Um método é apresentado para medir a velocidade do fluxo sanguíneo microcirculatório em metástases de câncer de pulmão da superfície pleural em ratos de forma automatizada, usando microscopia intravital pulmonar de tórax fechado. Este modelo tem potencial para ser usado como uma ferramenta amplamente difundida para realizar pesquisas fisiológicas sobre metástases pulmonares em roedores.
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Artigo de método
Automated Medição da microcirculação sanguínea velocidade na Pulmonar Metástases of Rats
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Resumo
Resumo
Como o pulmão é um dos principais órgãos-alvo da doença metastática, os modelos animais para estudar a fisiologia das metástases pulmonares são de grande importância. No entanto, existem muito poucos métodos até o momento para investigar metástases pulmonares de forma dinâmica no nível microcirculatório, devido à dificuldade de acesso ao pulmão com um microscópio. Aqui, um método de microscopia intravital é apresentado para obter imagens funcionais e quantificar a microcirculação de metástases pulmonares superficiais em ratos, usando uma janela pulmonar de tórax fechada e análise automatizada da velocidade e direção do fluxo sanguíneo. A utilidade deste método é demonstrada para medir aumentos na velocidade do fluxo sanguíneo em resposta à intervenção farmacológica e para obter imagens da conhecida vasculatura tortuosa de tumores sólidos. Esta é a primeira demonstração de microscopia intravital em metástases pulmonares em um modelo de tórax fechado. Devido à sua invasividade minimizada, bem como devido à sua relativa facilidade e praticidade, essa tecnologia tem o potencial de ser amplamente utilizada em laboratórios especializados em pesquisa de tumores pulmonares.
Introdução
O pulmão é um dos órgãos-alvo mais importantes da doença metastática e, como essa condição é difícil de tratar com sucesso com quimioterapia e radioterapia, a cura ainda é rara1,2. Características fisiopatológicas e microcirculatórias específicas de tumores sólidos primários e metastáticos, como hipóxia microrregional, limitação de difusão e vasculatura tumoral ineficiente, contribuem muito para sua resistência ao tratamento antineoplásico3,4. Devido à escala microscópica e à natureza dinâmica de parâmetros como o fluxo sanguíneo microvascular, a microscopia intravital do tumor no animal vivo tornou-se uma ferramenta de pesquisa muito importante no campo5. Embora modelos de microscopia intravital tenham sido aplicados a tumores em diferentes locais de órgãos, incluindo o pulmão metastático dentro de uma caixa torácica aberta, nenhum protocolo foi desenvolvido ainda para a pesquisa de metástases pulmonares em um ambiente de tórax fechado com preservação fisiológica6,7. Tal esforço é particularmente dificultado pela necessidade de acessar cirurgicamente a caixa torácica sem afetar a função geral do pulmão7-9. Recentemente, foi introduzido um método para obter imagens do fluxo sanguíneo microcirculatório pulmonar em um ambiente de tórax fechado em ratos vivos, usando microscopia intravital de fluorescência10. Esse protocolo permite a quantificação sistemática da velocidade do fluxo sanguíneo de hemácias injetadas marcadas com fluorescência, por meio de análise computadorizada, mantendo o animal fisiologicamente estável e preservando a integridade do pulmão11. No presente estudo, é mostrado como essa tecnologia pode ser modificada para obter imagens e quantificar o fluxo sanguíneo microcirculatório em metástases pulmonares inoculadas na veia da cauda na superfície pleural em ratos imunocomprometidos. Este modelo também é o primeiro a estudar tumores pulmonares metastáticos em um ambiente de microscopia intravital de tórax fechado.
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos relacionados animais descritos neste protocolo ter sido previamente aprovado pela Institutional Animal Care e Use Comitê da Universidade Duke (DUIACUC).
