Uma Ex vivo Sistema Cultura para estudar o desenvolvimento da tireóide

Resumo

Este protocolo descreve a dissecção do anlagen da tireoide embrionária de camundongo e a cultura de explantes em filtros semiporosos ou em lâminas plásticas de microscopia. Este sistema é ideal para estudar eventos morfogenéticos ou de diferenciação que ocorrem durante o desenvolvimento da tireoide de embriões selvagens ou knockout, e é passível de experimentos de ganho e perda de função.

Resumo

A tiróide é uma glândula endócrina bilobated localizada na base do pescoço, produzindo as hormonas da tiróide T3, T4, e de calcitonina. T3 e T4 são produzidos por tireócitos diferenciados, organizados em esferas fechadas chamadas folículos, enquanto que a calcitonina é sintetizado por células C, intercalados entre os folículos e uma densa rede de capilares sanguíneos. Embora arquitectura tiróide adulta e funções têm sido extensivamente estudada e descrita, a formação das unidades de "angio-foliculares", a distribuição de células C no parênquima e as comunicações parácrinas entre células epiteliais e endoteliais está longe de serem compreendidos.

Este método descreve os passos seqüenciais de rato tireóide embrionário anlagen dissecção e sua cultura em filtros semiporous ou em lâminas de plástico de microscopia. Dentro de um período de quatro dias, este sistema de cultura recapitula fielmente no desenvolvimento da tiróide in vivo. Com efeito, (i) bilobation do órgão ocorre (por explante E12.5), (ii) tireócitos precursores organizar-se em folículos e polarizar, (iii) tireócitos e diferenciar células C, e (iv) as células endoteliais presentes no tecido microdissecção proliferam, migram para a lobos da tireóide, e intimamente associado com as células epiteliais, como o fazem in vivo.

Tecidos da tireóide pode ser obtido a partir de tipo selvagem, nocaute ou embriões transgênicos fluorescentes. Além disso, a cultura de explantes pode ser manipulada pela adição de inibidores, anticorpos bloqueadores, factores de crescimento, ou até mesmo células ou meio condicionado. Ex vivo de desenvolvimento pode ser analisado em tempo real, ou a qualquer momento da cultura por imunocoloração e RT-qPCR.

Em conclusão, a cultura explante tireóide combinado com toda a jusante de montagem ou em seções de imagem e expressão gênica profiling fornece um sistema poderoso para manipular e estudar eventos morfogenéticos e diferenciação de tiróide organogenesis.

Introdução

A glândula tireóide é uma coleção de esferas epiteliais independentes, chamados folículos, cercado por uma densa rede de capilares endoteliais. Esta organização permite que a função da tireóide: capilares endoteliais fornecer tireócitos com iodo, necessários para T3 e T4 síntese de hormônios e distribuir estes últimos para todo o corpo. Espalhados entre os folículos capilares e, células C produzir o hormônio calcitonina hypocalcemic ^1. Embora a arquitetura e as funções da tireóide adulto são bem conhecidos, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento embrionário da tireóide (formação e diferenciação do folículo) estão longe de serem compreendidos.

Durante a embriogênese, tireócitos progenitor origina como um espessamento (o primórdio da linha média) da parede ventral da endoderme foregut no dia embrionário (e) 8,5 no embrião de rato, enquanto células C progenitores originam em E11.5 como saliências em forma de gota ( o bo Ultimobranquialmorre) da quarta bolsas faríngeas ^2-6. O botão da linha média, em seguida, se desprende da endoderme, expande bilateralmente para fundir em E13.5 com os corpos Ultimobranquial de cada lado da traquéia. Finalmente, tireócitos organizar em folículos e células C diferenciar.

O conhecimento atual sobre a formação da tireóide vem principalmente da análise histológica dos tecidos fixos, mas os eventos morfogenéticos envolvidos na formação da tireóide são muito dinâmicos e envolvem comunicações e interações entre os diferentes tipos de células e com a matriz extracelular. Trabalhos recentes mostraram que os progenitores tirócito produzir níveis elevados de VEGF para recrutar células endoteliais para o desenvolvimento da tiróide, e, por sua vez, recrutados células endoteliais e promover a formação de folículo células C diferenciação ^7.

