Compensatória Limb Uso e Avaliação Comportamental de Habilidade Aprendizagem Motora Após Lesão Sensorimotor Cortex em um modelo do rato de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico

Resumo

Os modelos de camundongos tornaram-se cada vez mais populares em estudos de neurociência comportamental. À medida que os modelos avançam, é importante desenvolver medidas comportamentais sensíveis específicas para o mouse. Este protocolo descreve a Tarefa de Alcance da Matriz de Massa, que é uma tarefa motora habilidosa para uso em modelos de AVC em camundongos.

Resumo

Modelos de ratos tornaram-se cada vez mais popular na área de neurociência comportamental e, especificamente, em estudos de acidente vascular cerebral experimental. Como modelos de avanço, que é importante para desenvolver medidas comportamentais sensíveis específicos para o rato. O presente protocolo descreve uma tarefa motora hábil para uso em modelos de ratos com AVC. The Matrix Pasta Alcançando funções tarefa como um ensaio comportamental versátil e sensível que permite a pesquisadores para coletar dados de resultados precisos e manipular uso do membro para imitar fenômenos clínicos humanos, incluindo estratégias compensatórias (ou seja, aprendi a não utilização) e focado o treinamento de reabilitação. Quando combinado com ferramentas neuroanatômicos, esta tarefa também permite aos pesquisadores explorar os mecanismos que suportam a recuperação comportamental da função (ou falta dela), após acidente vascular cerebral. A tarefa é simples e acessível para configurar e conduta, que oferece uma variedade de opções de treinamento e teste para inúmeras questões de pesquisa relativas a furesultado nctional após lesão. Embora a tarefa tem sido aplicada aos modelos de rato de acidente vascular cerebral, mas também podem ser benéficos em estudos de resultados funcionais em outros modelos de lesão da extremidade superior.

Introdução

Modelos de ratos tornaram-se cada vez mais popular para a pesquisa do curso experimental, devido em parte à sua conveniência e economia, bem como a disponibilidade de linhas transgénicas que são adequados para imagiologia in vivo, entre outras aplicações. Com este aumento de popularidade em modelos experimentais, o interesse no desenvolvimento de avaliações comportamentais sensíveis do resultado funcional após a lesão também aumentou ^1-7. O desenvolvimento de protocolos de treinamento de animais que imitam tanto reabilitação e estratégias compensatórias usado por sobreviventes de AVC humanos melhora a capacidade de traduzir com sucesso resultados de estudos experimentais em animais para usar na clínica ^8. Treinamento de habilidades motoras na Matriz Pasta Alcançando Task (PMRT) tenha sido previamente estabelecida como uma avaliação de comportamento sensível do resultado de habilidades motoras após insulto isquêmico do córtex sensório-motor ^3.

Um dos interesse primários em curso investigação diz respeito a reabilitação eo desenvolvimento e compreensão de estratégias comportamentais que promovem uma melhor recuperação da função após insulto. Atualmente, as estratégias de reabilitação em humanos resultam em ⁸ incompleta recuperação. Além disso, os terapeutas de reabilitação deve combater estratégias compensatórias que os sobreviventes de AVC desenvolvem durante a recuperação que possam comprometer a sua capacidade de recuperar totalmente a função de seu membro afetado (s). Por exemplo, após um acidente vascular cerebral unilateral que afeta a função da extremidade superior, os seres humanos tendem a desenvolver uma dependência de seu membro inferior afetado ^{9, 10.} Apesar de melhorar a capacidade de uma pessoa para funcionar no curto prazo, este aprendeu a não utilização do membro afetado pode impedir o seu potencial de valorização final, como foi demonstrado em modelos animais ^11-13. Estes resultados obtidos em animais têm ajudado a informar o desenvolvimento e uso de terapia de movimento induzido por restrição em seres humanos ^14. Os modelos animais são beneficiál para melhorar as estratégias de reabilitação, permitindo que os pesquisadores a explorar os mecanismos neurobiológicos que subserve e promover a recuperação da função. Além de ser uma avaliação comportamental eficaz da função pós-acidente vascular cerebral, o PMRT foi estabelecida como uma estratégia de reabilitação eficaz para promover a melhoria do resultado funcional após acidente vascular cerebral sensório-motor ^15. O PMRT também pode ser usado para aprendido a não utilização de forma eficaz mímico do membro afetado e, portanto, oferecem uma visão sobre manipulações comportamentais que podem melhorar a recuperação funcional, apesar de inicial excesso de confiança no membro afetado menos ^13.

