Uma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema Cultura para estudar o desenvolvimento da tireóide

Resumo

Este protocolo descreve a dissecção do anlagen da tireoide embrionária de camundongo e a cultura de explantes em filtros semiporosos ou em lâminas plásticas de microscopia. Este sistema é ideal para estudar eventos morfogenéticos ou de diferenciação que ocorrem durante o desenvolvimento da tireoide de embriões selvagens ou knockout, e é passível de experimentos de ganho e perda de função.

Resumo

A tiróide é uma glândula endócrina bilobated localizada na base do pescoço, produzindo as hormonas da tiróide T3, T4, e de calcitonina. T3 e T4 são produzidos por tireócitos diferenciados, organizados em esferas fechadas chamadas folículos, enquanto que a calcitonina é sintetizado por células C, intercalados entre os folículos e uma densa rede de capilares sanguíneos. Embora arquitectura tiróide adulta e funções têm sido extensivamente estudada e descrita, a formação das unidades de "angio-foliculares", a distribuição de células C no parênquima e as comunicações parácrinas entre células epiteliais e endoteliais está longe de serem compreendidos.

Este método descreve os passos seqüenciais de rato tireóide embrionário anlagen dissecção e sua cultura em filtros semiporous ou em lâminas de plástico de microscopia. Dentro de um período de quatro dias, este sistema de cultura recapitula fielmente no desenvolvimento da tiróide in vivo. Com efeito, (i) bilobation do órgão ocorre (por explante E12.5), (ii) tireócitos precursores organizar-se em folículos e polarizar, (iii) tireócitos e diferenciar células C, e (iv) as células endoteliais presentes no tecido microdissecção proliferam, migram para a lobos da tireóide, e intimamente associado com as células epiteliais, como o fazem in vivo.

Tecidos da tireóide pode ser obtido a partir de tipo selvagem, nocaute ou embriões transgênicos fluorescentes. Além disso, a cultura de explantes pode ser manipulada pela adição de inibidores, anticorpos bloqueadores, factores de crescimento, ou até mesmo células ou meio condicionado. Ex vivo de desenvolvimento pode ser analisado em tempo real, ou a qualquer momento da cultura por imunocoloração e RT-qPCR.

Em conclusão, a cultura explante tireóide combinado com toda a jusante de montagem ou em seções de imagem e expressão gênica profiling fornece um sistema poderoso para manipular e estudar eventos morfogenéticos e diferenciação de tiróide organogenesis.

Introdução

A glândula tireóide é uma coleção de esferas epiteliais independentes, chamados folículos, cercado por uma densa rede de capilares endoteliais. Esta organização permite que a função da tireóide: capilares endoteliais fornecer tireócitos com iodo, necessários para T3 e T4 síntese de hormônios e distribuir estes últimos para todo o corpo. Espalhados entre os folículos capilares e, células C produzir o hormônio calcitonina hypocalcemic ^1. Embora a arquitetura e as funções da tireóide adulto são bem conhecidos, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento embrionário da tireóide (formação e diferenciação do folículo) estão longe de serem....

Protocolo

Ratos foram levantadas e tratadas de acordo com os princípios de cuidados com animais de laboratório do Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade. Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados por esta Comissão.

1. Revestimento de Microscopia de plástico Chambers Cultura

NOTA: Executar os seguintes passos sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. Os dois tipos de revestimento são funcionalmente equivalentes.

1. Câmaras de cultura Brasão de plástico com fibronectina um dia antes do isolamento dos tecidos de tireóide:
   1. Dilui-se a fibronectina, estéril até uma concentração final ....

Resultados

Anlages Tiróide (linha média e UB, juntamente com tecidos adjacentes), e os lóbulos da tiróide são dissecados a partir de embriões de rato E12.5 e no e13.5/e14.5, respectivamente (Figura 1). Após um dia de cultura no filtro, o primórdio da linha média é visível (Figura 2A), como um tecido alongado abrangendo no topo da traqueia. Ele forma progressivamente dois lobos de cada lado da traqueia. Se lobos tireoidianos isolados (E13.5 E14.5) ou são cultivadas, eles vão expandir-se, submeter-s.......

Discussão

Este artigo descreve um método para dissecar e cultivo de explantes de tireóide (E12.5) ou lóbulos (E14.5), a fim de estudar e compreender melhor os eventos complexos que levam à formação da tiróide. Devido à dupla origem do Anlagen tiróide (o primórdio da linha média e os dois corpos laterais Ultimobranquial), e seu pequeno tamanho, um fragmento de tecido E12.5 rostral localizada nas artérias arco da faringe, e contendo a traqueia, mas não o esófago é microdissectados. Tal como ilustrado, dentro de um período de quatro.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
µ-slide 8 bem, ibiTreat, cultura de tecidos tratada,	proxylab	estéril 80826
Colágeno Tipo I, cauda de rato	Millipore	08-115
Fibronectina de plasma humano	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Fio de tungstênio	Goodfellow	LS237450
inserção de placa de cultura (12 mm de diâmetro)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-caderina	BD Biosciences	610182	1/1.000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261