1. Cancer Cultura de Células e Injeção
- Cultivar células cancerígenas metastáticas marcados com fluorescência (por exemplo, células de câncer de mama MDAMB231-GFP humanos, dom de Dr. Patricia Steeg, NCI, e células de sarcoma rato YFP marcadas, presente do Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Department of Radiation Oncology) em meio de cultura apropriado (por exemplo, de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptavidina) a 37 ° C até cerca de 90% confluente.
- Tripsinizar células, lave-as duas vezes com PBS, contar e depois injetá-las na veia da cauda de 10 semanas de idade ratos nus femininos anestesiados com isoflurano em 5 milhões de células por animal, usando uma seringa com uma agulha 27 G. Anesthes Cirúrgico nívelIA é verificado pela falta de reação aos pés pinch.
2. O controlo das metástases com MicroCT
- Examinar ratos uma vez por semana utilizando um micro-CT / micro-irradiador, para detectar a presença de metástases acima de aproximadamente 2 mm de diâmetro de diâmetro. O micro-CT é comissionado, como descrito anteriormente 12.
- Ratos sujeitos a 3% de isoflurano anestesia antes da imagem. Confirme anestesia profunda por toe pitada.
- Após o início da anestesia, rápida transferência de ratos para o berço de imagem na câmara de imagem e se conectar através de um nariz-cone a uma mistura de isoflurano ao ar em 2,5-3%. Ajustar a posição do rato no suporte de uma maneira que a sua tórax é colocado no feixe de fotões do scanner MicroCT, utilizando os controlos de posição externos e delimitador do laser na base de imagens. Assegurar a porta para a câmara de imagem está fechada, para proteger o investigador dos raios gama.
- Controlar a posição do animal usando novamentea câmera de vídeo a cores. Realize uma baixa resolução exame de imagem CT prazo, e usar a imagem resultante para ajustar o campo de visão para as dimensões xyz da cavidade torácica.
- Imagem do tórax rato usando um filtro de 2 milímetros Al a 40 kVp, 2,5 mA, e 0,008 voxel às 7 FPS e devolver o animal para sua gaiola. Imagem de um animal deve ter não mais do que 15 ou 20 min. Não devolva um animal que passou por uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Confirmar metástases pela aparência de objectos relativamente radio-opaco, que não pode ser explicado por vasos sanguíneos intratorácicas (Figura 1A)
Cirurgia 3. Window Câmara
- Anestesia, sinais vitais e de uma veia da cauda
- Escolha animais com presença de doença metastática. Injectar animal com um d intraperitonealose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirme anestesia de nível cirúrgico por toe pitada antes de prosseguir.
Nota: Os protocolos de anestesia deve ser compensada com a respectiva configuração experimental. Pentobarbital foi escolhido aqui como um anestésico de ação longa, a fim de induzir a anestesia profunda para procedimentos demorados, além de oferecer a opção de re-dosagem fácil. No entanto, a perda de animais sobredosagem é um problema comum com anestesia de pentobarbital. Uma outra opção que preserva reflexos autonômicos a um grau maior do que o pentobarbital é cetamina, em combinação com o uso de sedativos como xilazina ou medetomidina, que no entanto só permite para um único ciclo de re-dosagem. - Raspar animais no lado do corpo que tem a doença metastática, e na área do pescoço, utilizando uma máquina de cortar. Limpe todos os restantes cabelo solto da pele. Depois de cabelo solto é removido, aplique pomada veterinária para os olhos, para evitar que sequem.
NOTA: ratos pelados atímicos pode ter cabelo residual que seja necessária aremoção res antes de prosseguir com os procedimentos cirúrgicos. É muito importante para remover todo o cabelo completamente, pois pode interferir com os procedimentos cirúrgicos e de imagem. - Corrigir o animal numa posição supina sobre uma placa metálica que é colocado sobre uma almofada de aquecimento de 37 ° C a água circula. As extremidades dianteiras e traseiras são fixados na placa com fita.
NOTA: É útil para controlar e registrar os sinais vitais, como batimentos cardíacos e oxigenação do sangue arterial, utilizando um oxímetro de pulso, ao longo de procedimentos cirúrgicos e experimentais.