Construção do PMRT foi descrito anteriormente ^3. Resumidamente, a câmara de chegar é composto por quatro paredes de acrílico (20 cm de altura, 15 centímetros de comprimento, e 8,5 cm de largura) com uma parte superior aberta e inferior. Existe uma fenda central (13 cm de altura e 5 mm de largura) que se estende desde a base inferior da parede frontal da câmara, que servecomo a abertura atingindo (Figura 1A). A matriz de massa é um bloco de plástico pesado (8,5 cm de comprimento, 5 cm de largura e 1,5 cm de altura) com 1 mm de diâmetro buracos perfurados completamente a profundidade do bloco. Há um total de 260 orifícios, com início 2 mm a partir da janela de alcançar com 2 mm entre cada furo (Figura 1B). A matriz de massas é concebido de tal modo que pedaços de massa seca, orientadas verticalmente estendem-se através de toda a profundidade da fase de matriz com cerca de metade do pedaço de massa exposta. Um pedaço de plástico removível sobrecarga ou cartolina deve ser cortado à medida e gravado de forma segura para o lado de baixo da matriz. Isso evita que as peças de massa de cair para fora da matriz durante o transporte e permite a fácil remoção de pedaços de massa quebrados.

O PMRT é um ensaio comportamental versátil e sensível que permite a pesquisadores para coletar dados de resultados precisos e manipular uso do membro para imitar fenômenos clínicos. Como o comportamentoESULTADOS medida, o PMRT permite que pesquisadores para coletar dados de comportamento que reflete com mais precisão a eficácia de uma estratégia de reabilitação do que a medida tradicional de tamanho do infarto ^{3, 16.} Como manipulação comportamental, a PMRT permite experimentadores para controlar o uso dos membros superiores em ratos em Para imitar experiências clínicas de reabilitação (ou seja, treinamento membro afetado) ou aprendido de não-uso (ou seja, formação de membros menos afetados). Quando combinado com métodos neuroanatômicos, a PMRT fornece aos pesquisadores a oportunidade de explorar os mecanismos que suportam a recuperação comportamental da função ou plasticidade adaptativos após o uso do membro de compensação após o AVC. O PMRT poderiam ser mais aplicada a outros modelos murinos de lesão cerebral e comprometimento do membro superior, tais como lesão cerebral traumática. Outra vantagem do PMRT é a sua acessibilidade. Os equipamentos necessários para a tarefa pode ser construído bastante razoável em casa, a coleta de dados nãonão requer uma grande quantidade de espaço ou de recursos financeiros, ea tarefa é simples o suficiente para estudantes de graduação para coletar dados de forma confiável. Além disso, o PMRT é sensível até mesmo pequenos déficits comportamentais ^{3, 13.} Este protocolo fornece uma maneira simples e eficaz para avaliar a aprendizagem de habilidades motoras, promover a recuperação comportamental após lesão, e imitam os fenômenos de não-uso aprendido em um modelo murino estabelecido de acidente vascular cerebral.

Protocolo

Os métodos a seguir estão de acordo com os protocolos aprovados pela Universidade do Texas em Austin e Illinois Wesleyan Animal Care e Comitês uso. Recomenda-se que os pesquisadores ou usar luvas ou tomar as devidas precauções (lavar as mãos antes e depois) ao se envolverem em treinamento comportamental com qualquer animal de laboratório. As luvas devem ser usado quando manusear animais na preparação e durante a cirurgia.

1. Habituação e Alimentação Restrição

NOTA: Como o PMRT é uma tarefa apetitiva, é benéfico para restringir a quantidade eo momento da alimentação antes do início do treinamento, a fim de motivar a resposta chegar e evitar a saciedade durante as sessões de treinamento.

