Extração de Venom e Venom Gland microdissecações de Aranhas para proteômica e análise do transcriptoma

Venenos são secreções animais predominantemente injetadas em outro animal para efeitos de predação ou defesa, e também tem aplicações biológicas importantes com relevância biomédica ^1-3. Apenas certos animais sintetizar veneno, mas sua produção é taxonomicamente difundida através invertebrados (por exemplo, cnidários, caracóis cone, escorpiões e aranhas) e vertebrados (eg, cobras, alguns peixes e mamíferos), porque ela evoluiu independentemente várias vezes ^1,4 . A caracterização bioquímica de venenos tipicamente mostram que eles são constituídos por uma grande variedade de proteínas e péptidos, que em grande parte actuar sobre os sistemas circulatório e nervoso de animais injectados para entregar rapidamente toxinas constituintes ^1. Uma pequena fração dos animais peçonhentos podem representar uma ameaça para os seres humanos, em particular as espécies com distribuições sinantrópicos ^5. O estudo da composição do veneno e atividades funcionais tem desempenhado um papel importante naa caracterização funcional dos componentes celulares de vertebrados (especialmente canais iônicos neuronais) ⁶ e na elucidação dos processos celulares fundamentais (por exemplo neurosecreção) ^7. Além disso, selecione peptídeos do veneno ter propriedades úteis em contextos biomédicos, incluindo seus usos como tratamentos para o câncer e dor ^8,9, e são minados para candidatos leads de drogas e desenvolvimento antiveneno. Venenos também desempenham papéis importantes na ecológico e evolutivo pesquisa ^1,4,10,11, assim, a coleta dessas secreções perigosos tem muitas utilidades.

Há> 40.000 espécies descritas de aranha (Araneae da ordem), e todos, mas uma das mais de 100 famílias de aranhas possuem glândulas de veneno emparelhados que terminam em presas ^12. A alta diversidade de espécies de aranhas sugere que eles representam o maior clade de organismos peçonhentos. No entanto, a caracterização bioquímica de venenos de aranha tem largely concentrada num pequeno número de espécies mais frequentemente associados com o envenenamento humano. Estudos de proteômica e transcriptomic recentes de venenos de aranha indicam que eles normalmente contêm muitas proteínas e peptídeos únicos ^2,13,14. Advances in high-throughput sequenciação de ADNc e de espectrometria de massa dos péptidos fingerprinting facilitou enormemente a descoberta destas proteínas do veneno ^15. No entanto, esse trabalho começa com a coleta de veneno suficiente e / ou glândulas de veneno das aranhas e documentação detalhada para tais técnicas são poucos ^16.

Este trabalho apresenta um protocolo para a recolha de veneno e veneno de glândulas de aranhas viúva-negra, que pode ser aplicado às aranhas de tamanho similar. A recolha de veneno separadamente a partir das glândulas permite a identificação de proteínas que são segregadas para o veneno em oposição às proteínas que executam outras funções celulares. As viúvas negras e outra Lespécies atrodectus são amplamente reconhecidos como estando entre as aranhas mais perigosas devido ao seu veneno altamente neurotóxico, o que provoca dor severa em humanos, o que às vezes é acompanhada de sudorese profusa, contrações musculares, hipertensão arterial, dificuldade respiratória e paralisia desigual ^5. O protocolo de coleta de veneno aqui apresentada utiliza electro-estimulação de fornecer corrente elétrica para aranhas anestesiados para provocar contrações musculares e liberação de veneno. Gotas de veneno são rapidamente recolhidos com micro-capilares e em tubos para armazenamento congelador. Como o protocolo envolve procedimentos perigosos, que só deve ser realizado por indivíduos bem treinados e cautela é instado a passos fundamentais. O veneno coletado tem inúmeras utilizações, como a caracterização e isolamento de moléculas constituintes ^2, para experimentos fisiológicos ou ensaios funcionais ^18, e estimular a expressão do gene veneno ^11. O protocolo termina com uma description de dissecção glândula de veneno e preservação útil para a clonagem de genes específicos de veneno, a expressão de que foi demonstrado que ocorrem 2-3 dias seguintes depleção veneno em diferentes aranhas ^10,11.

