A aplicação de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por tempo de voo (MALDI-TOF), espectrometria de massa (MS) directamente ao caldo de cultura do sangue acelera a identificação de bactérias. O método apresentado é um método rápido e fiável para a identificação de bactérias Gram-negativas directamente do caldo de cultura do sangue.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um papel importante do laboratório de microbiologia clínica é proporcionar a rápida identificação de bactérias que causam infecção na corrente sanguínea. Identificação tradicional exige a sub-cultura do sinalizou caldo de cultura de sangue com a identificação disponível somente depois colônias em agar sólido amadureceram. MALDI-TOF MS é um método fiável, rápido para a identificação da maioria das bactérias clinicamente relevantes, quando aplicado para colónias em meios sólidos. A aplicação de MALDI-TOF MS diretamente ao caldo de cultura de sangue é uma abordagem atraente, pois tem potencial para acelerar a identificação de espécies de bactérias e melhorar a gestão clínica. No entanto, um problema importante para superar é a remoção de pré-análise de interferentes resinas, proteínas e hemoglobina contidos em amostras de cultura do sangue, que, se não for removido, interferem com os espectros de MS e pode resultar em pontuações suficientes ou baixos de identificação de discriminação. Além disso, é necessário concentrar a bactériaia para desenvolver espectros de qualidade suficiente. O método apresentado descreve a concentração, purificação e extração de bactérias Gram negativas que permitem a identificação precoce de bactérias a partir de um caldo de cultura de sangue sinalizado.
Introdução
Os pacientes com infecção de corrente sanguínea (BSI), devido a bactérias continuam a ter alta taxa de mortalidade intra-hospitalar, que vão 6-48% 1. A entrega de antibiótico empírico adequado promove a sobrevivência e no subgrupo de pacientes com sepse grave, a cada hora de atraso para a terapêutica adequada se relaciona à diminuição da sobrevivência de 2,3. Assim, um objectivo-chave do laboratório clínico é detectar rapidamente, identificar e comunicar a presença de bactérias em hemoculturas para informar as decisões clínicas. Tem sido demonstrado que o laboratório microbiológico tem a maior influência sobre a terapia antimicrobiana no momento....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Sangue Cultura Caldos Bandeira como "positiva"
- Retire a garrafa de hemocultura sinalizou a partir do contínuo monitoramento do gabinete de incubação e coloque-o em uma cabine de segurança biológica. Nota: Os frascos podem conter microorganismos perigosos e precauções universais precisam ser seguidas. Devido ao risco de aerossóis infecciosos em amostragem, todos os procedimentos de amostragem deve ser realizada em um Biossegurança Classe II câmara de fluxo laminar.
2. Gram Stain é preparado
- Prepare uma coloração de Gram do caldo de cultura de sangue sinalizada conforme protocolos institucionais locais. ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A MALDI-TOF MS espectros gerados são comparados com a base de dados de espectros de referência integrada. A pontuação logarítmica é atribuído pela confiança do jogo entre o isolado de teste eo banco de dados de referência isola, com a recomendação de uma pontuação ≥ 1.7 necessário para provável identificação ao nível de gêneros (Figura 1) e ≥ 2.0 para provável identificação de espécies (Figura 2). Comunicar ao nível de espécie, quando a pontuação ≥ 1,7 e os 5 primeiros identificações co.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
É importante quando se aplica MALDI-TOF MS para caldo de cultura de sangue que as etapas de pós centrifugação são realizados com o cuidado suficiente para não remixar os componentes separados. É particularmente importante para remover os constituintes de culturas de sangue e as proteínas celulares humanas, incluindo a hemoglobina, o que pode produzir picos interferindo com o espectro de MALDI-TOF.
Embora MS fabrica recomendo cortar de pontuação ≥ 2,0 para as espécies e ≥ 1,7 para identificaç.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BACTEC Plus Aeróbica / F Médio | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA | 442192 | |
| BACTEC Lítico/10 Anaeróbico/F Médio | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Médio | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA | 442194 | |
| Vacutainer - Dispositivo de transferência de sangue | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Dispositivo de amostragem de uso único reduzindo o risco de ferimentos por picada de agulha |
| Vacutainer SST 5,0 ml, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA | 367954 | Seringa de tubo de separação de soro |
| 10 ml | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA | 302143 | |
| Pipeta de transferência | Samco, EUA | 222-20S | |
| Pipeta de transferência (ponta fina) | Samco, EUA | 232-20S | |
| Tubo de microcentrífuga (2,0 ml) | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 0030.120.094 | |
| Água estéril (livre de DNAse e RNAse) | Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA | 10977-015 | |
| Ácido fórmico | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA | F0507 | |
| Solução de matriz | Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha, | 285074 | 10 mg/ml de ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico, 50% de acetonitrila, 2,5% de ácido trifluoroacético |
| Microflex de bancada LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha | Utilizando os softwares BioTyper 3.1 (Build 65) e FlexControl 3.3 (Build 99) |
Referências
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