1. Colocar ratinhos com um calendário de alimentação restrita começando, pelo menos, uma semana antes do início da formação de tarefas. Pesar cada rato antes do início da restrição alimentar para estabelecer pesos-alimentação livre, que são determinados como the pesos de cada animal no primeiro dia de alimentação restrita.
   1. Alimentar os ratos uma vez por dia, com cada rato receptor ~ 2,5 g de ração padrão para roedores por dia (por exemplo, se houver quatro ratinhos alojados numa gaiola, a gaiola receberá 10 g de alimento por dia). Assegurar a alimentação ocorre ao mesmo tempo a cada dia, de preferência no momento em que são esperadas sessões de treinamento diariamente para concluir.
   2. Pesar os animais regularmente para garantir que nenhum rato perde mais de 10% de seu peso-alimentação livre. NOTA: Ajuste quantidades alimentares diárias de acordo para promover a manutenção do peso adequado. Ratos tipicamente ganhar peso à medida que amadurecem, mesmo com constantes de restrição alimentar Ratos permanecer na restrição alimentar durante o período de PMRT formação / avaliação.
2. Expor os animais pequenos pedaços de massa (cortado para 1,6 cm) em sua gaiola várias vezes antes do treino, a fim de superar as respostas neofóbicas. NOTA: Normalmente, 5-10 dias de exposição são suficientes, com cerca de 4 peças por rato provided em cada mamada.
3. Corte pedaços de massa de tamanho (3,2 cm) usando uma lâmina de barbear. NOTA: Recomenda-se que um excesso de pedaços de massa são cortados antes do início da formação do dia e pedaços não utilizados armazenados em um recipiente hermético. Capellini massa é utilizada para encher a matriz. Uma vez que diferentes marcas de massa variam em textura e diâmetro, o que poderia influenciar a estabilidade da massa da matriz, ou a quantidade de força necessária para que os ratos quebrar a massa, é recomendado que DeCecco marca massas ser utilizado ao longo da formação e testes.
4. Coloque não cozidas peças capellini massas na matriz de massas, preenchendo todos os furos disponíveis na matriz (Figura 1A).
5. Habituar ratinhos para a câmara de teste com uma matriz de massa completo colocado em frente (Figura 1A) e vários pedaços de massa para comer na parte inferior da câmara de testes. Habituar ratos por 3 sessões de 5-10 min. NOTA: Os ratos não devem ser encorajados a chegar para a massa durante habituaformação ção. Ratos geralmente começam a mostrar interesse na pasta localizada fora da câmara de alcançar por cheirar para ele através da abertura. É possível habituar dois companheiros de gaiola numa única câmara, se desejado, mas os ratos deve ser moldado e formado individualmente. Todas as superfícies devem ser limpas com etanol a 70% ou uma solução semelhante desinfecção segura antes e depois de cada animal é colocado no aparelho de comportamento.

2. Shaping Reach

1. Determine membro preferido de cada animal por meio da formulação do alcance sobre 3-5 ensaios moldar uma vez por dia. Permitir que os ratos para alcançar 10 min ou um total de 10 vezes, o que ocorrer primeiro.
   1. Coloque ratinhos individualmente na câmara de teste com uma matriz de massa total, em frente da câmara, como na formação de habituação (Figura 1A).
   2. Registre o número de alcances com cada membro, o que denota o número de alcances com o direito e os membros esquerda separadamente. Definir um alcance como extensãodo membro através da abertura de modo a que alcance o pulso quebra do plano da câmara; não é necessário para o alcance a ser dirigida para, ou em contacto com a massa.
2. Mantenha vários pedaços de massa apenas dentro da câmara através da abertura de chegar para incentivar os ratos que estão relutantes em chegar. Desenhe os pedaços de massa para fora quando o mouse mostra interesse (por exemplo, cheirar, morder), incentivando-os a alcançar depois os pedaços de massa em retirada. Se os ratos não mostram interesse inicialmente na massa seca, em seguida, molhar as pontas dos pedaços de massa em um pequeno copo de água morna para torná-los mais palatáveis.
3. Determine preferência membro quando um rato exibe um mínimo de 70% de seus alcances diárias com um único membro. Não para o excesso de forma animais, pois isso pode limitar a quantidade de aprendizagem observadas durante a parte de treinamento de tarefas atingindo ^17. Começar a treinar PMRT uma vez são moldadas camundongos. NOTA: O treinamento pode ser iniciado assim que o next dia, mas também é aceitável que esperar vários dias entre formação e procedimentos de treinamento.

Formação 3. Alcançando

1. Camundongos trem uma vez por dia antes de insulto, a fim de estabelecer a proficiência no PMRT. NOTA: Cada ensaio é composto por um máximo de 15 minutos ou 100 alcances contados pelo observador (bem e mal sucedidas), o que ocorrer primeiro. Ratos são treinados para atingir apenas com o seu membro preferido. Ratos tolerará dois ensaios por dia, se um paradigma mais intenso treinamento é desejado ^18.
   1. Coloque ratos na câmara de teste com uma matriz semi-cheio colocado na frente (Figura 1B). Camundongos trem para chegar apenas com o seu membro preferido, preenchendo apenas o lado contralateral da matriz para o membro preferido desde camundongos chegar do outro lado da linha média do corpo. Deixar a porção da matriz correspondente ao membro unpreferred não preenchidas, a fim de desencorajar a tentativa de alcançar com esta parte (o que não seria successful porque eles não podem alcançar o macarrão) e incentivar atingindo apenas com o membro preferido.
2. Coloque uma pequena quantidade de pressão sobre a massa, embora seja na matriz para ajudar a quebrar camundongos com sucesso peças durante os treinos iniciais. Não quebre os pedaços de massa para o mouse. Conseguir isso segurando um ou dois pedaços de massa levemente para trás e perpendicular ao alvo atingindo pretendido. Esta pequena quantidade de apoio ajuda a estabilizar a massa fina, o que é bastante flexível e difícil para os ratos de compreender como são inicialmente aprender a tarefa.
3. Registre o número total de alcances, o número de alcances de sucesso, e os locais de alcances de sucesso. Alcances bem sucedidas exigem o mouse para alcançar através da abertura, pegue um pedaço de massa, e quebrar o pedaço de massa para removê-lo a partir da matriz. NOTA: pedaços de massa não deve ser substituído na matriz até que após o julgamento terminou. No início de treinamento, os ratos não vai quebrar muitos pedaços de massa.
4. Camundongos trem na PMRT de proficiência, que é definida como pelo menos 3 dias (e até 5 dias) de um desempenho consistente (quebrando pelo menos 9 peças de massa com não mais do que 2 mais ou menos peças ao longo de dias). Muitas vezes, leva entre 15-20 dias para treinar ratos adultos jovens a proficiência.