1. Preparação da Electro-estimulador Aparelho

1. Conecte o cabo de alimentação eletro-estimulador para a saída e anexar pedal externo para a entrada de sinal externo.
   Nota: Fios elétricos devem estar bem isolados e atual entregar metal exposto não deve ser tocado. Usar luvas de látex ou borracha nitrílica para proteção. Interruptor de alimentação eletro-estimulador deve estar na posição OFF quando anexar cabo de alimentação e ligar os fios.
2. Conecte eletrodo positivo para o terminal de saída vermelho em eletro-estimulador (quando a chave de polaridade está no modo normal) e conectar o eletrodo negativo para o terminal de saída de preto. Nota: Cada fio de eletrodo deve terminar em um jacaré.
3. Definir estimulador para as seguintes configurações iniciais recomendadas: Tensão = 7 V, frequência = 1 pulsos por segundo, atraso = 0 milissegundos, duração = 200 milissegundos, pulsos gêmeos mudar = regular, e interruptor mode = off.
4. A saída do teste de eletrodos, anexando as garras jacaré voltmeTer pontas de prova positivos e negativos. Ligue o interruptor estimulador e fornecer corrente com pedal.

2. Preparação de imobilizatórias Fórceps e Outros Materiais

1. Mergulhe um pino de fórceps pluma em revestimento plástico líquido e esperar quatro horas para deixar o revestimento seco. Enrole firmemente 15 milímetros da ponta do dente adversária com uma única camada de linhas de costura de algodão, e garantir fio amarrando o fim em um nó.
   Nota: O fio é utilizado para absorver uma solução salina aplicada que promove a condutividade eléctrica, enquanto o revestimento de plástico proporciona isolamento para retardar a corrente.
2. Cortar ponta da agulha hipodérmica sem corte com uma tesoura afiada e suavizar a abertura com papel de areia. Coloque a agulha para uma armadilha resíduos de vácuo (por exemplo, balão de filtração a vácuo) através de tubos.
   Nota: A agulha vai aspirar a água e afastado regurgitar, e servirá para completar o circuito criado pelos eléctrodos do estimulador. A mu abertura agulhast ser pequeno o suficiente para não prejudicar a aranha, mas grande o suficiente para solução de vácuo sem obstruir (por exemplo, 25 G x 1 ½ no medidor, consulte Lista de Materiais).
3. Fórceps posição pluma horizontalmente em uma posição bem fechado com uma braçadeira dupla coberta de vinil preso a uma base magnética ou aparelho estande fixo sob campo de um microscópio de dissecação de vista, com revestimento de plástico pino de fórceps no topo e linha revestido pinos na parte inferior.
   Nota: A braçadeira de duas pontas é mantido numa posição estacionária para a base magnética por um suporte de fixação (ver Lista de Materiais). Uma banda de borracha pode ser firmemente fixado em torno pontas das pinças pluma, ao lado de suporte da braçadeira, para adicionar uma pressão adicional para manter a pinça pluma numa posição fechada em torno da aranha, uma vez introduzida.
4. Anexar positivo clipe jacaré eletrodo de ponta inferior 'fórceps a montante da linha e anexar jacaré negativo para diminuir agulha vácuo metal. Circuito de teste atual com voltímetro, colocando liderança positiva sobre fórceps pino entre o fio ea garra jacaré e colocando liderança negativa na agulha vácuo sem corte. Pressione o pedal para garantir corrente suficiente é detectado e remover leads se corrente suficiente é detectado.
5. Prepare vários tubos microcapilares para coleta de veneno. Segurar um único tubo microcapilar em uma extremidade com uma mão enluvada e na outra extremidade com uma pinça de metal estéreis, colocando a extremidade fórceps mantidos horizontalmente ao longo de um queimador de chama de Bunsen. Puxe a microcapilar com a pinça de metal longe da chama para criar uma ponta alongada, enquanto segura a outra extremidade em uma posição estacionária.
   Nota: usar óculos de proteção como microcapilares pode facilmente fratura.
6. Descanse microcapilares preparados em uma tira de massa de montagem em uma placa de Petri. Examine microcapilar termina sob um microscópio de dissecação e criar uma abertura pequena, chanfrado na extremidade puxado com uma pinça de metal esterilizados.
7. Lanúmero variável de bel estéreis 0,5 ml tubos. Adicionar água estéril, desionizada estéril para tubos (por exemplo, 5 ul de água desionizada autoclavada). Fechar os tubos e colocar os tubos no gelo.
8. Preparar a solução salina numa proveta e preencher um segundo copo com água autoclavada.