A maioria dos estudos in vivo ex sobre a tireóide foram realizados em células derivadas de tireóide adultos isolados, produzidas quer em 2D cultura de tecidos de plástico dparóquias ou em matrizes 3D. Usando esses tipos de culturas, as células foliculares diferenciados ou permanecem polarizadas e organizados como folículos ou reaquisição uma organização 3D ^8-10. No entanto, estas células epiteliais pura, explantadas de seu ambiente fisiológico, e cultivadas em 2D, ignorar as interacções com a matriz extracelular, citocinas, factores de crescimento e com outros tipos de células tais como as células endoteliais ou nervos que normalmente encontrar in vivo. Um estudo muito bom descreveu recentemente um protocolo de diferenciação de células-tronco embrionárias em folículos tireoidianos usando uma etapa final cultura em matrigel 3D ^11. No entanto, a falta de contacto com outros tipos celulares nestas culturas 3D.

Com base em experiência anterior no pâncreas e glândulas salivares de cultura de órgãos ^{de 12-14,} um método para dissecar rato embrionário Anlagen tiróide e cultivar os explantes sobre filtros semiporous ou em lâminas de microscopia de plástico foi desenvolvido.

Quandotrabalhar com embriões E12.5, a dupla origem da anlagen da tireóide (o primórdio da linha média e os dois corpos laterais Ultimobranquial) impôs a microdissecção de um grande fragmento de tecido. Este continha a traquéia, mas não o esôfago, e se estendia desde o arco faríngeo artérias até o inchaço aritenóide. Quando cultivadas em filtros, o primórdio da linha média se estende lateralmente de cada lado da traqueia, onde fundem com os corpos Ultimobranquial para formar os dois lóbulos da tiróide, ainda ligados por um estreito istmo.

Em cultura, as células epiteliais proliferam, organizam-se em folículos e diferenciam-se em tireócitos e células C, dependendo da sua origem. As células endoteliais contidas no tecido microdissecção também proliferam e invadem os lobos tireoidianos para finalmente associar estreitamente com a estrutura folicular epitelial, independentemente do fluxo de sangue ou fatores circulantes. Como o desenvolvimento dos explantes recapitula fielmente in vivo desenvolvermento, este sistema de cultura é ideal para estudar morfogenética e eventos de diferenciação que ocorrem durante o desenvolvimento da tiróide.

Tecidos da tireóide pode ser obtido a partir de tipo selvagem, nocaute ou embriões transgênicos fluorescentes, eo sistema de cultura é passível de experimentos de ganho de função de perda de e. Finalmente, time-lapse de imagens de explantes de tireóide fluorescente etiquetado em pratos de plástico de microscopia pode ser explorada para melhor investigar a cinética ea continuidade dos movimentos morfogenéticos que ocorrem in vivo. Time-lapse imagem já foi usada para estudar ramificação morfogênese do pâncreas ^15,16 ou broto ureteral ^17.

Protocolo

Ratos foram levantadas e tratadas de acordo com os princípios de cuidados com animais de laboratório do Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade. Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados por esta Comissão.

1. Revestimento de Microscopia de plástico Chambers Cultura

NOTA: Executar os seguintes passos sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. Os dois tipos de revestimento são funcionalmente equivalentes.

1. Câmaras de cultura Brasão de plástico com fibronectina um dia antes do isolamento dos tecidos de tireóide:
   1. Dilui-se a fibronectina, estéril até uma concentração final de 50 ug / ml, em meio M199 suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 0,25 mg / ml de fungizona e 2 mM de glutamina ^12.
   2. Cobrir os poços com 200 ul de fibronectina diluído e incubar durante a noite num frigorífico a 4 ° C.
   3. No dia da dissecção, aspirar a fibronectina, lavar os poços uma vez com M199 e adicionar um volume mínimo de 200 mL de M199 suplementado com antibióticos, glutamina e 10% de soro fetal de vitelo.
   4. Deixe as câmaras revestidas na incubadora até que esteja pronto para a chapa explantes.
2. Câmaras de cultura de plástico revestimento com colágeno tipo I de 2 horas antes do isolamento dos tecidos da tireóide:
   1. Diluir tipo estéril colagénio até uma concentração final de 50 ug / ml em HCl 10 mM. NOTA: Mantenha solução estoque de colágeno no gelo.
   2. Cobrir os poços com 200 ul de tipo I de colagénio diluído e incuba-se durante 2 horas à temperatura ambiente (RT).
   3. Aspirar o colagénio do tipo I solução, lavar os poços uma vez com M199 e adicionar um volume mínimo de 200 mL de M199 suplementado com antibióticos, glutamina e 10% de soro fetal de vitelo.
   4. Deixe as câmaras revestidas na incubadora até que esteja pronto para a chapa explantes.