- Escolha animais com presença de doença metastática. Injectar animal com um d intraperitonealose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirme anestesia de nível cirúrgico por toe pitada antes de prosseguir.
- A intubação traqueal
- A fim de colocar um cateter para a ventilação do animal, em primeiro lugar fazer uma incisão cutânea transversal do colo do útero, seguido pela separação mediana ventral da musculatura longitudinal para a traqueia.
- Use repetida acção de abertura-a-fecho com uma pinça afiada para criar uma passagem para o fio de sutura através do lado dorsal da traqueia.
- Fazer uma pequena incisão na traqueia em tele lado ventral, não mais do que semi-circular, aproximadamente entre o segundo e terceiro anel traqueal. Deixar um tempo suficientemente longo de parte da traqueia exposta na superfície dorsal, para permitir a fixação do cateter traqueal.
- Insira um 2,5 a 3,0 mm "Y" cânula traqueal na traquéia, e aperte com uma sutura de monofilamento 4-0. Assegurar a cânula está ligada a um ventilador de pressão cíclica, com uma garrafa ligada à conduta de validade que é preenchido com 6 cm de água, para manter a pressão pulmonar positiva. Fluxo de entrada de gás deve ser 100% de oxigénio, a menos que de outra forma desejada experimentalmente.
- Inserir um cateter com uma agulha G 25-27, e preenchido com solução salina heparinizada em uma das veias da cauda do rato, e fixar com fita adesiva.
Nota: certifique-patência do cateter na veia da cauda durante todo o procedimento por injecções sucessivas de uma pequena quantidade de soro fisiológico heparinizado na veia da cauda. Além disso, a intubação oro-traqueal, ou seja, a orientação de um traquealtubo através da boca do animal anestesiado e passado a laringe e a traqueia, é uma alternativa possível para o procedimento de traqueostomia que é descrito aqui. No entanto, este método requer treino e experiência especial, a fim de evitar danos para a traqueia, e também para impedir a canulação acidental do esófago.
- Aplicação da janela pulmonar
- Remover a pele do lado da caixa, onde a doença metastática é localizado, através da criação de uma incisão, e em seguida, retirar a pele utilizando uma dissecção romba.
Nota: A pele pode ser excisado e removido subsequente ao descolamento - Prossiga dissecando as duas camadas de musculatura sobrepondo (peitoral, serratus, e grande dorsal), mas deixando os músculos intercostais intacta. Criar uma perfuração na cavidade torácica de aproximadamente 1,5 cm de diâmetro, através da remoção de porções de tipicamente duas nervuras adjacentes. Idealmente, localize a perfuração da região do sexto e sétimo rIBS.
- Osteotomia:
- Para minimizar o sangramento e danos à superfície do pulmão, firmemente segurar a costela para ser cortado com uma pinça cirúrgica de dentes durante o corte. Utilizando uma tesoura cirúrgica, cortar o lado medial da primeira nervura, a um ângulo de aproximadamente 45 °, deixando o lado aguçado do osso remanescente nervura que aponta fora.
- Posteriormente, o corte lateral do osso do reforço de uma forma semelhante, de novo deixando o lado aguçado do osso nervura que aponta para o exterior, para evitar danos na superfície do pulmão.
- Repita o procedimento para a costela ao lado, em seguida, corte os músculos intercostais e remover a parte extirpada. Durante este procedimento, a manter a pressão pulmonar de forma que a interacção mecânica entre a superfície do pulmão e da caixa torácica é minimizado. Faça isso de forma adequada regulação da pressão inspiração no ventilador.
- Inserção da janela:
- Insira uma janela de pulmão feito à medida, que consiste em uma lamela que éligado a uma tomada de Plexiglas (Figura 1B). Anexar a janela para a tomada por meio de colagem, ou através da aplicação de uma quantidade muito pequena de gordura vácuo. Inserir a janela de uma forma que as metástases de superfície estão localizados perto do centro da janela. Se necessário, ajustar o furo inserido para trazer o micrometástases para o centro da janela através do alargamento do furo ligeiramente para o lado respectivo.