3. Imobilização de Aranha em Fórceps

1. Ligue CO ₂ tanque e transferir aranha de plástico recolhendo frasco fechado (veja a lista de materiais) em CO ₂ câmara usando uma pinça de metal longos.
   Nota: aranhas viúva-negra tem veneno perigoso; sempre usar luvas durante este protocolo.
2. Mantenha aranha na câmara de 5-10 min ou até anestesiado e não se mover quando gentilmente cutucou com uma pinça longa. Use pipeta de transferência para molhar rosca na pinça com solução salina.
   Nota: Para obter diretrizes sobre CO ₂ parâmetros de anestesia para viúvas negras, consulte Spagna e Moore ^19.
3. Recuperar aranha anestesiado de CO ₂câmara por pegá-la pelas suas pernas anteriores usando uma pinça de dissecação contundentes e as mãos enluvadas. Mova aranha anestesiados a pluma aparelho fórceps. Dentes separados de fórceps pluma fechadas e coloque cefalotórax da aranha entre os dentes e permitir que os dentes para fechar fechada para garantir a aranha é mantido firmemente no lugar, mas não está sendo esmagado. Certifique-se de que a aranha é colocado lado carapaça dorso para baixo (ver Foelix ²⁰ para guia de anatomia aranha), descansando em fio revestido pinos, e no lado ventral da carapaça de frente para o revestimento de plástico, enquanto o eletrodo positivo permanece ligado ao pino de fundo. Trabalhe rapidamente ao manusear aranha.
4. Ajuste dissecando ampliação do microscópio, foco e fonte de luz até quelíceras de aranha e as presas são claramente visíveis.

4. Venom coleção

1. Ligue vácuo e spray quelíceras aranha com solução de água usando um segundo sem corte da seringa needle. Sucção fora a água com agulha de vácuo para remover as impurezas.
2. Toque na agulha de vácuo com eletrodo negativo ligado à tribuna aranha e entregar pulso com pedal uma ou mais vezes. Vacuum longe regurgitar, se necessário.
   Nota: tribuna aranha é dentro da boca para posterior quelíceras na superfície dorsal entre quelíceras e endites (ver Foelix ²⁰ para anatomia aranha detalhada). Nota: A cada pulso, pernas contrato de aranha, e veneno será visível como gotículas claras emergentes de presas.
3. Colete veneno gotas com ponta microcapilar e transferência de ponta capilar em tubo 0,5 ml com água ou solução tampão (solução será sugado para capilar).
   Nota: evitar a perfuração de aranha com capilar que pode levar à contaminação hemolinfa e morte. Também evitar a contaminação do capilar com seda e cola das fiandeiras.
4. Anexar transferência seringa com adaptador tubo para microcapilar (pelo lado oposto à ponta coleção) e dsolução de veneno ispense de volta para dentro do tubo. Colocar o tubo em gelo.
   Nota: Descarte de capilares de resíduos em um recipiente para objectos cortantes nas proximidades.
5. Coloque aberto plástico coleta frasco, juntamente com a sua tampa, perto da aranha. Segure cuidadosamente as pernas de aranha com uma pinça de dissecação sem corte realizado em uma das mãos e dos penas cuidadosamente aberto forceps dentes com a outra mão, deslizando aranha em recolher frasco com uma pinça sem corte e fechar rapidamente cap. Continue com a próxima aranha e armazenar contendo veneno de tubos em freezer -80 ° C quando terminar.
   Nota: continuar a exercer cuidado ao mover a aranha das pinças para dentro do frasco. Certifique-se o frasco de coleta e boné é perto para a aranha para a sua transferência rápida e usar luvas.