2. Dissecção da tireóide Anlagen contendo tecidos (E12.5) ou tireóide Lobos (E13.5-e14.5)

NOTA: Use ferramentas de dissecação limpa e placas de Petri / cultura. Os passos gerais e incisões descritos abaixo são os mesmos para os embriões E12.5 e E14.5.

1. Sacrifício cronometrado grávida camundongos fêmeas na embrionário desejada (e) o dia (das E12.5 a E14.5) e remover o útero por meio de instrumentos de dissecação.
2. Colocar o útero dissecado em uma placa de 10 cm, que inclua HBSS.
3. Segurar uma extremidade do útero com uma pinça e abrir o útero com pequenas tesouras para libertar progressivamente todos os embriões.
4. Separa-se os embriões a partir de placenta com uma tesoura e transferir os embriões com as suas membranas extraembryonic numa nova placa de 10 centímetros contendo HBSS.
5. Retire o saco vitelino e âmnio. NOTA: A partir deste ponto, trabalhar sob um microscópio estereoscópico com transillumination abaixo; aumentando a ampliação com passos de dissecação. Use agulhas de tungstênio em capilares de vidro como dissecando ferramentas.
6. Usando as agulhas comogarfo e faca, retire a parte superior da cabeça, incluindo a mandíbula superior e os ouvidos (Figura 1A, corte ao longo de uma).
7. Segurar o embrião em sua volta e remover primeiro uma peça adicional de tubo neural (Figura 1A, cortado ao longo de b), em seguida, a parte inferior do embrião, logo abaixo dos membros anteriores e acima do coração (Figura 1B).
8. Transfira a fatia contendo embrião da língua (para orientar o tecido) e na região do pescoço em uma nova placa de 10 centímetros contendo HBSS.
9. Remover o tubo de tecidos neurais e posterior ao esófago / traqueia (Figura 1C, cortado ao longo de um).
10. Suavemente secção da fatia de tecido ao longo de ambos os lados da lingueta (Figura 1C, cortado ao longo de B e B ').
11. Localize o esófago e a traqueia, no prolongamento da lingueta, e dissecar afastado da língua, deixando o aritenóide inchaço (Figura 1E, cortado ao longo de um), e o tecido no both lados do esófago / traqueia (Figura 1E, cortado ao longo de B e B ').
12. Retire o esôfago, e coloque a traquéia com o lado ventral para cima.
13. Dissecar embora os tecidos não desejados, tais como o timo (Figura 1E) e todos os tecidos localizados lateralmente ao arco artérias da faringe. Para E13.5 ou embriões E14.5, visualizar os lóbulos da tiróide em cada lado da traqueia (Figura 1F; linhas pontilhadas vermelho) e dissecar ainda mais os lóbulos da traqueia.
14. Transferir a região E12.5 traqueia isolada, ou os lóbulos da tiróide E13.5-E14.5 numa placa de cultura de 35 milímetros contendo meio de pré-aquecido M199 suplementado com antibióticos, glutamina e 10% de soro fetal de vitelo. Explantes de transferência usando uma ponta de filtro prewetted em um P-200 micropipeta. Para explantes E12.5, corte a extremidade da ponta para alargar a abertura. NOTA: Rotineiramente, e se os embriões têm o mesmo genótipo, execute os passos 6 e 7 em todos os embriões, on 9-11, e, finalmente, 12 e 13.

