Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

Summary

Ensaio de adesão estático é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para modelar as interacções entre linfócitos T e de outros tipos de células. Interacções são geradas por injecção de células T marcadas em poços revestidos com moléculas de adesão, enquanto que um leitor de placa é utilizada para quantificar o número de células aderentes a seguir lavagens em série.

Abstract

Adesão de linfócitos T é necessária para várias funções das células T, incluindo a migração para os locais de inflamação e formação de sinapses imunológicas com células apresentadoras de antigénios. As células T realizar adesão regulada através do controlo das propriedades adesivas de integrinas, uma classe de moléculas de adesão celular que consistem de pares heterodiméricas de proteínas transmembranares que interagem com moléculas-alvo de células parceiras ou matriz extracelular. O mais proeminente a integrina da célula T é a função dos linfócitos antigénio associado (LFA) -1, composta por subunidades aL e β2, cujo alvo é a molécula de adesão intracelular (ICAM) -1. A capacidade de uma célula T para controlar a aderência deriva da capacidade para regular os estados de afinidade de integrinas individuais. Sinalização dentro para fora descreve o processo pelo qual os sinais dentro de uma célula com que os domínios externos de integrinas para assumir um estado activado. Muito do nosso conhecimento destes fenómenos complexos é baseada na mecânicaEstudos realizados em simplificada em sistemas de modelo in vitro. O ensaio de adesão de linfócitos T descrito aqui é uma excelente ferramenta que permite que as células T para aderir a moléculas alvo, sob condições estáticas, e, em seguida, utiliza um leitor de placas fluorescente para quantificar a adesividade. Este ensaio tem sido útil na definição de substâncias de adesão-estimulador ou inibidor que actuam sobre os linfócitos, assim como a caracterização dos eventos de sinalização envolvidos. Embora descrito aqui para LFA-1 - ICAM-1 de adesão mediada; este ensaio pode ser facilmente adaptada para permitir o estudo de outras interacções adesivas (por exemplo, VLA-4 - fibronectina).

Introduction

Linfócitos T aderência é um processo fundamental para a resposta imune ^1. É necessário para a interacção das células T com as células endoteliais decoração nas paredes dos capilares, para o antigénio de células apresentadoras de varrimento (APC) dentro de nódulos linfáticos, e para a formação de sinapses imunológicas (IS), com células-alvo ^2. Estes requisitos são funcionalmente e cineticamente distintas. O processo de linfócitos extravasamento consiste quimioatração, rolamento, adesão firme e transmigração. A transição a partir de rolamento para firmar aderência requer as células T de responder a um sinal de receptor acoplado a proteína G rapidamente. Esta resposta produz uma interação ligante integrina que retarda e prisões da célula de rolamento ^3. Uma mudança imediata na avidez integrina medeia este processo. A migração requer interacções betweenTcells dinâmicos e células endoteliais com a formação de aderências no 'front end "e quebra de aderências no' extremidade traseira 'com um intervalo de cerca de um minuto entre a formação e quebra ^4. O IS constitui inminutes, mas precisa permanecer intacta por horas ^6.

Curiosamente, uma molécula de adesão, a função de membro da família de linfócitos integrina antígeno associado (LFA) - 1, é essencial para todos estes processos ^5. LFA-1 medeia a adesão através de interacções com vários membros da superfamília das imunoglobulinas. O ligando mais extensivamente estudado com a mais elevada afinidade para o LFA-1 é a molécula de adesão intercelular (ICAM) -1. Linfócitos circulantes não-activadas expressam baixa afinidade de LFA-1 na superfície das células, e, por conseguinte, não são capazes de aderir a superfícies revestidas de ICAM-1. LFA-1 é de afinidade variável e regulada por vários eventos de sinalização, tais como a proteína G acoplado a activação do receptor, estimulação de citoquinas, e os sinais mediados pelos receptores das células T (TCR). A forma de afinidade elevada, resultante da LFA-1 transmite activação intracelular para o espaço extracelular tinteracções hrough com ICAM-1. Este caminho é chamado de dentro para fora sinalização ^7. Do mesmo modo, a sinalização através de LFA-1 a partir do espaço extracelular é chamado de fora para dentro de sinalização.

