Padrões de ativação de receptores olfativos codificar identidade odor, mas a falta de dados publicados que identificam ligantes olfativos para receptores olfativos mamíferos impede o desenvolvimento de um modelo abrangente de codificação odor. Este protocolo descreve um método para facilitar a identificação de alto rendimento de ligandos de receptores olfactivos e quantificação da activação do receptor.
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Artigo de método
De alta capacidade de análise de mamíferos olfativas Receptores: Medição do Receptor de ativação via luciferase Atividade
Neste artigo
Resumo
Resumo
Fragrâncias criar padrões únicos e sobrepostos de ativação do receptor olfativo, permitindo que uma família de aproximadamente 1.000 murino e 400 receptores humanos de reconhecer milhares de odorantes. Ligantes odorantes foram publicados para menos de 6% dos receptores humanos 1-11. Esta falta de dados é devido, em parte, às dificuldades funcionalmente que expressam estes receptores em sistemas heterólogos. Aqui, nós descrevemos um método para expressar a maioria da família do receptor olfactivo, em células Hana3A, seguido por uma avaliação de elevado rendimento de activação do receptor olfactivo utilizando um ensaio de repórter de luciferase. Este ensaio pode ser usado para (1) painéis de tela de odorantes contra painéis de receptores olfactivos; (2) confirmar a interação odorante / receptor via curvas de dose-resposta; e (3) comparar os níveis de ativação dos receptores entre variantes de receptores. Em nossos dados da amostra, 328 receptores olfativos foram triados contra 26 odorantes. Pares Odorant / receptores com diferentes contagens de resposta foram selected e testado em resposta à dose. Estes dados indicam que um ecrã é um método eficaz para enriquecer os pares odorante / receptoras que vai passar uma experiência de resposta a dose, isto é, os receptores que têm uma resposta bona fide para um odorante. Portanto, este ensaio de luciferase de alto rendimento é um método eficaz para caracterizar olfativo receptores de um passo essencial em direção a um modelo de codificação odor no sistema olfativo dos mamíferos.
Introdução
O sistema olfactivo dos mamíferos tem a capacidade de responder a um grande número de estímulos odoríferos, permitindo a detecção e a discriminação de milhares de odorantes. Receptores olfativos (RUP) são os sensores moleculares expressas pelos neurônios sensoriais olfativos no epitélio olfativo 12. Reconhecimento odor de mamíferos ocorre através da ativação diferencial das RUP por odores, ea família ou gene é extensa, com cerca de 1.000 murino e 400 receptores humanos 12-16. Análises funcionais anteriores do RUP em neurônios olfativos e em células heterólogas têm demonstrado que diferentes odores são reconhecidos pela única, mas a sobreposição ....
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Protocolo
1. Cultura de Células Hana3A
- Prepare a mídia M10, completando meio mínimo essencial (MEM) com 10% (v / v) de FBS.
- Cultura de manutenção
- Manter as células em meios de M10. NOTA: Os vetores de expressão para RTP1L, RTP2, REEP1 e G αolf conferir resistência puromycin às células Hana3A, mas mantendo as células com este antibiótico não afeta significativamente os resultados do ensaio.
- Subcultura a uma proporção de 1:08 em placas de 10 cm a cada 2-3 dias.
- Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2.
2. Células Plating para transfecção
- Mídia aspirado de 100% c....
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Resultados
Um ecrã primário testadas 328 RUP contra odores 26, a uma concentração de 100 uM. Esta concentração de odor tem sido demonstrada para activar de forma eficaz uma grande proporção de RUP com ligandos que se sabe 10. Primeiro, a actividade de luciferase normalizada foi calculada dividindo a leitura de luciferase de pirilampo pela da luciferase de Renilla leitura. Depois, os valores baseline foram calculados subtraindo as leituras de luciferase normalizada para o controle de odor a partir das leituras d.......
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Discussão
Identidade Odorant é codificada por padrões de ativação dos receptores olfativos, mas padrões de ativação dos receptores, incluindo os receptores que são ativados e em que grau, são conhecidos por menos de 6% dos receptores olfativos humanos 1-11. Os esforços para caracterizar receptores olfativos têm sido limitados por seus métodos de trabalho intensivo ou aplicabilidade a apenas um subconjunto da família de receptores olfativos 17,23,24,33,34. O sistema de expressão heterólogo Hana3A apoia a expr.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por R01 DC013339, R03 DC011373 e Ruth L. Kirschstein Serviço Nacional Research Award T32 DC000014. Uma parte do trabalho foi realizada através do Monell Chemosensory Receptor Signaling Core, que é suportado, em parte, pelo financiamento do P30 DC011735 NIH-NIDCD Núcleo Grant. Os autores agradecem C. Sezille para obter ajuda com a coleta de dados.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células Hana3A | Disponíveis no Laboratório Matsunami mediante solicitação | ||
| RTP1S-pCI | Disponível no Laboratório Matsunami mediante solicitação | ||
| M3-R-pCI | Disponível no Laboratório Matsunami mediante solicitação | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (sem Ca2+ e Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS |
| Tripsina (0,05% de tripsina EDTA) | Life Technologies | 25300 | Tripsina |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96-well PDL branco/transparente | placa BD BioCoat | 356693 | placas |
| Reagente de transfecção lipídica: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Substrato de luciferase de vaga-lume, supressor de luciferase de vaga-lume/Renilla substrato de luciferase: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2 |
| Software leitor de microplacas: Software de análise de dados Gen5 | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μ l GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5 μ l GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μ l GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5 μ l GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en& região=US">DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
Referências
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (199....
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Reimpressões e permissões