3. Chapeamento e Cultura de explantes da tireóide

1. Lave os explantes por transferência sucessiva de três cavidades de uma placa de 24 poços contendo 1 ml de meio de cultura pré-aquecido (= M199 suplementado com antibióticos, glutamina e 10% de soro fetal de vitelo).
2. Chapeamento de lobos da tireóide sobre câmaras de cultura de plástico revestidas de microscopia:
   1. Aspirar M199 meio de cultura das câmaras revestidas.
   2. Cuidadosamente, transferir os explantes de tireóide nas câmaras de cultura, utilizando uma micropipeta e filtro dicas. Colocar um explante no centro de cada uma das câmaras.
   3. Remover o excesso de meio e colocar a câmara de cultura numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante 2 horas para permitir que os explantes anexar à matriz.
   4. Adicionar cuidadosamente de 200 a 300 ul de meio de cultura pré-aquecido a cada poço.
   5. Incubar durante a cultura a longo prazo na incubadora de cultura de tecidos.
3. Chapeamento of região traquéia ou da tiróide lobos em filtros semiporous:
   1. Encher o número de cavidades de uma placa de 24 poços com 330 ul necessária de meio de cultura de pré-aquecido.
   2. Filtros lugar (por exemplo, 0,4 mM filtro Millipore) no meio, tomando cuidado para evitar aprisionamento de bolhas de ar abaixo do filtro de cultura.
   3. Cuidadosamente, utilizando uma micropipeta e pontas de filtro, transferir os explantes da tiróide com um volume mínimo de meio para o centro dos filtros (máximo 4/filter).
   4. Retire o excesso de médio e espaço os explantes com uma agulha de tungstênio.
   5. Incubar durante a cultura a longo prazo na incubadora de cultura de tecidos. NOTA: Alterar meio de cultura a cada dois dias sob a capela de fluxo laminar. Cultura explantes de até 7 dias.

4. Todo-mount Imunofluorescência Coloração Protocolo para explantes da tireóide

Desalojar explantes cresceram em filtros (depois do passo 2 abaixo), utilizando as agulhas de tungsténio ouuma pinça fina e transfere-se uma placa de 24 poços para todos os passos, excepto para o primário (passo 5) e secundário (passo 7) incubações do anticorpo (placa de 96 poços). Para explantes aderentes cultivadas em câmaras de plástico de microscopia, execute todas as etapas nas câmaras de cultura.

1. Aspirar M199 meio de cultura e corrigir o explante com gelado de 4% paraformaldeído (PFA) por 20 min (500 mL em 24 poços prato e 300 mL em lâminas de microscopia).
2. Lavar 2x 10 min em solução salina tamponada TRIS com Triton (TBST, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1% de Triton X-100) à temperatura ambiente.
3. Processar os explantes imediatamente ou armazenar a -20 ° C. NOTA: Para o armazenamento a longo prazo a -20 ° C, desidratar os explantes em metanol aumentando gradualmente a concentração de metanol em TBST para atingir 100% de metanol. Quando estiver pronto para continuar com a imunomarcação (passo 4), hidratar os explantes, adicionando gradualmente TBST para metanol.
4. Substituir TBST com a solução de bloqueio (10% de soro normal de cabra em TBST) E incuba-se em um balancim mar-serra durante 30-60 min à temperatura ambiente.
5. Dilui-se o anticorpo primário em solução de bloqueio (100-200 ul por condição). Transferir os explantes de "filtro" de uma placa de 24 poços para uma placa de 96 poços. Incubar explantes com os anticorpos primários sobre um roqueiro mar-serra durante a noite a 4 ° C.
6. No dia seguinte, descartar a solução de anticorpo primário, transferir os explantes de "filtro" de volta em uma placa de 24 poços, e lava-se, pelo menos, cinco vezes com TBST num agitador mar-serra para 45-60 minutos cada à temperatura ambiente.
7. Dilui-se anticorpo secundário (por exemplo, anticorpo de cabra anti-X-Alexa Fluor em diluição 1:2000) em TBST contendo 1% de soro normal de cabra e incubar os explantes com esta diluição durante a noite num agitador de mar-serra, a 4 ° C e no escuro. Para coloração de contraste nuclear incluem um ug / ml de bis-benzimida (Hoechst) em conjunto com a solução de anticorpo secundário.
8. No dia seguinte, descartar a solução de anticorpo secundário e lavar 5x com TBST em um mar-serrabalancim para 45-60 min cada em temperatura ambiente. Durante as lavagens, manter os explantes no escuro.
9. Realizar uma lavagem adicional em TBST agitação suave durante a noite a 4 ° C no escuro.
10. Sufixo os explantes imunocoradas em PFA a 4%, a 4 ° C durante 10 min.
11. Lavar 2x 10 minutos com TBST.
12. Transferir os explantes ou gradualmente em metanol 100% para o armazenamento a longo prazo a -20 ° C, ou imediatamente analisar. Para explantes cultivados em filtros, e imunocoradas em uma placa de 24 poços, em uma câmara de transferência de microscopia (por exemplo LabTek ou Ibidi) com TBST ou melhor meio de montagem antes da análise de fluorescência com um microscópio confocal ou Multiphoton.