O cascatas de sinalização intracelular envolvidas na de dentro para fora e de fora para dentro de sinalização são um grande foco de pesquisa atual. A pequena GTPase Rap1 surgiu recentemente como o componente chave de dentro para fora sinalizando que é comum a ambos ligadura TCR e citocina sinalização ^8. O papel crítico da Rap1 na activação de integrina é realçada pela descoberta de que a sobre-expressão de Rap1 estimula a adesão dependente de integrina de células T, enquanto que a adesão de células T é bloqueada através da expressão de Rap1 dominante negativa ^9. Esses avanços em nossa compreensão da regulação integrina por Rap1 ter sido realizado utilizando em ferramentas vitro. Entre elas, está o ensaio de adesão estático descrito aqui.

O objetivo geral deste método é estudar Tadesividade de células a ICAM-1 as superfícies revestidas. Mais especificamente, é utilizado para medir e quantificar objectivamente LFA-1 de afinidade para com os seus ligandos de contador em células vivas em tempo real, sob diferentes condições. Esta técnica utiliza poços de poliestireno revestidas com ICAM-1, para imitar as superfícies celulares que as células T interagem com. Muitos ensaios de adesão de células T estático anteriormente descritos foram experimentalmente complexo. Estes ensaios frequentemente requeridos para as células T a ser marcado radioactivamente, utilizado células da córnea de bovino em cultura para criar uma matriz extracelular como o substrato para a aderência das células T, ou chamados para a estimulação não-fisiológico de células T durante um período prolongado para promover a adesão de células T ^10. A utilização de medição fluorométrico para quantificar as células T após a incubação de adesão é um método mais sensível e precisa de quantificação, em comparação com a citometria de fluxo e microscopia, que são utilizados em muitos outros sistemas de ensaio ^11. Além disso, uma única célula microscopic análise de integrina localização não permite a ampla, a análise da população com base na mesma maneira como a medição f luorométrica. Enquanto que os anticorpos específicos do Estado de LFA-1 de activação estão comercialmente disponíveis, estes anticorpos oferecer uma baixa sensibilidade em relação com o método descrito aqui. A principal vantagem sobre as técnicas alternativas é a sua simplicidade e a capacidade de analisar múltiplas condições experimentais simultaneamente. Ao considerar este método para uma aplicação específica, deve-se levar em conta que as células T devem ser selecionados de forma negativa, recentemente isolado, e marcadas com um marcador fluorescente.

Protocol

1. O revestimento das microplacas Poços

Nota: O objectivo deste passo é o de revestir as superfícies de poliestireno com ICAM-1 e servem como ligandos para as células T LFA-1.

1. Prepare as seguintes soluções:
   1. Preparar a solução de revestimento por ressuspensão recombinante de ICAM-1 com a solução (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 2 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,4) tampão fosfato salino enriquecido com cálcio (1 mM _CaCl2) e magnésio (2 nM de MgCl _2). Certifique-se de que a concentração final de ICAM-1 é de 10 ug / ml, feito a partir de uma solução de estoque de 0,7 mg / ml e mantidas em um congelador a -80 ° C.
   2. Preparar a solução de adesão, através do enriquecimento de PBS com 0,5% de humano (ou de bovino) de albumina sérica humana (HSA / BSA), MgCl2 _{2 mM,} e 1 mM de _CaCl2.
   3. Preparar a solução de lavagem através da adição de 2 mM de _MgCl2 e 1 mM de _CaCl2 a PBS. Aqueça todas as soluções para 37° C antes do uso.
2. Lavar as placas com 24 poços com 50 mL de solução de lavagem. Isso irá incluir poços não lavados, (PMA) trataram células positivas e (poços não revestidos) negativos controles. Para cada condição de definir pelo menos três poços (triplas).
3. Adicionar 50 ul de solução de revestimento, para cada poço. Não adicione aos poços de controlo não revestidos. Incubar durante uma hora a 37 ° C no interior da incubadora.
4. Aspirar suavemente a solução de revestimento, sem que a ponta para tocar no fundo dos poços. Lavar uma vez com 50 ul de solução de lavagem.
5. Adicionar 50 ul de solução de adesão e incubar a microplaca durante uma hora a 37 ° C no interior da incubadora.
6. Aspirar suavemente e lave uma vez com 50 mL de solução de lavagem. Usar a placa no mesmo dia, no entanto, é possível manter a 4 ° C durante a noite, e usá-lo no dia seguinte.