4. Formação Limb Menos afetada

1. Treinar o membro menos afetados (ou seja, o membro unpreferred pré-operatório), com início quatro dias após o insulto isquêmico para o córtex motor contralateral ao membro de alcance preferido (ver Figura 2 para esclarecimentos sobre membros afetados / preferido e less-affected/unpreferred) . Administrar sessões uma vez por dia de 15 min ou de treinamento de 100 alcance.
   1. Retirar a primeira coluna de massas (ou seja, a coluna vertical mais medial que se prolonga a partir da abertura atingindo) para a primeira semana de formação do membro menos afectado, a fim de assegurar que chega mais cedo com o membro afectado não são bem sucedidos.
   2. camundongos lugar na câmara de alcançar com a matriz cheia de metade colocado na frente. Certifique-se de que a metade cheia da matriz fica em frente do pré-operatório preenchido metade, o que forçará os ratos para agora chegar com o membro menos afetado (unpreferred).
2. Incentivar alcançar com o membro menos afetados, reforçando extensão deste membro através da abertura de chegar. Quando os ratos estender o membro menos afetado nos primeiros dias de treinamento lugar uma pequena (1/2 unidade) de massa no chão da câmara de alcançar independentemente de haver ou não o alcance é bem sucedida.
3. Conte apenas os alcances realizados com o membro menos afetada em direção ao 100 alcance total. Não conte tentativas furtivas com o membro afetado para o número total de alcances.
4. E volta a coluna vertical mais medial de massas para a matriz após os primeiros 7 dias de formação do membro menos afectado.
5. Registre o número de alcances, o número de alcances de sucesso, e os locais de succalcances essful. NOTA: Estes dados podem ser analisados ​​para observar as diferenças de atingir padrões com o membro menos afetados, mas não tenham sido previamente comunicados.

Análise 5. Alcançando

Determinar o impacto de menos afetados uso do membro na recuperação da função do membro afetado pela avaliação do membro afetado na tarefa PMRT seguinte formação dos membros menos afetados. Esta avaliação ocorre depois que o número desejado de dias de formação dos membros menos afetados são completos (normalmente 14 dias).

1. Colocar a matriz na frente da câmara, orientado de forma idêntica aos procedimentos de formação (isto é, com a metade da matriz contralateral ao membro preferido cheio). NOTA: Isso força os ratos para chegar com a sua afetada (e, anteriormente, de preferência) membro.
2. Registre o número total de alcances, o número de alcances de sucesso, e os locais de alcances de sucesso para comparar com os níveis de desempenho pré-AVC. Não sondar o desempenho deo membro afetado durante o treinamento de membros menos afetados como estas sondas membro afetado pode funcionar como sessões de treinamento que poderiam impactar a recuperação do membro afetado.

Resultados

Os resultados da análise PMRT deve incluir o número de pedaços de massa e quebrado o padrão de alcances de sucesso. Os resultados de ratos com lesões corticais sensório-motoras indicam que insulto isquêmico afeta tanto o número de alcances de sucesso, bem como padrões de alcance físico ^{3, 19,} como demonstrado na Figura 3A. As mudanças no padrão representativos pode ser observado na Figura 3B. A capacidade do PMRT para imitar os efeitos de não-uso aprendido em ratos é demonstr...

Discussão

O PMRT representa uma maneira simples e quantitativa para avaliar atingindo desempenho habilidoso em camundongos. Apesar de demorado, é possível para alunos de graduação previamente inexperientes para serem treinados para coletar dados confiáveis ​​e reprodutíveis, com apenas algumas sessões de treinamento. A tarefa é sensível o suficiente para medir até mesmo pequenas mudanças no desempenho do mouse habilidade motora seguintes insulto isquêmico ^{3, 13, 15,} e uma série de estudos citam déficits de longo prazo ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara de alcance			As câmaras de alcance são feitas internamente com
bloco			A caixa de matriz de massa é feita internamente usando um bloco de plástico pesado
Macarrão Capellini	DeCecco		A massa capellini da marca DeCecco pode ser comprada em uma mercearia ou através de um varejista online como a Amazon