5. Extração de RNA a partir de tiróide

Trabalhar em um ambiente livre de RNase. Portanto, use ácido nucleico e nuclease livre pontas de pipeta e limpe ambos bancada e equipamentos de contaminantes e RNases. Este protocolo de ser baseado em fenol / clorofórmio, realizar a primeira etapas (1 a 7), sob um capuz químico.

1. Homogeneizar um explante tireóide ou dois lobos da tireóide com 300 ml de solução de extração de RNA usando um pilão descartável para 1,5 ml tubo. Entre amostras, lavar o pilão em SDS a 2%, depois com água, em seguida com etanol.
2. Adicionar mais 100 mL de solução de extracção de ARN, vortex 10 seg e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
3. Vortex durante 30 segundos e adiciona-se 20 ng de tRNA de cada amostra.
4. Vortex durante 1 min e adicionar 80 ul de clorofórmio.
5. Vortex vigorosamente durante 30 segundos e incubar 15 min a RT.
6. Centrifugação durante 15 min a 19.000 x g num (4 ° C) centrífuga refrigerada.
7. Transferir cuidadosamente a fase aquosa superior incolor com um novo tubo contendo 20 ug de glicogénio como co-precipitante.
8. Vortex e adicionar 200 mL de 100% de álcool isopropílico.
9. Vortex vigorosamente durante 15-30 segundos e deixar precipitado de ARN, a -20 ° C durante 2-3 horas ou a -80 ° C durante 1 hora.
10. Girar durante 30 min a 19.000xg, a 4 ° C, e eliminar o sobrenadante.
11. Lavar o sedimento com 450 ul de etanol frio a 75% e vortex para desalojar o sedimento.
12. Centrifugação durante 10 min a 19.000 xg, a 4 ° C, e eliminar o sobrenadante.
13. Seca-se o sedimento sob o capô, durante 5 min.
14. Ressuspender o sedimento com 10 ml de água isenta de RNase e incubar 10 min a RT.
15. A concentração do RNA ensaio, armazenar a -80 ° C ou a transcrição reversa para análise da expressão do gene.

Resultados

Anlages Tiróide (linha média e UB, juntamente com tecidos adjacentes), e os lóbulos da tiróide são dissecados a partir de embriões de rato E12.5 e no e13.5/e14.5, respectivamente (Figura 1). Após um dia de cultura no filtro, o primórdio da linha média é visível (Figura 2A), como um tecido alongado abrangendo no topo da traqueia. Ele forma progressivamente dois lobos de cada lado da traqueia. Se lobos tireoidianos isolados (E13.5 E14.5) ou são cultivadas, eles vão expandir-se, submeter-s...

Discussão

Este artigo descreve um método para dissecar e cultivo de explantes de tireóide (E12.5) ou lóbulos (E14.5), a fim de estudar e compreender melhor os eventos complexos que levam à formação da tiróide. Devido à dupla origem do Anlagen tiróide (o primórdio da linha média e os dois corpos laterais Ultimobranquial), e seu pequeno tamanho, um fragmento de tecido E12.5 rostral localizada nas artérias arco da faringe, e contendo a traqueia, mas não o esófago é microdissectados. Tal como ilustrado, dentro de um período de quatro...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
µ-slide 8 bem, ibiTreat, cultura de tecidos tratada,	proxylab	estéril 80826
Colágeno Tipo I, cauda de rato	Millipore	08-115
Fibronectina de plasma humano	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Fio de tungstênio	Goodfellow	LS237450
inserção de placa de cultura (12 mm de diâmetro)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-caderina	BD Biosciences	610182	1/1.000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261