Controlo do motor e desempenho da balança são conhecidos por se deteriorar com a idade. Este artigo apresenta uma série de testes comportamentais não invasivos padrão com a adição de um estímulo rotativo simples de desafiar o sistema e mostrar vestibulares mudanças no desempenho do equilíbrio em um modelo murino de envelhecimento.
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Artigo de método
Avaliação Comportamental do Envelhecimento Rato Sistema Vestibular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Declínio relativo à idade no desempenho da balança está associada à deterioração da força muscular, coordenação motora e função vestibular. Embora uma série de estudos mostram mudanças no equilíbrio fenótipo com a idade em roedores, muito poucos isolar a contribuição vestibular para equilibrar tanto sob condições normais ou durante a senescência. Usamos dois testes comportamentais padronizados para caracterizar o desempenho do equilíbrio de ratos em pontos etárias definidas ao longo da vida: o teste rotarod eo teste trave inclinada. É importante ressaltar, porém, um rotor personalizado construído também é usado para estimular o sistema vestibular de ratos (sem indução de sinais evidentes de doença de movimento). Estes dois ensaios foram utilizados para mostrar que as mudanças no vestibular desempenho de equilíbrio mediada estão presentes ao longo da vida de murino. Os resultados preliminares revelam que tanto o teste rotarod e o teste de feixe de equilíbrio modificada pode ser utilizada para identificar alterações no desempenho do equilíbrio durante o envelhecimento como uma alternativa a mais dificuldades encontradastécnicas ult e invasivos, como medições vestíbulo-ocular (RVO).
Introdução
Nosso senso de equilíbrio é, talvez, um dos componentes vitais ainda mais negligenciados do mesmo as atividades motoras mais básicas, incluindo caminhadas e de viragem. O equilíbrio é influenciado por inúmeros fatores, incluindo a força muscular, coordenação motora e função vestibular, e é apenas na presença de neuropatias vestibular ou durante o envelhecimento normal que a importância de um sistema de equilíbrio em pleno funcionamento é apreciado. Distúrbios do sistema vestibular são frequentemente associados com experiências de vertigem ou tontura e desequilíbrio, resultando em um aumento do risco de quedas e lesões subseqüentes 1. Isto é particularmente crítico em populações mais antigos, onde as quedas são uma das principais causas de lesão 2.
Testes de função vestibular são geralmente baseados nos reflexos vestibulares, em particular, o vestíbulo-ocular (VOR) ou do reflexo vestibulo-collic (VCR). O VOR e VCR são essenciais para a estabilização de imagens ema posição de retina e da cabeça durante os movimentos da cabeça e do corpo, respectivamente. Comumente, as medições VOR requer implantação invasivo de bobinas de pesquisa para medir os movimentos dos olhos ou monitoramento de vídeo de movimento dos olhos 3. Este é um desafio em camundongos devido ao pequeno natureza do olho do rato e da dificuldade em detectar o aluno para a análise de vídeo 3. Como alternativa, o VCR tem sido utilizado para medir a estabilização da cabeça em resposta aos movimentos do corpo em ratos sem a necessidade de cirurgia invasiva 4. Apesar disso, poucos estudos incidem especificamente sobre como o sistema vestibular funciona como um todo, e mais importante, como ele muda durante o envelhecimento.
Para avaliar o desempenho geral do equilíbrio de forma simples e não invasiva modificamos dois testes comportamentais comumente usados. Os testes dos balanceiros rotarod e inclinadas avaliar diferentes aspectos do desempenho do motor em roedores e em estudos anteriores tenham sido usados de uma bateria de testes para adquirir uma completaperfil de capacidade motora. Esta capacidade pode ser afetada por uma doença ou modificação genética, e também é sensível aos processos associados com o desenvolvimento normal e envelhecimento 5-7. Trabalhos anteriores usando o rotarod mostrou que a coordenação motora em ratos diminui após 3 meses de idade 8. Além disso, os ratos apresentam déficit de equilíbrio visíveis com o aumento da idade no teste trave de equilíbrio 9.