NOTA: A doença metastática na superfície pleural podem ser identificados como pontos brancos claramente reconhecíveis ou as zonas das partes coloridas de outra forma saudáveis rosa-salmão de superfície para o pulmão que aparecem predominantemente ao longo das fissuras. Enquanto micrometástases pode ocorrer em outras áreas do exterior pleural, as linhas de células investigadas quase sempre exibir tona micrometástases na área perfurada, uma vez que a doença metastática pode ser detectado radiologicamente. - Depois de inserir o soquete para a perfuração e criação de contato direto com a pleura visceral do lung, suturar as extremidades da moldura da janela para o músculo intercostal circundante, usando sutura de monofilamento 4.0 (Figura 1C). Use um ligeiro aumento de pressão inspiração no ventilador para ajudar ar residual para escapar e para criar um selo.
Nota: A taxa de respiração de ratos pode variar muito, dependendo do estado de anestesia, o estado de excitação ou ansiedade, concentração de oxigênio do ar inspirado (FiO 2), etc. É recomendável ajustar a taxa de respiração entre 70 e 90 bpm. A pressão de inspiração deve ser ajustada com cuidado e não ser ajustado para mais de aprox. 8 centímetros H2O (0,6 mmHg), a fim de evitar danos à superfície do pulmão.
- Insira uma janela de pulmão feito à medida, que consiste em uma lamela que éligado a uma tomada de Plexiglas (Figura 1B). Anexar a janela para a tomada por meio de colagem, ou através da aplicação de uma quantidade muito pequena de gordura vácuo. Inserir a janela de uma forma que as metástases de superfície estão localizados perto do centro da janela. Se necessário, ajustar o furo inserido para trazer o micrometástases para o centro da janela através do alargamento do furo ligeiramente para o lado respectivo.
- Posicione o animal em um limitador projetada que é projetado para eliminar Z-direcional movimento (Figura 1D) em uma placa de aço que está posicionado em uma termostática (elétrica) cobertor de aquecimento, sob um microscópio de fluorescência. Controlar o corpo do animaltemperatura utilizando um termistor rectal. Ajuste os parafusos do restrainer animal, ea pressão inspiração no ventilador para conseguir o controle ideal de movimento lateral.
Nota: A respiração natural em mamíferos envolve todos os três sentidos de circulação pulmonar e extensão peito: bilateral, dorso-ventral, e crânio-caudal. A fim de preservar o movimento de respiração natural, tanto quanto possível, é importante minimizar Z-direcional compressão na medida do necessário. Porque o sistema de retenção Z-dimensional tem o potencial para introduzir artefactos que possam afectar o fluxo de sangue e de outros parâmetros, é aconselhável manter as condições constantes durante série de medições repetidas no mesmo animal.
- Remover a pele do lado da caixa, onde a doença metastática é localizado, através da criação de uma incisão, e em seguida, retirar a pele utilizando uma dissecção romba.
4. Imaging and Measurement de Microcirculatory fluxo de sangue
- Coletar as células vermelhas do sangue através de punção cardíaca e rotulá-los com DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 = perclorato, 3 = -tetrametil-indocarbocianina), como descrito anteriormente 10.
- Injectar 300 ul de hemácias marcadas na veia da cauda do rato antes da cirurgia câmara de janela é feito para evitar o efeito de primeira passagem de adesão para a janela de vidro. Eliminar quaisquer bolhas de ar na seringa ou cateter, como a introdução de ar na veia irá inibir quaisquer outras injecções.
- Fluxo sanguíneo imagem com uma câmara CCD microscópio a -40 ° C chip de temperatura de arrefecimento, e aproximadamente 100X resolução geral (isto é, com uma objectiva de microscópio de 10x, 10x e pré-câmara ocular). Use padrão de filtro Rhodamine / TRITC sets (excitação 450-490 nm, emissão> 515 nm). Grave a resolução e taxa de quadros real de pixel as sequências de imagens resultantes. Grave, pelo menos, 200 (idealmente em torno de 300) imagens por pilha, para garantir a análise de sucesso da velocidade do fluxo.