5. Venom Gland dissecções

1. Dois a três dias após a colheita veneno, anestesiar aranha em CO ₂ câmara (veja o passo 3.1). Preencha transportador de nitrogênio líquido e coloque ao lado do microscópio de dissecação.
   Nota: when trabalhar com nitrogênio líquido, proteção ocular e uso luvas criogênicas.
2. Área de dissecção limpo e dissecando fórceps com uma solução que elimina RNase e DNA contaminação. Encha uma pequena placa de Petri sob microscópio de dissecação com dissecando tampão (por exemplo, citrato de sódio salino-1x (SSC) buffer).
3. Transferência de aranha a partir de CO ₂ câmara a placa de petri e utilize uma pinça para separar rapidamente o cefalotórax do abdômen.
4. Segure o cefalotórax sob o microscópio de dissecação com uma pinça e posicionar o quelíceras em campo de visão. Use as pontas afiadas de um segundo par de pinças para cortar cutícula juntar a carapaça para os aspectos laterais do quelíceras. Lateralmente apreender o quelíceras usando o segundo par de fórceps, e gentilmente puxar para trás e para frente até glândulas de veneno são puxados para fora.
5. Glândulas separado do quelíceras (ou deixe ligados a quelíceras se desejado) e transferir para um tubo cyrosafe 0,5 ml. Coloque clostubo ed em nitrogênio líquido.
   Nota: cada dissecção não deve demorar mais do que 15 min.
6. Repita dissecção com aranhas adicionais até terminar. Tubos de transferência de nitrogênio líquido em freezer -80 ° C.

A coleção de veneno e glândula de veneno dissecções são realizados com freqüência para caracterizar proteínas do veneno e peptídeos no nível seqüência 10,11,15. Recolhidas veneno também podem ser utilizados em ensaios fisiológicos para determinar as suas actividades funcionais 18. A recolha de veneno irá estimular a expressão do gene glândula de veneno, facilitando, assim, a clonagem de transcritos específicos de toxina através de RT-PCR 10,11. Identificação de proteínas do veneno também pode ser conseguida de uma maneira de alto rendimento, integrando técnicas de espectrometria de massa padrão com bases de dados de sequências geradas a partir de bibliotecas de cDNA da glândula de veneno 15,21. Um exemplo deste tipo de trabalho, a partir de veneno de glândulas e recolhidos utilizando o protocolo detalhado acima, demonstrando a sua eficácia, é ilustrada na Figura 1.

Venom coletadas de L. fêmeas adultas hesperus foi digerida com tripsina e sujeita a uma solução deAnálise mudpit, que liga HPLC (cromatografia líquida de alto desempenho) a espectrometria de massa em tandem (MS / MS). Aqui, a análise mudpit foi realizada pela Universidade do Arizona Proteomics Consortium. Massas de peptídeos detectados e seus fragmentos dissociados (íons filha, inferidas a partir de espectros) foram comparadas com sequências de peptídeos teoricamente previstos a partir de traduções de seqüências de DNA obtidos a partir de uma biblioteca de expressão de genes construídos a partir de L. hesperus glândulas de veneno (glândulas foram adquiridos pelo protocolo de dissecação descrito acima) 21. Nesta experiência, 36 proteínas foram detectadas a partir de todos os espectros recolhidos, no limiar de probabilidade de 99,9%, e continha pelo menos um péptido detectado. Uma das proteínas detectadas é suportado por 43 espectros total (espectros exemplar mostrada na Figura 1A), correspondente a três peptídeos exclusivos, cobrindo 35% da sequência da proteína (Figura 1B). A proteína detectada (traduzido a partir de um collecte d cDNA) tem um hit BLASTp cima para latrodectin de L. tredecimguttatus (número de acesso GenBank P49125.1), com uma pontuação de e-2e-46, e partes de 80% de identidade ao nível da sequência de aminoácidos com a proteína detectado nesta experiência. Latrodectin, que é também conhecida como proteína de baixo peso molecular, alfa-latrotoxina, é um componente do veneno reconhecido de viúva negra aranhas 22, 23, a verificação da eficácia do protocolo apresentado. Algumas proteínas identificadas a partir do veneno correspondem a sequências para as quais não hit BLAST é encontrado. Não está claro se tal resultado é devido aos recursos limitados disponíveis para genômicas aranhas, bem como a informação funcional limitada de suas proteínas, ou porque a proteína desconhecida representa um contaminante veneno. No entanto, a expressão do gene ou proteína analisa examinando a abundância de uma nova proteína, tais glândulas de veneno em relação a outros tecidos deveria revelar se se trata de um componente do veneno genuína.

O autor não tem nada a divulgar e sem interesses financeiros concorrentes.