2. T o isolamento de células a partir de sangue

1. Adicionar humano T enriquecimento célula coquetel em 50 ul / ml of sangue inteiro (por exemplo por 3 ml de anticoagulante (heparina, EDTA, ou citrato) de sangue total, adicionar 150 mL de cocktail). Misture bem.
2. Incubar 20 min a temperatura ambiente.
3. Para um tubo de centrífuga de 50 ml adicionar 3 ml de sangue tratado e um volume igual de PBS (sem cálcio e magnésio) enriquecido com 1% de D-glucose, à temperatura ambiente. Misture delicadamente com uma pipeta Pasteur.
4. Adicionar 15 ml de Ficoll-Paque PLUS para o tubo de centrífuga.
5. Camada cuidadosamente os 6 ml diluído amostra de sangue no meio de isolamento de linfócitos.
6. Centrifugar a 400 xg por 20 min a 20 ° C, com pausa fora.
7. Decantar a camada superior com uma pipeta de Pasteur limpa, deixando a camada de linfócitos não perturbada na interface. Se a camada superior de plasma pode ser guardado para uso posterior. Utilizando uma pipeta de Pasteur limpa transferir a camada de linfócitos para um tubo de centrífuga limpo.
8. Adicionar 3 volumes (9 ml) de PBS para os linfócitos. Suspender as células suavemente draala-los dentro e para fora de uma pipeta de Pasteur.
9. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 20 ° C.
10. Remover o sobrenadante. Os linfócitos deve agora ser suspensos no meio apropriado para a aplicação. Transferência das células para um balão de cultura T-75, em 20 ml de RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina.

3. Preparação das Células

Nota: Um pré-requisito é de que as células a ser marcado com um reagente fluorescente. Neste protocolo usar carboxi éster succinimidyl fluoresceína (CFSE), proteína fluorescente no entanto verde (GFP) são células que expressam uma alternativa aceitável.

1. Contagem de 2,4 x 10 ⁶ células T (1 x 10 ⁵ para cada poço) usando um hemocitômetro.
2. Ressuspender as células em meio de cultura sem soro (privação de soro). Incubar as células durante 2 horas na incubadora a 37 ° C.
3. Centrifugar as células durante 5 min (400 xg). Aspirar a mídia eressuspender em 1 ml de PBS.
4. Adicionar CFSE em 1:1.000 diluição (estoque feito para 5 mM). Cubra de luz e incubar durante 8 minutos à temperatura ambiente.
5. Parar a reacção por adição de 10 ml de 37 ° C, PBS e girar a 400 xg durante 5 min.
6. Re-suspender a pelete de células com 1,2 ml de solução de adesão pré-aquecido (1 x 10 ⁵ células por 50 pi).

4. Estimulação das células

Nota: Para iniciar a adesão, as células devem ser estimuladas. Na experiência seguinte, as células são estimuladas através do TCR utilizando anticorpos anti-CD3 de reticulação, no entanto, solúveis SDF-1 pode servir como uma alternativa. Dependendo do objetivo dos experimentos, vários reagentes farmacológicos pode ser adicionado antes ou durante a estimulação para estudar o impacto na adesão celular. Forbol miristato acetato de forbol (PMA) é um éster de forbol que é estruturalmente semelhante ao do segundo mensageiro diacil glicerol (DAG) e, por conseguinte, activa quinase múltiplas a jusante do TCR (principalmente proteína cinase C); aqui é usado como um controlo positivo.

1. Aquece-se a microplaca a 37 ° C.
2. Dividir as células em 8 vazios tubos de 1,5 ml (150 ul em cada tubo), um tubo para cada condição.
3. Tratar as células em conformidade:
   1. Estimular um tubo com PMA a 10 ng / ml para servir como controlo positivo. Mantenha três tubos sem tratamento, para servir como controle de estímulo ("nenhum estímulo"), controle de carga sujo ("sem lavagem"), e controle para ICAM-1 revestimento ("sem revestimento").
   2. Estimular quatro tubos com diferentes concentrações de anticorpos anti-CD3 (0,1, 1, 5, e 10 ug / ml). Continue para a próxima etapa, sem atrasos.
4. Alíquota de 50 mL de mistura de células estimuladas em cada poço vazio. O número final de células por cavidade é de 1 x 10 ^5.
5. Coloque a microplaca na incubadora 37 ° C por 15 min.
   Nota: Algumas linhas de células T requerem menor estimulação tempo ção. Durante este tempo, as células vão estabelecer-se para o fundo dos poços e aderir aos ligandos-alvo.

