Um novo biorreator de pregas vocais capaz de fornecer estimulação vibratória fisiologicamente relevante para células cultivadas é construído e caracterizado. Este dispositivo de cultura dinâmica, quando combinado com um andaime fibroso de poli(ε-caprolactona), cria um ambiente mimético de pregas vocais que modula o comportamento das células-tronco mesenquimais.
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Artigo de método
Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A engenharia in vitro de tecidos mecanicamente ativos requer a apresentação de condições mecânicas fisiologicamente relevantes para células cultivadas. Para emular o ambiente dinâmico das pregas vocais, um novo biorreator de pregas vocais capaz de produzir estímulos vibratórios nas frequências fonatórias fundamentais é construído e caracterizado. O dispositivo é composto por um gerador de funções, um amplificador de potência, um seletor de alto-falantes e câmaras de vibração paralelas. As câmaras de vibração individuais são criadas imprensando uma membrana de silicone feita sob medida entre um par de blocos de acrílico. A membrana de silicone não serve apenas como fundo da câmara, mas também fornece um mecanismo para proteger o andaime carregado de células. Os sinais de vibração, gerados por um alto-falante montado embaixo do bloco de acrílico inferior, são transmitidos para a membrana aerodinamicamente pelo ar oscilante. Oito módulos de vibração idênticos, fixados em duas barras metálicas estacionárias, estão alojados em uma câmara anti-umidade para operação de longo prazo em uma incubadora de cultura de células. As características de vibração do biorreator de pregas vocais são analisadas de forma não destrutiva usando um Vibrômetro Doppler a Laser (LDV). A utilidade do dispositivo de cultura dinâmica é demonstrada pela cultura de construções celulares na presença de vibrações senoidais de 200 Hz com um deslocamento da membrana média de 40 μm. As células-tronco mesenquimais cultivadas no biorreator respondem aos sinais vibratórios alterando a síntese e degradação dos componentes da matriz extracelular relevantes para as pregas vocais. O novo sistema de biorreator aqui apresentado oferece uma excelente plataforma in vitro para o estudo da mecanotransdução induzida por vibração e para a engenharia de tecidos funcionais das pregas vocais.
Introdução
A prega vocal humana, composta por uma camada epitelial, a lâmina própria (LP) eo músculo vocal, é um tecido macio especializado que converte o fluxo de ar dos pulmões para ondas acústicas para a produção de som. 1 As pregas vocais oscilam regularmente durante a fonação normal, exibindo as estirpes de até 30% em frequências fundamentais que variam 100-300 Hz. 2 Adulto vocal dobra LP é uma estrutura composta por um gradiente superficial (SLP), de um intermediário (PLI) e um (DLP) camada profunda. Outros grupos de classificação do epitélio eo SLP como a camada mucosa, e combina o ILP e DLP no ligamento vocal. 3 A camada SLP contém princ....
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Protocolo
1. Assembléia biorreator (Video 1)
- Fazer um molde de alumínio (matriz circular + pino espaçador) com as dimensões interiores e exteriores pré-determinados (Figura 1).
- Usando o molde a partir do passo 1.1, o fabrico de uma membrana de silicone (diâmetro: 42 mm, espessura: 1,5 mm, Figura 1) com uma manga entranhado (diâmetro: 12 mm, espessura de ~ 0,25 mm, em forma de pino do espaçador da Figura 1) em o meio usando um kit de elastómero de silicone disponíveis comercialmente.
- Faça um par de blocos de acrílico (Figura 2 (4, 5)), com uma abertura circular (diâmetro: 24 mm) n....
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Resultados
Os andaimes PCL fabricados por electrospinning conter poros intersticiais porte micro e fibras entrelaçadas de forma aleatória, com um diâmetro médio de 4,7 mM (Figura 4A). Numa ampliação maior, ranhuras em nanoescala e poros são visíveis nas fibras individuais (Figura 4B). Revestimento dos andaimes com fibronectina melhora hidrofilicidade e facilita a adesão celular inicial / espalhando no cadafalso PCL (observação não publicada).
Formas de onda sinusoidal .......