Este artigo descreve o uso dos testes rotarod e feixe de equilíbrio em conjunto com um estímulo vestibular, a fim de desafiar o sistema vestibular e caracterizar o impacto sobre o desempenho subseqüente equilíbrio em jovens e mais velhos ratos. Enquanto os métodos simples e não invasivos descritos não são concebidos como medidas independentes da função vestibular periférica, eles não fornecem uma medida comportamental útil e simples para comparar as alterações celulares e subcelulares em vários estágios de processamento vestibular durante o envelhecimento normal em camundongos.
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Protocolo
1. Animais
- Ratos (C57/BL6) de idades de 1, 9 e 13 meses de idade foram obtidos a partir do Centro de Recursos Animais (Perth, Austrália). Estes ratos foram alojados em gaiolas de rato padrão na instalação Bosch Roedor na Universidade de Sydney em um ciclo claro / escuro 12/12 horas de luz com acesso a comida e água ad libitum. Os procedimentos descritos a seguir foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Sydney animal.
- Traga gaiolas de rato para a sala de teste antes de cada teste, durante 10 min para permitir que os ratos a aclimatar ao ambiente de teste.
2. Rotarod
- Configure o aparelho rotarod (Figura 1A):
- Instale as buchas em cada pista do rotarod.
Nota: Neste exemplo buchas de ratos (70 mm de diâmetro) são usados em vez de buchas de rato (32 mm de diâmetro) para desencorajar os ratos do apego ao passador e realizando rotações "passivos" 10. - Positião as plataformas de aterragem magnéticas sobre o fio situado na parte inferior de cada pista do cilindro rotativo para garantir que eles não são inclinando para tocar no piso do cilindro rotativo e são colocados tão perto quanto possível da parede direita magnético de cada pista sem tocar.
Nota: Durante os ratos de teste rotarod são obrigados a andar para a frente para ficar em as buchas rotativas e acelerando. Quando um rato não é mais capaz de permanecer no passador, eles caem e deslocar a plataforma de desembarque que, posteriormente, ativa um sensor magnético. O tempo que demora a cair do cavilha rotativo, a rotação do passador no tempo de queda e a distância percorrida é calculada automaticamente para cada rato e gravado no visor na frente do cilindro rotativo. - Deslize dois painéis de plástico transparente na frente de cada pista rotarod com os painéis mais curtos na parte inferior e os painéis mais acima.
- Entrada de parâmetros de ensaio, utilizando o teclado localizado na parte frontal do cilindro rotativo. Siga ruaeps 2.1.4.1 a 2.1.4.6 para os parâmetros de teste rotarod acelerando e etapas 2.1.4.7 a 2.1.4.12 para os parâmetros de teste rotarod de velocidade fixa.
- Defina a duração máxima do teste para 60 seg.
- Definir o número de pistas a ser utilizado (ou o número de murganhos a ser testado).
- Defina a velocidade inicial do teste para 5 rpm.
- Defina a velocidade máxima do teste a 44 rpm.
- Defina a velocidade de rampa do teste para 60 seg.
- Defina o tamanho dos passadores escolhidos e do sentido de rotação para buchas de ratos em rotação para a frente.
- Defina a duração máxima do teste a 240 seg.
- Defina o número de vias a serem utilizados para 1, como os ratos são testados individualmente.
- Defina a velocidade de partida da prova a 15 rpm.
- Defina a velocidade máxima do teste a 15 rpm.
- Defina a velocidade de rampa de teste para 0 seg.
- Definir o tamanho da cavilha escolhida e do sentido de rotação de um passador de rato rotativa num forwadireção rd.
Nota: As definições acima podem ser alterados para se adequar às necessidades de diferentes experimentos.
- Coloque uma câmara em frente do cilindro rotativo para o teste rotarod velocidade fixa, de modo que o comportamento do rato durante os ensaios podem ser gravados e os vídeos usado para posterior análise para determinar a duração de tempo os ratinhos foram capazes de permanecer no cilindro rotativo.