5. Lavar células não aderentes

Nota: O objetivo deste passo é remover as células que não foram capazes de formar contactos estreitos com as superfícies recobertas pelo ligante. Usar uma pipeta de canais múltiplos para este passo, a fim de assegurar que as mesmas forças físicas são aplicados a todos os poços. É importante manter os poços de controlo indicados unwashed para auxiliar no cálculo da percentagem de células aderentes.

1. Adicione 150 ml de solução de aderência quente para cada poços. Agitar a placa suavemente durante alguns segundos antes de remover o meio dos poços. Não toque no fundo dos poços com as pontas.
2. Repita este passo três vezes. Mude a direção da pipeta ao pipetar o buffer de entrada e saída.

6. Determinação da percentagem de células aderentes

_content "> Nota: Neste passo um leitor de placas de fluorescência é usado para medir a intensidade de fluorescência dentro de cada poço a intensidade está em correlação directa com o número de células aderentes..

1. Ligue o leitor de placas. Abra o software leitor de placas, clicando no ícone de atalho na área de trabalho.
   1. No menu "Tarefas", clique em "Novo" para criar um novo protocolo.
   2. A partir do menu "Ações", escolha a opção "Read". Clique em "A intensidade de fluorescência" e clique na aba "Ok".
   3. A partir do menu drop-down selecione "comprimento de onda de excitação 485" e "Emissão de comprimento de onda 528". Hit na guia "Ok".
   4. No menu de opções "Óptica", selecione "Bottom" e clique na aba "Ok". Volte ao menu "Ações" e definir a temperatura a 37 ° C e clique em "Ok".
   5. Insira a microplaca no leitor de placa eclique em "Executar". O resultado será exportado para planilha excel.
2. Calcula-se a percentagem de células aderentes utilizando a seguinte fórmula: Percentagem de células aderentes = (média intensidade de fluorescência lida em poços lavados) / (média intensidade de fluorescência lida em células não lavadas) x 100%.

Results

Abaixo está um exemplo de ensaio de adesão usando células T primárias estimuladas com várias concentrações de anticorpos anti-CD3. É útil saber a fluorescência das células não lavadas (isto é, a carga total). As células não estimuladas servir como um controle negativo e células tratadas com PMA são o controlo positivo para anticorpos anti-CD3. As células plaqueadas em poços não-revestidos servir como um controlo para a ICAM-1. Numa experiência típica, a percentagem de células tratadas com PMA aderentes é entre ...

Discussion

Existem diversos ensaios para estudar os sinais de LFA-1 a activação e a adesão de células T ^12. A citometria de fluxo é utilizada para medir a LFA-1 estados de afinidade em células vivas, utilizando anticorpos monoclonais que se ligam selectivamente, quer dobrado ou estendido a LFA-1. Uma das limitações deste método é que ele não leva em conta a avidez dos integrinas. Ensaios de migração são ferramentas úteis, mas eles medem a migração, e não adesão desprezível em um ponto de tempo específico. Modelos de rat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leitor de placas	BioTek	Synergy H1 Pipeta
	Fisher	21-377-829
Microplaca de 96 poços com fundo óptico	Corning Costar	3603
ICAM-1 recombinante	R& D Systems	ADP4-050
Anticorpos anti-CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Molecular Probes	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS contendo cálcio e magnésio	Gibco
Linfócitos periféricos	por exemplo camundongo ou humano
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 software	BioTek	Versão 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
Tubos de centrífuga de 15 e 50 ml	Fisher	352099, 352070
Pipetas de plástico descartáveis Pasteur Frascos	Fisher	13-711-7M
T-75	Fisher	50-754-1366
RosetteSep Kit de enricment de células T	StemCell Technologies	15061