Artigo de método

Protocolo SIVQ-LCM para o Instrumento ArcturusXT

DOI:

10.3791/51662

⸱

23 de julho de 2014

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1Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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SIVQ-LCM é uma abordagem inovadora que utiliza um algoritmo de computador, espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ), para conduzir o processo a laser microdissection captura (LCM). O fluxo de trabalho SIVQ-LCM melhora a velocidade e precisão da microdissecção, com aplicações tanto na pesquisa e na clínica.

Resumo

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SIVQ-LCM é uma nova metodologia que automatiza e simplifica o, o processo de dissecação de laser mais tradicional dependente do usuário. O objetivo é criar uma, rapidamente personalizável tecnologia laser avançada plataforma de dissecção. Neste relatório, nós descrevemos a integração do software de análise de imagem e espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ) sobre o instrumento ArcturusXT. O sistema contém um ArcturusXT infravermelho (IV) e ultravioleta (UV) de laser, permitindo celular específico ou grandes dissecações da área. O objetivo principal é melhorar a velocidade, precisão e reprodutibilidade da dissecção de laser para aumentar a produtividade de amostras. Esta nova abordagem facilita microdissection de animais e tecidos humanos em investigação e fluxos de trabalho clínicos.

Introdução

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Originalmente desenvolvido em meados dos anos 1990, a captura a laser microdissecção (LCM), permite ao usuário capturar com precisão células específicas ou regiões celulares de uma secção de tecido histológico via visualização microscópica 1, 2. Muitos estudos comparando a análise molecular de LCM contra arranhões tecido ilustrar o valor do método 3-12. Além disso, há três publicações de protocolo de vídeo sobre a tecnologia que está disponível para visualização 13, 14. No entanto, apesar de seu valor comprovado, LCM pode ser tedioso e trabalhoso quando o alvo de interesse é uma população de células dispersas em uma seção de tecido heterogêneo, ou quando um grande número de células são necessárias para aplicações a jusante específicas, como a proteômica. A carga colocada sobre o operador humano nos levou a desenvolver uma abordagem dissecação semi-automatizado para LCM pela combinação de um algoritmo de análise de imagem poderosa para orientar o processo LCM 15.

Em colaboração com a Universidade de Michigan, nosso laboratório no NIH estendeu o previamente desenvolvido e relatado espacialmente invariante quantização vetorial (SIVQ) algoritmo de forma a permitir que ele semi-automatizar o processo de seleção de tecido intrínseco à guiados microdissection, tornando assim disponível uma ferramenta com o patologista ou cientista vida em mente. Espacialmente invariante quantização vetorial (SIVQ) é um algoritmo que permite que o usuário simplesmente "clicar" sobre uma característica histológica de interesse para criar um vetor de toque (recurso de imagem predicado) que pode ser usado para procurar toda a imagem histológica, o ajuste do limiar estatístico conforme necessário 16-21. O mapa de calor resultante exibe a qualidade de jogos para o recurso inicial imagem predicado e é posteriormente convertido em uma única cor (vermelho) mapa anotação que pode ser importado para o instrumento LCM. O software de seleção automatizada, AutoScanXT, é então usada para desenhar um mapa com basena anotação do SIVQ guiar a captura das células alvo da amostra de tecido. O protocolo detalhado abaixo descreve a implementação de SIVQ no fluxo de trabalho microdissection.

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Protocolo

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O protocolo descrito foi utilizado em conformidade com as normas do NIH sobre a utilização de amostras de tecidos humanos.

1. Preparação de Tecidos

  1. Antes do início, obter amostras de tecidos humanos de acordo com a Institutional Review Board (IRB) protocolos.
  2. Escolha o tipo de bloco de tecido / célula e correspondente método de processamento [fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE), congelados ou fixo-etanol (EFPE) incluído em parafina]. Fixação formalina fornece histologia ideal, com fixação de etanol e flash congelado. No entanto, métodos de transformação e de fixação do tecido podem afectar o ADN, ARN, e a quantidade de proteína e de qualidade para análise molecular e a jusante devem ser considerados.
  3. Corte as seções do bloco de tecido / célula para o tipo de slide (vidro, vidro da membrana, ou membrana estrutura de metal) de escolha. Análise SIVQ funciona igualmente bem em todos os três tipos de slides. Por favor, note que o método pseudo-lamela (descrito abaixo) com xilenos e Ethanol não pode ser realizado nas lâminas de membrana de armação de metal uma vez que a lâmina tem de ser invertida no palco.
  4. Selecione uma mancha tecido química ou com base em IHC para identificar as células de interesse do fundo. Note-se que os métodos de coloração pode também afectar o ADN, ARN, e qualidade e quantidade de tecido de proteína. Teste o tecido após coloração para avaliar a qualidade da linha de base de biomoléculas, antes de prosseguir com o protocolo. SIVQ-LCM foi realizada em lâminas de tecido / citologia coradas com: imuno-histoquímica (IHQ) com DAB 15, imunofluorescência, vermelho rápido, de novo vermelho, azul de toluidina e hematoxilina e eosina (H & E) (dados não publicados).

