O objetivo deste protocolo é usar titulações redox monitoradas por ressonância paramagnética eletrônica (EPR) para identificar diferentes cofatores de Saccharomyces cerevisiae Nar1. As titulações redox oferecem uma maneira muito robusta de obter potenciais de ponto médio de diferentes cofatores ativos redox em enzimas e proteínas.
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Artigo de método
EPR Monitorado Redox Titulação de cofatores de
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Resumo
Resumo
Ressonância paramagnética eletrônica (EPR) acompanhou titulações redox são um poderoso método para determinar o potencial médio de cofatores em proteínas e de identificar e quantificar os cofatores em seu estado redox detectável.
A técnica é complementar a electroquímica directa (voltametria) aproxima-se, uma vez que não oferece informação sobre as taxas de transferência de electrões, mas não determinar a identidade e estado redox dos cofactores na proteína sob estudo. A técnica é amplamente aplicável a qualquer proteína que contenha uma ressonância paramagnética electrão (EPR) cofactor detectável.
Uma titulação típica requer 2 ml de proteína com uma concentração de co-factor na gama de 1-100 uM. A proteína é titulado com um redutor químico (ditionito de sódio) ou oxidante (ferricianeto de potássio), a fim de poise a amostra a um determinado potencial. Um fio de platina e um eléctrodo de referência de Ag / AgCl são conectados a um voltmedidor para medir o potencial da solução de proteína. Um conjunto de 13 diferentes mediadores redox é usado para equilibrar entre os cofactores redox da proteína e os eléctrodos. As amostras são recolhidas em diferentes potenciais e os espectros de ressonância paramagnética eletrônica, característicos dos diferentes cofatores redox na proteína, são medidos. O gráfico da intensidade do sinal em relação ao potencial da amostra é analisada utilizando a equação de Nernst, a fim de determinar o potencial de meia onda de co-factor.
Introdução
É surpreendente que os processos químicos mais fundamentais que sustentam a vida neste planeta, a fotossíntese, fixação de nitrogênio e respiração, são catalisadas por grandes complexos de proteínas que contêm uma vasta gama de cofatores redox orgânicos e inorgânicos. Estimou-se que aproximadamente 30% de todas as proteínas contêm um ou mais co-factores de metal 1,2. Identificação e caracterização dos cofactores redox pode ser estabelecida utilizando electroquímica directa (por exemplo, proteína película voltametria) ou titulações redox. As duas técnicas são complementares em sua natureza e aplicabilidade. Voltammetry oferece determinação rápida d....
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Protocolo
1. Preparação da instalação e Soluções
- Preparar a solução de tampão contendo Tris 100 mM, NaCl 250 mM e 10% de glicerol a pH 8,5. Eliminar o ar da tampão lavando com argônio. Introduzir o buffer em uma câmara anaeróbica.
- Divida o tampão em duas porções. A uma porção (tampão A) adicionar 1 mM DL-ditiotreitol (DTT, M r 154,25 g / mol) e 1 mM de L-cisteína. A outra porção (tampão B) não contêm agentes redutores.
- Preparar soluções oxidantes e redutoras. Adicione 1 ml de soluções de 2, 20, e ferricianeto de potássio 200 mM (FIC, M r 329,26 g / mol) e de ditionito de sódio (SD, M r 174,11 g / mol) em tampão B.....
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Resultados
A titulação redox do conjunto do ferro-enxofre contendo proteína Nar1 a partir de Saccharomyces cerevisiae resultou na identificação de três diferentes co-factores: Nar1: uma [3fe-4S] de fragmentação, um [4FE-4S] de fragmentação e um centro de Fe mononucleares (Figura 1) . Os sinais de RPE são caracterizados por suas g-valores: para o [3FE-4S] + g z 2.01, 2.00 g de crossover (Figura 1B); para o [4FE-4S] +, z g 2,02 g 1,93 <.......
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Discussão
A série de 13 mediadores redox permite um equilíbrio redox da solução na gama de 0,3 a -0,45 V versus ELA (Tabela 1 e Figura 3). Bem acima e abaixo destes potenciais mediadores são todos ou completamente reduzida ou completamente oxidada e, consequentemente, não mais de equilíbrio com os centros activos redox da proteína podem ocorrer. Este é um conceito importante, como na literatura, por vezes redox titulações são realizadas com apenas dois ou três mediadores, permitindo apenas uma es.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma bolsa de investigação a partir da combinação Escola Nacional de Pesquisa holandesa, Catalysis Controlled by Design Chemical (NRSC-Catálise). Dr. HY Steensma e Dr. GPH van Heusden da Universidade de Leiden são reconhecidos por seu apoio com a expressão recombinante de S. cerevisiae Nar1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Eléctrodo de referência (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Espectrómetro Sigma-Aldrich | ||
| EPR | Bruker | ||
| N,N,N',N' -tetrametil-p-feniledendiamina (TMPD) · (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-diclorofenol indofenol (DCIP), sal | 620-45-1 | ||
| Fenossulfato de fenazina (PES) | 10510-77-7 | ||
| Azul | 122965-43-9 | ||
| Resorufina, sal | 34994-50-8 | ||
| Indigodissulfonato (índigo carmim) | 860-22-0 | ||
| 2-hidroxi-1,4-nafaquinona | 83-72-7 | ||
| Antraquinona-2-sulfonato Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Fenosafranina | 81-93-6 | ||
| Safranina O | 477-73-6 | ||
| Vermelho | 553-24-2 | ||
| Benzilo viologen | 1102-19-8 | ||
| Metil viologen | 1910-42-5 |
Referências
- Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
- Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611(1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzym....
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Reimpressões e permissões