- Instale as buchas em cada pista do rotarod.
- Siga os passos 2.2.1 a 2.2.4 para o teste rotarod aceleração:
- Coloque um mouse em cada passador parado por 5 minutos para permitir que os ratos para aclimatar à rotarod.
- Suavemente empurrar os ratos para enfrentar a volta do cilindro rotativo e inicia o teste rotarod quando todos os sujeitos são virada nessa direcção (ver Figura 1B).
- Retornar todos os ratos para suas gaiolas quando eles caíram de as buchas rotativas e deixá-los descansar por 10 min com acesso a comida e água.
- Repita os passos 2.2.1 a 2.2.3 para completar um total de 8 ensaios certificando-se de limparas buchas, pistas, e plataformas de desembarque da rotarod para urina e fezes, e mover as plataformas de pouso de volta à sua posição inicial betwen cada ensaio.
Nota: Os primeiros 3-5 ensaios são utilizados como testes de treinamento para permitir que os ratos a se familiarizar com a tarefa. O tempo de queda, a distância percorrida e final rpm da bucha, no momento da queda de cada tentativa subsequente é gravadas para posterior análise (Figura 2).
- Siga os passos 2.3.1 a 2.3.8 para o teste rotarod velocidade fixa:
- Coloque um mouse em um passador por 5 minutos para permitir que ele se acostumar com o rotarod. Retorne o mouse de volta para sua gaiola.
- Iniciar a gravação de vídeo na câmera e começar a pressionar no rotarod. Em seguida, coloque o mouse sobre o passador rotativo garantindo que enfrenta a parte de trás do rotarod.
- Pare a gravação de vídeo na câmera quando o rato cai das buchas rotativas, e retornam o mouse para suas gaiolas por 10 minutos com acesso a comida e água.
- Repita os passos 2.3.2 e 2.3.3, até um total de 8 ensaios é adquirido certificando-se de limpar as buchas, pistas, e plataformas de desembarque da rotarod por fezes e urina, e mover as plataformas de pouso de volta à sua posição inicial entre cada ensaio .
- Ligue o costume construído rotador em 3 Hz por 20 segundos para permitir que os ratos para familiarizar-se com o som. Pare o rotator após 20 seg desligando a broca e colocar as mãos em cada lado da roda de corrida para impedi-lo de continuar a girar passado a 20 seg inicial.
Nota: O rotador si consiste de uma roda de corrida roedor preso a uma broca (Figura 3A). No centro da roda de funcionamento é uma pequena câmara com uma tampa de malha em que o rato é colocado (Figura 3B). O rotor gira no sentido anti-horário em torno do eixo vertical. A magnitude do estímulo é, de acordo com estudos anteriores que mostram estimulações rotativos variando de 0,2 a 3 Hz são suficientes para gecomeu VOR e VCR respostas 4,11,12. - Colocar o rato dentro da câmara no centro do rotor e substituir a tampa.
- Ligue o rotator em sua configuração mais baixa de 3 Hz por 20 s. Inicie o rotarod e começar a gravação de vídeo na câmera durante este tempo de preparação para a próxima prova. Desligue a broca no final dos 20 segundos e coloque as mãos em cada lado da roda de corrida para parar de girar. Teste novamente o mouse sobre a rotarod imediatamente depois, transferindo-o o mais rápido possível para o pino de rotação.
- Pare a gravação de vídeo na câmera quando o rato cai do passador e retornar o mouse para sua gaiola.
- Limpe os painéis de plástico transparente com um detergente / mix e água leve o buchas cilíndricas, pistas e plataformas metálicas de desembarque da rotarod com etanol 70%, quando todos os ratos foram testados.
3. Trave com Vestibular Desafio
- Configure o baAparelho feixe lança como visto na Figura 4A.