2. Specimen Imagem

  1. Carga desliza no palco motorizado do instrumento microdissection e lançar o software relacionado. Marque as caixas de seleção para designar as posições das lâminas carregadas e garantir que os arquivos de imagens captadas devem ser salvos no formato jpeg.
  2. Otimizar o imqualidade idade, ajustando o brilho eo foco da imagem na tela, usando o anel de foco manual ou através do software do instrumento de dissecação.
    1. Usando a caixa de ferramentas Imagem no software do instrumento de dissecação, definir o ganho de brilho da lâmpada e câmera de forma adequada. Exemplo de valores de brilho são = 60 = 220 e ganho, com o difusor.
    2. Concentre-se manualmente ou com o recurso de foco automático no software.
  3. Capturar uma imagem panorâmica miniatura do slide para fornecer um roteiro para o processo de dissecação.
    1. Para melhor qualidade de imagem de um slide de uncoverslipped, utilizar o difusor abaixo do condensador sobre o instrumento, ou, adicionar uma pequena quantidade (~ 30 mL) de etanol ou xilenos para melhorar o índice refratário (pseudo-lamela). Ao utilizar xilenos, estar ciente de que eles são deve ser utilizado medidas de segurança adequadas e tóxicas, incluindo o uso de um exaustor e jaleco de proteção, óculos de proteção dos olhos, e luvas.
    2. NÃO coloque a tampa da LCM no slide até a solução de etanol ou xilenos foi completamente limpo ou o polímero na tampa será distorcida.
  4. Navegue o slide e capturar imagens das áreas a serem dissecados em 10X, 20X ou 40X de ampliação. Se necessário, melhorar a imagem com software como AutoCorreção (no Microsoft Office Picture Manager), como descrito anteriormente 22. As imagens devem ser capturadas em formato jpeg, que lhes permitam ser re-importado para o software de seleção automática.

3. Algoritmo Análise da Imagem

  1. Transferência de imagens capturadas a partir do instrumento microdissection para a pasta SIVQ. Instalar e abrir os pacotes de software ArcturusXT, AutoScan e SIVQ no computador conectado ao instrumento de dissecação. Para ter acesso ao software SIVQ, por favor, entre em contato com o Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu).
  2. Abrir SIVQ e carregar a imagem capturada (jpeg) de interesse.
  3. Navegar para a área de interesse e / ou ajustar o tamanho das janelas de visor de visualização (5 e 6). No software SIVQ, Viewport 5 mostra a imagem de pré-processamento e Viewport 6 mostra a imagem pós-processamento 16.
  4. Escolher o tamanho do vector de anel e o número de anéis de ser utilizados.
  5. Selecione o recurso de imagem predicado a ser capturada pelo botão direito sobre ele na Viewport 6.
  6. Clique em "Scan" para analisar a imagem.
  7. Ajustar a probabilidade estatística da imagem correspondente, utilizando as duas barras deslizantes. A barra superior ajusta a especificidade global do vetor, e é utilizado para excluir a área a partir da pesquisa inicial (com sensibilidade, tal como definido pela variável selecionado "Dados") que podem representar excessiva área incluída. Por outro lado, a barra inferior é utilizado para aumentar a sensibilidade, depois de uma análise é executada, com a intenção de aumentar a área que é classificada como sendo um jogo. Ambos os controles deslizantes utilize a variável "Dados", como o limiar de sensibilidade ao início do estudo.
  8. Para salvar a imagem, clique em "salvar como jpeg" (imagem agora está salvo na pasta c :/ vq_test / fotos).
  9. Analisar a imagem com o algoritmo. A saída do algoritmo de análise deve resultar numa imagem anotada para que possa ser utilizado em SIVQ-LCM. No momento, a versão atual do motor central SIVQ está em testes beta versão com a expectativa de que a versão de produção total (disponível Q1 2014) irá incorporar um kit de desenvolvimento de software completo (SDK) e uma interface de programação de aplicativo (API) para a integração simplificada de filtros espaciais gerados por usuários e as etapas de processamento de dados de fluxo de trabalho a jusante com o motor correspondente anel central. Este SDK será distribuído com um conjunto completo de documentação.
    1. Verifique se o heatmap SIVQ é alterado para uma cor vermelha uniforme.
  10. Exporte a imagem. É essencial para a re-inserir as coordenadas de posição do post-análise de imagem JPEG usando um editor de HEX para colar no cabeçalho do arquivo a partir da imagem instrumento dissecção originais. Os dados apropriados podem ser encontradas entre o "Início da Imagem" marcador (0xFF, 0xD8) eo primeiro "Definir Quantização Table" marcador (0xFF, 0xDB).

