Integrated DNA Technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 primer murino direto | Integrated DNA Technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 primer murino direto | Tecnologias Integradas de DNA | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
Referências
- Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H., Nagata, S. Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA. Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005).
- Ishikawa, H., Ma, Z., Barber, G. N. STING regulates intracellu....
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Reimpressões e permissões