Nota: O aparelho de feixe de equilíbrio foi adaptado a partir de um aparelho descrito em Carter et al (2001) 13.. Para este ensaio, ratinhos andar a partir da extremidade inferior da viga, que é 52,5 centímetros acima do solo, para uma caixa escurecida gol (13 x 22 cm, com um 5 x 6 cm porta) situada a 60 cm acima do solo (Figura 4A ). Ratos naturalmente procuram a escuridão e proteção da caixa de meta em favor do feixe expostos e são ainda encorajados a atravessar o feixe pela ligeira inclinação que explora o seu mecanismo de fuga natural para correr em uma direção para cima 14. A viga em si é de 1 m de comprimento e tem uma secção transversal circular com um diâmetro de 14 mm. A gama de diâmetros adaptados feixe pode ser usado o qual permite que o experimentador para ajustar a sensibilidade do teste ou acomodar indivíduos maiores. Na extremidade inferior do feixe de equilíbrio de uma linha branca indica a linha de partida. Outra linha foitraçada 60 cm da linha de partida no ponto mais alto do feixe para indicar a linha de chegada (Figura 4A).- Posição 2 câmaras, uma de cada lado da viga de equilíbrio, na extremidade inferior da trave (Figura 4B).
Nota: Estas câmeras deveriam ser inclinado para capturar todo o comprimento da trave de equilíbrio e garantir que as linhas de partida e de chegada marcada na trave de equilíbrio são claramente visíveis. Essas câmeras serão usados para gravação de vídeo o comportamento dos camundongos, enquanto atravessam a trave de equilíbrio, com vídeos resultantes sendo usado para análise posterior. - Forre o chão da caixa de meta com toalha de papel, para facilitar a limpeza de urina e fezes depois de testar cada rato, e coloque a cúpula habitação da gaiola assuntos casa no interior da caixa do gol.
- Coloque espuma adequada ou outro material de enchimento por baixo da viga levantada para proteger todos os assuntos que caem do aparelho. Ratos que caem vai ser pego imediatamente pelo experimentoer e colocado dentro da caixa de meta para descansar.
- Posição 2 câmaras, uma de cada lado da viga de equilíbrio, na extremidade inferior da trave (Figura 4B).
- Coloque um rato na caixa de meta por 2 min para que se torne familiarizado com este ambiente. Cubra a abertura da caixa de gol com a mão enluvada por 5 segundos, se o rato tenta andar na trave durante este tempo para desencorajar este comportamento.
- Treinar o mouse, colocando-o na trave do lado de fora a abertura da caixa de meta e permitindo-lhe caminhar na caixa de gol. Continue a treinar o mouse, colocando-o na trave progressivamente mais longe da caixa de meta até que o mouse é capaz de andar a partir da linha de partida para a caixa de meta sem assistência e hesitação mínimo. Deixe o mouse para descansar na caixa de meta para 1 min após cada ensaio.
- Comece a testar o mouse quando a formação é completa.
- Iniciar a gravação de vídeo em câmeras.
- Posicione o mouse na linha de partida da viga e esperar enquanto ele atravessa o feixe na direção da caixa de meta.
- Pare a gravação de vídeo em caMeras quando o mouse chega ao caixa.
- Deixe o mouse para descansar na caixa de meta para 1 min. Remova qualquer urina ou fezes, que pode ter sido depositado durante o julgamento enquanto espera.
- Repita os passos de 3.4.1 a 3.4.4, até um total de cinco ensaios foram concluídos.
- Ligue o costume construído rotador em 3 Hz por 20 s (como no teste rotarod velocidade fixa) para permitir que os ratos a se familiarizar com o som. Pare o rotator após 20 seg desligando a broca e colocar as mãos em cada lado da roda de corrida para impedi-lo de girar.
- Colocar o rato dentro da câmara no centro do rotor e substituir a tampa.
- Ligue o rotator em sua configuração mais baixa de 3 Hz por 20 s. Iniciar a gravação de vídeo nas câmeras durante este tempo, em preparação para o próximo julgamento. Desligar a broca na extremidade da 20 seg e colocar as mãos em ambos os lados da roda de corrida para impedi-lo de continuar a girar passado a 20 seg inicial. Transferência o mouse para o início da trave de equilíbrio o mais rápido possível e aguarde enquanto o rato atravessa o feixe de caixa do gol.