4. Microdissecção

  1. Coloque a tampa LCM no centro da região de interesse, onde as imagens foram capturadas para análise SIVQ.
  2. Calibrar e Controle de Qualidade (CQ) os lasers UV / IR e otimizar os parâmetros, incluindo a energia, a duração, locais de laser, e velocidade de corte UV (como recomendado pelo fabricante). Execute estas calibrações antes de voltar a importar a imagem analisada.
  3. Abrir AutoScanXT (software seleção automática) e importar a imagem analisada a partir de c :/ vq_test pasta / pics.
  4. Treinar o software de selecção automática para reconhecer a anotação SIVQ e criar o mapa de dissecação.
    1. Para criar um training arquivo, selecione quatro regiões de interesse (marcadas por "círculos azuis") sobre a "tinta vermelha" da imagem analisada SIVQ.
    2. Selecione as áreas de fundo (marcadas por "quadrados vermelhos") que não estão a ser dissecado.
    3. Clique no botão "Analisar" para gerar o arquivo de treinamento, que pode ser guardado para usos posteriores.
  5. Realizar microdissecção usando o apropriado infravermelho (IR) e / ou ultravioleta (UV) lasers.
    1. Copie as áreas selecionadas para a imagem "ao vivo".
    2. Na caixa de ferramentas "microdissect", selecione a captura IR apropriado ou botões de corte UV.
  6. Após a dissecção é completa, mova a tampa de LCM para a estação de QC e capturar uma imagem dos tecidos / células dissecadas. Outra abordagem é o de colocar a tampa sobre uma área vazia do slide antes de movê-lo para a estação de QC, o que permite ao usuário tirar fotos em várias ampliações.
  7. Capturar uma imagem da área de tecido de interesse após microdissecção para avaliar ainda mais levantando a eficiência.
  8. Se as células desejadas foram dissecados com êxito, clique no botão "estágio atual" no software ArcturusXT e retire a tampa LCM dar início ao processo de extração molecular para análise de downstream.

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Resultados

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A secção de tecido FFPE materno foi histoquímica para citoqueratina AE1/AE3 usando um protocolo padrão IHC 23. Após a coloração, o tecido foi colocado deslizante na fase ArcturusXT e o protocolo SIVQ-LCM foi iniciado como descrito acima. Uma vez que o tecido não pode ser lamínulas por microdissecção, as células coradas + IHC pode ser difícil de discernir visualmente (Figura 1A). Assim, para proporcionar um melhor índice correspondente e uma melhoria da imagem, xilenos foram adicionados à secç...

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Discussão

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Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de SIVQ-LCM para microdissect células epiteliais imunoistoquímica de FFPE tecido mamário humano. O uso de um algoritmo de análise de imagem, tal como SIVQ, reduz a quantidade de mão-de tempo necessário para o processo de microdissecção. Este é um avanço potencialmente importante para o campo de tempo e uma vez que o esforço do operador é tipicamente o passo limitante da velocidade para a dissecção precisa das células de interesse. No presente protocolo, especificamente adap...

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Divulgações

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Michael R. Emmert-Buck é um inventor de patentes NIH-realizadas cobrindo captura de microdissecção a laser e recebe pagamentos baseados em direitos autorais por meio do Programa de Transferência de Tecnologia NIH.

Agradecimentos

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O estudo foi financiado em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lâminas de Vidro Carregadas PositivasThermo Scientific4951Plus-001
Xilenos, reagente ACS, ≥ 98,5% xilenos + etilbenzeno à baseSigma Aldrich247642CUIDADO: USE OS PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA ADEQUADOS.
Álcool etílico, prova de U.S.P. 200, anidroThe Warner-Graham Company6.505E+12CUIDADO: USE OS PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA ADEQUADOS.
Arcturus CapSure Macro LCM CapsLife TechnologiesLCM0211
ArcturusXT Laser Microdissection InstrumentLife TechnologiesSoftware ARCTURUSXT
AutoScanXTLife TechnologiesUm programa opcional de análise de imagem para o dispositivo de microdissecação a laser ArcturusXT. Este software é necessário para o SIVQ-LCM.
Quantização de vetores espacialmente invariantes (SIVQ)Universidade de MichiganEste conjunto de ferramentas está disponível publicamente para colaborações acadêmicas. Para acessar o algoritmo SIVQ, entre em contato com o Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]

Referências

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