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Discussão
Engenharia de sucesso dos tecidos das pregas vocais funcionais in vitro requer a recriação de um microambiente-como prega vocal para mediar os comportamentos de células multipotentes. É geralmente aceite que o tecido ou órgão estruturas refletem as funções que são necessários para realizar. 22 para os tecidos das pregas vocais, as vibrações de alta frequência que ocorrem durante a fonação são propostas a ser importante para a maturação do tecido. Em nosso estudo, andaimes PCL são usados para fornec.......
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Divulgações
Não existem interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Jeffrey Caplan para a sua formação e assessoria em imagem confocal. Agradecemos também o Keck Laboratório de Microscopia Eletrônica e Dr. Chaoying Ni de assistência SEM. Este trabalho é financiado pelo National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 e R01DC011377). ABZ reconhece NSF Integrativa Pós-Graduação e Pesquisa Estágio programa (IGERT) para financiamento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de elastômero de silicone | Dow Corning | Sylgard 184 | Cure a membrana a 100 ° C para 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~ 80 kDa, dissolver O / N |
| Clorofórmio | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| MSCs derivadas da medula óssea humana | Lonza | PT-2501 | Recebido com passagem 2 |
| meios de manutenção MSC | Lonza | PT-3001 | 10% FBS em meio basal suplementado com L-glutamina, gentamicina e anfotericina |
| Reagente de dissociação celular Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Etanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fibronectina | Sigma | Aldrich F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R & D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| Iodeto de propídio | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | reversa QuantiTect da Life Technologies | S7575 | |
| Qiagen | 205311 | ||
| SYBR Green PCR master mix | de substituição 4309155 | Life Technologies | |
| DAYTON audio (via Parts Express) | DS90-8 | Cone de papel, gama completa (80-13,000 Hz), 85 dB | |
| Ergo Micro chave de fenda de torque Mountz | # 020377 | Faixa de torque: 20-120 cN· m | |
| Seletor de alto-falante estéreo | RadioShack | 40-244 | Potência máxima de manuseio 50 W |
| Gerador de funções | A Agilent | 33220A | Faixa de frequência 1 e micro; Amplificador de potência Hz-20 MHz |
| Áudio PYLE | PylePro PT2400 | Resposta de frequência: 10 Hz-50 kHz, dois canais de alto-falante | |
| Incubadora de cultura de células | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| NE-300 | New Era Pump Systems | ||
| Spellman | CZE 1000R | Tensão de saída: 0-30 kV | |
| Microscópio eletrônico de varredura | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| Revestidor de Mesa Gold Sputter | Aspirador Denton | DSK00V-0013 | |
| Vibrômetro Doppler laser | Polytec | PDV-100 | Medição de velocidade sem contato (0-22 kHz) |
| Sistema de detecção de sequência PCR | Microscópio | multifotônico ABI7300 | |
| Espectrofotômetro Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | ||
| UV-VIS | Produtos NanoDrop via Thermo Scientific | ND-2000 | |
| VibSoft Software de Aquisição de Dados | Polytec | Largura de banda de aquisição de até 40 MHz | |
| Software de análise de dados Origin 8.5 | qPCR OriginLab | ||
| qbasePlus | Biogazelle | V2.3 | |
| Liga de alumínio | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| McMaster-Carr | |||
| McMaster-Carr | resistente a impactos Parafusos de policarbonato | ||
| McMaster-Carr | |||
| Cabo/fio | |||
| Tubulação de PVC de grau médico | US Plastic Corp. | Seringa Tygon S-50-HL | Transparente, biocompatível |
| de 10 ml | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G Agulha sem corte | Peças pequenas | NE-213PL-25 | 1-1/2" de comprimento |
| RadioShack | 270-354 | Punção | |
| biópsia de 8 mm | Sklar Instrumentos cirúrgicos | 96-1152 | Punção de biópsia estéril e descartável |
| 12 mm | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| Frascos de cultura de tecidos | Corning | Cultura de células tratada |
Referências
- Titze, I. R. Mechanical-Stress in Phonation. J. Voice. 8, 99-105 (1994).
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D.
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Reimpressões e permissões
