Medir o coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) de células pode ajudar a compreender os mecanismos de regulação de aquaporinas (AQPs). P f determinação em protoplastos de células de plantas esféricas aqui apresentados protoplastos envolve o isolamento e análise numérica da sua velocidade inicial da alteração de volume, como um resultado de um desafio osmótica constante durante a perfusão de banho.
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Artigo de método
Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudar mecanismos de regulação AQP é crucial para a compreensão das relações de água, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Apresentada aqui é um método simples e muito eficiente para a determinação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) em protoplastos de plantas, em princípio aplicável também a outras células, tais como esféricas oócitos de rã. A primeira etapa do ensaio é o isolamento de protoplastos a partir do tecido de planta de interesse por digestão enzimática para uma câmara com uma solução isotónica adequada. A segunda etapa consiste em um ensaio de desafio osmótica: protoplastos imobilizados no fundo da câmara é submetido a uma perfusão constante de partida com uma solução isotónica e seguido de uma solução hipotónica. O inchaço da célula é de vídeo gravado. Na terceira etapa, as imagens são processadas desligada para proporcionar mudanças de volume, e o curso de tempo das alterações de volume está correlacionada com a evolução no tempo da mudança de osmolarança do meio de perfusão da câmara, usando um procedimento de ajuste de curva escrito em Matlab (a 'PfFit'), para se obter P f.
Introdução
A absorção de água eo fluxo através das membranas celulares é um requisito fundamental para a existência de plantas, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Ao nível celular, aquaporinas (AQPs) desempenham um papel fundamental na regulação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) da membrana celular 1-3.
Até à data, vários métodos têm sido utilizados para medir a endógena P f de protoplastos de diferentes órgãos da planta (ou seja, raízes, mesofilo, endoderme, etc., Revisado por Chaumont et al. 4). Uma das abordagens para medir P f é expo....
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Protocolo
1 Preparação das Soluções
- Prepare isotónica (600 mOsm) e hipotónico (500 mOsm) soluções contendo 10 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, e 8 H 2 (N-morfolino) Ácido -etanossulfónico (MES), pH 5,7 e ajustar a osmolaridade com as quantidades apropriadas de D-sorbitol: 540 mm para o isotônico e 440 mm para a solução hipotônica. Verificar a osmolaridade da solução (dentro de 3% do valor alvo), utilizando um osmómetro.
- Prepara-se uma pasta seca de 'mistura enzimática "contendo as enzimas seguintes: 0,55 g de celulase, 0,1 g pectolyase, 0,33 g de polivinilpirrolidona K 30, 0,33 g de BSA (ver Tabela 1 abaixo), a mistura de pó seco p....
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Resultados
A fim de determinar o P f e comparar a actividade de diferentes AQPs, mesófilo protoplastos de folha de Arabidopsis são utilizados. Estes protoplastos foram encontrados a ter baixos basal (fundo) P f níveis 7 e pode servir como um sistema de expressão funcional para permitir medições P f reprodutíveis.
Os protoplastos a partir de uma folha madura a partir de uma planta Arabidopsis seis semanas de idade foram isolados e três construções de genes com.......
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Discussão
Aqui descrito é um procedimento simples e muito eficiente para medir a P f isoladas de protoplastos de plantas, em princípio, aplicável também a outras células esféricas, por exemplo., Os oócitos de rã 11. Este método baseia-se na medição da P f em resposta a um desafio osmótico para a célula. Em contraste com os outros métodos com base nesta abordagem, no entanto, a alteração das soluções, ou seja, da osmolaridade, não é instantânea, mas gradual, durante um banho de pe.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações do Fundo Nacional Belga para fi Scienti c Research (FNRS), o Interuniversitário atração poloneses Programa-belga política científica e os "Communauté Française de Belgique-ações de Recherches Concertées" a FC, a partir do Israel Science Foundation Jerusalém ( ISF) para MM (Grant # 1311-1312) e NM (Grant # 1312-1312).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Qualquer fonte, grau anal |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Qualquer fonte, anal. grau |
| 2-(N-morfolina)-ácido etanossulfônico (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Qualquer fonte, anal. grau |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Qualquer fonte, anal. grau |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, EUA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, EUA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polivinil-pirrolidona K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | A9418-5G | http:// www.sigmaaldrich.com< / a > |
| sulfato de protamina | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poli-L-lisina | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| xileno cianol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| graxa de vácuo de silicone pesada | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.? SecurePage=true& SEO_ErrorPageOccurred=verdadeiro& anexos=CoA |
| Microscópio invertido | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Bomba peristáltica | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Câmera digital em tons de cinza | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver' plugin para ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Software livre | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Software livre | |
| Kit de conexões para bomba Econo Gradient | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Conectores, coletor | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html? ACTION=S | |
| Conjuntos de infusão de bureta (colunas) | Welford | IF-BR-001 | Tubulação http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com | |
| 3M embalagem Fita adesiva 1'', transparente | Viking Industrial, Reino Unido | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8 qualquer fita adesiva transparente (fita adesiva, etc.) provavelmente estará OK |
Referências
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters.
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Reimpressões e permissões