- Pare a gravação de vídeo em câmeras quando o mouse chega a caixa de meta e retornar o mouse para sua gaiola.
- Limpe o equipamento trave de equilíbrio com 70% de etanol e mudar a toalha de papel na caixa de gol depois de cada rato foi testado.
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Resultados
Rotarod
O desempenho motor de ratos foi descrito como o tempo para cair (TTF) registrados para cada mouse sobre 8 ensaios. Utilizando estas medições de TTF, curvas de formação para cada rato pode ser traçada. Figura 2 mostra exemplos de o desempenho do motor de um rato 1 mês de idade e um rato 9 meses de idade, ao longo de 8 ensaios. Estas curvas mostram um aumento de formação de TTF durante os primeiros ensaios 3-5, seguido por um patamar subsequente. Medidas de TTF gravadas a...
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Discussão
Etapas críticas dentro do Protocolo
Os trabalhos anteriores mostraram que é fácil entrar em overtraining camundongos, tanto no rotarod e aparelhos trave de equilíbrio e, como conseqüência, a aquisição de medições precisas pode ser um desafio 15. Por exemplo, overtraining no rotarod pode levar a camundongos intencionalmente pulando as buchas durante os períodos de aclimatação e de ensaio, enquanto overtraining na trave podem levar a parada mais freqüentes (comportamento exploratório) ...
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à Garnett Passe and Rodney Williams Memorial Foundation e ao Bosch Institute Animal Behavioural Facility.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Rotarod | IITC Ciências da Vida Inc. | #755 | "Buchas de rato" = 70 mm de diâmetro. Não permita que o etanol entre em contato com o perspex. |
| iPhone | Apple | Pode usar qualquer tipo de câmera. Velcro fixado à superfície traseira para fixação ao braço articulado 3D. | |
| Braço articulado 3D | Fisso/Baitella | Classic 3300-28 | Qualquer tipo de suporte vertical estável seria adequado. O Velcro é fixado na extremidade apical do braço para fixação do iPhone. |
| Viga de madeira: tira de madeira lisa de 1 m de comprimento com uma secção circular de 14 mm de diâmetro | Uma gama de diâmetros e formas de secção transversal pode ser utilizada para se adequar aos parâmetros experimentais | ||
| Caixa de baliza de madeira (130 x 140 x 220 mm) feita de tábuas | |||
| Suporte de suporte feito de vigas de 41 x 41 mm: 2 vigas verticais a 525 e 590 mm do solo nas extremidades inicial e final, respectivamente; Viga horizontal de 803 mm que corre ao longo do solo diretamente sob a viga móvel; duas vigas de 20 mm de comprimento atuam como "pés", unindo as vigas horizontais e verticais em cada extremidade; um bloco de 21 x 21 x 36 mm talhado na extremidade apical da viga vertical de "partida"; uma abertura de 13 x 13 mm cortada no centro deste bloco, formando um túnel que corre perpendicularmente à viga móvel. | Apoie todas as juntas com pequenos suportes de aço. | ||
| Tinta preta (à base de água) | Handycan | Acrílico Preto Mate | 2-3 demãos para todas as superfícies de madeira do aparelho de trave de equilíbrio |
| Acabamento claro | Wattle Estapol | Poliuretano Matt | Camada única para todas as vigas. Camada dupla para todas as outras superfícies do aparelho de trave |
| de equilíbrio Espuma, material | de embalagem Para amortecer qualquer queda da trave de equilíbrio | ||
| 70% Etanol, toalhas de | Limpe a viga e a caixa de gol entre cada animal. | ||
| Compressas de gaze/toalhas de | Para forrar o chão da caixa do gol | ||
| Casa do rato (da gaiola de casa) |
Referências
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Reimpressões e permissões