- Reabastecer a perda de líquidos no animal através da injeção de aproximadamente 1 ml de solução salina IP cada hr.
NOTA: As configurações experimentais que envolvem uma intervenção, por exemplo,uma droga que altera a velocidade do fluxo sanguíneo em uma metástase do câncer pulmonar, exige medições repetidas de velocidade do fluxo sanguíneo em câncer metastático pulmonar. Para estas experiências prolongadas, é importante para repor o animal com fluido suficiente. - Eutanásia dos animais por infusão de 3 ml de 3N de KCl na veia da cauda
- Avaliar as pilhas de imagens usando um publicado, algoritmo de computador publicamente disponível baseado em Matlab que vai criar o fluxo de velocidade em tons de cinza e mapas de cor codificado para todo o fluxo de sangue traça 10,11. Posteriormente avaliar as imagens em tons de cinza resultantes usando software de análise de imagem comercial ou acessível ao público, tais como Imagem J, após limiarizar off valores que indicam nenhum movimento de células do sangue, ou seja, sem vasculatura ativa.
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Resultados
A vasculatura em tumores sólidos é conhecido por diferir significativamente de suprimento de sangue normal, mostrando maiores graus de tortuosidade e maiores distâncias intervasculares 13. Por conseguinte, as faixas de fluxo de sangue em metástases de cancro da mama e do sarcoma pulmonares experimentais têm formas irregulares e grandes lacunas intervasculares (Figura 2A, dois painéis inferiores) em comparação com a microcirculação pulmonar normal (Figura 2A, painel superior)....
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Discussão
Um modelo é apresentado que é viável a imagem muda em microcirculação outros processos dinâmicos em metástases pulmonares de ratos, o fluxo de sangue e, através de microscopia intravital e análise de fluxo sangüíneo computacional. Embora existam outros métodos para efectuar microscopia em pulmões expostos em caixas torácicas abertas de roedores, este modelo também é o primeiro a metástases pulmonares de imagem através de uma perfuração da parede torácica, num ambiente de tórax fechado. Usando este método, a viabilidade ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O conselho científico dos Drs. Timothy McMahon e Siqing Shan é apreciado. Os apresentadores agradecem aos Drs. David Kirsch e Patricia Steeg pelo generoso presente do sarcoma de camundongo marcado com fluorescência e células metastáticas MDAMB-231, respectivamente. Este trabalho foi financiado em parte pelo Prêmio Prime Número N66001-10-C-2134 da Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa dos EUA (DARPA) e em parte pelo Departamento de Oncologia de Radiação do Centro Médico da Universidade Duke.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ratos nus atímicos | Charles River | Código de cepa 316 | Ratos nus atímicos fêmeas de 10 semanas |
| micro-CT/micro-Irradiador | Raio X de precisão Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT para detectar metástases |
| DiI (1,1=-dioctadecil-3,3,3=,3=-perclorato de tetrametil-indocarbocianina) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Misture 100 ul de glóbulos vermelhos embalados com 100 ul de 0,5 mg/ml DiI em etanol de 200 provas, 2 ml de solução de dextrose a 5% em água e encha até um volume final de 10 ml com solução salina |
| Ventilador para roedores | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | O dispositivo é importante para manter a pressão pulmonar positiva após a aplicação do pneumotórax |
| Microscópio de fluorescência Zeiss Axioskop vertical | Zeiss | Axioskop | para imagem intravital |
| Andor CCD câmera | Andor | iXonEM 885 | CCD para imagens ao vivo do fluxo sanguíneo |
| Oxímetro de pulso | StarrLife | MouseOx | Oxímetro de pulso |
| Microscópio | de fluorescênciaMicroscópio de fluorescência Zeiss | Axioskop |
Referências
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Reimpressões e permissões
