Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia

Resumo

Este protocolo descreve um método de imagem de células vivas usando cardiomiócitos neonatais primários de ratos após transdução lentiviral e adenoviral usando microscopia de disco giratório confocal. Isso permite observações detalhadas dos processos celulares em cardiomiócitos vivos.

Resumo

Cardiomiócitos primários de rato neonatal são úteis na investigação básica em cardiovascular in vitro, porque eles podem ser facilmente isolados em grande número em um único procedimento. Devido aos avanços na tecnologia de microscópio é relativamente fácil para capturar imagens de células vivas com a finalidade de investigar eventos celulares, em tempo real, com preocupação mínima sobre fototoxicidade para as células. Este protocolo descreve como tirar imagens timelapse células vivas de ratos primário cardiomiócitos neonatais usando um microscópio confocal disco giratório seguinte transdução lentiviral e adenovírus para modular as propriedades da célula. A aplicação de dois tipos diferentes de vírus facilita a alcançar um nível de taxas de transdução e de expressão apropriados para dois genes diferentes. Imagens de células vivas bem focado pode ser obtido usando o sistema de focagem automática do microscópio, que mantém o foco estável por longos períodos de tempo. Aplicando este método, as funções de engenheiro exogenamenteed proteínas expressas em células primárias de cultura pode ser analisado. Além disso, este sistema pode ser usado para examinar as funções de genes através do uso de siRNAs, bem como de moduladores químicos.

Introdução

Cardiomiócitos neonatais de ratos primárias têm sido muito utilizados para investigar a função de cardiomiócitos in vitro ^1. Eles são fáceis de isolar a partir de crias de ratos por vários métodos bem estabelecidos ^2-4. O método mais comum emprega colagenase ou tripsina para digerir o tecido conjuntivo do coração antes do isolamento de células. Os investigadores também foram desenvolvidos métodos para isolar os cardiomiócitos de roedores adultos ^5-8, bem como ratinhos neonatais ^9,10.

Este protocolo descreve um método para o isolamento de cardiomiócitos de crias de ratos recém-nascidos, ....

Protocolo

1. Isolamento de cardiomiócitos de ratos neonatais

1. Utilizar o meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) e meio essencial mínimo (MEM) suplementado com soro fetal bovino (FBS) e penicilina / estreptomicina (P / S) como o meio de cultura. Adicionar bromodesoxiuridina (BrdU) para o meio para prevenir o crescimento de fibroblastos para os primeiros 2 dias, após o isolamento.

	Meio base	FBS	BrdU (mM)	P / S (U / ml)
seleção	DMEM	10%	0	20
O primeiro dia	DMEM

Resultados

Para ilustrar a técnica, a codificação de EGFP lentivírus (reforçada proteína fluorescente verde) marcado com Cx43 (Connexin43) ou um Cx43 mutante ³² foi utilizado para expressar proteínas EGFP-marcado em células, e um adenovírus codificador FGFR1DN (receptor do factor de crescimento do fibroblasto 1 negativo dominante ) foi utilizado para fechar a sinalização do FGF-se na célula de ^33-35. Três dias após o isolamento de cardiomiócitos, os cardiomiócitos foram isolados transduzidas com lentivírus, a.......

Discussão

Cardiomiócitos primários isolados de ratos recém-nascidos têm sido usados ​​para estudar as funções de cardiomiócitos in vitro. Este protocolo descreve um método para o isolamento de cardiomiócitos neonatais de filhotes de rato usando um método de digestão enzimática de dois passos, primeiro digestão com tripsina O / N a 4 ° C e, em seguida, colagenase purificada. Uma vantagem de se empregar o passo colagenase purificada é que o mesmo tipo de enzima é utilizado para todos os isolamentos. Assim, a qualidade e qu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 Tesoura para decapitação	WPI	501749	Autoclave antes do uso
1 Tesoura fina para isolamento do coração e corte	WPI	14393	Autoclave antes do uso
2 Pinças finas (Dumont No. 5)	Sigma	F6521	Autoclave antes do uso
3 Pratos de plástico esterilizados de 10 cm	Sigma	CLS430165	Para isolamento cardíaco
3,5 cm Fundo de vidro placas de cultura	MatTek	P35G-1.5-20-C	Para o revestimento final de cardiomiócitos para futuras imagens de células vivas. Os micro-pratos da ibidi são uma alternativa aceitável.
Pratos de cultura com fundo de vidro de 3,5 cm	MatTek	P35G-0.17-14-C	Para TIRF ou imagem de alta resolução
Solução de etanol, 70% (v/v) em água	Sigma	E7148
2% Gelatina	Sigma	G1393
1 Prato de plástico esterilizado de 10 cm	Sigma	CLS430165	Para tripsinização
Folha de alumínio	Qualquer marca
Parafilm	Sigma	P7543
Dois pratos de cultura de células de plástico de 10 cm	Sigma	CLS430165	Para seleção
Autopipeta	Drummond Scientific	4-000-300	Para trituração
Contador
Celómetro, contador de células automatizado	nexcelom		Para verificar e contar células
Microscópio e hematocitómetro	Qualquer marca		Para verificar e contar células
Solução azul de tripano, 0,4%	invitrogen	15250-061
CO2 incubadora	Sanyo	MCO-19AIC
Incubadora orbital agitadora	Sigma	Z673129	Para agitar o tecido cardíaco com colagenase a 37 ° C a 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solução	BD Pharmingen	550891
DMEM,	invitrogen	41965039	Misture o meio conforme indicado no protocolo e aqueça antes do uso
MEM	invitrogen	31095029	Misture o meio conforme indicado no protocolo e aqueça antes do uso
Soro bovino fetal	invitrogen	26140079
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)	invitrogen	15140-122
Seção 2 Transdução
3 Plasmídeos
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
pRSV-Rev	Addgene	12253
pMD2.G	Addgene	12259
O vetor de transferência lentiviral, pLVX-IRES-Puro	Clontech	632183
Opti-MEM (meio sem soro)	invitrogen	31985070
Reagente
polietilenoimina" Max", (MW 40.000) - PEI linear de alta potência (equivalente a Mw 25.000 na forma de base livre)	Policiências	24765-2	Pode ser substituído por X-tremeGENE 9 da Roche
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001	substituto do PEI como reagente de transfecção
Cloroquina	Sigma	C6628	Dissolver em água e fazer solução estoque 100 mM. A inibição da acidificação endossômica pode ser alcançada com 10-100 μ M Cloroquina.
HEPES	Sigma	H3375
Seringa Luer-Lok de 10 ml, BD esterilizada		309604
0.45 μ	Filtros Sigma	F8677	Use apenas filtros de acetato de celulose ou polietersulfona (PES) (baixa ligação às proteínas). Não use filtros de nitrocelulose. A nitrocelulose se liga às proteínas de superfície no envelope lentiviral e destrói o vírus.
Brometo de hexadimetrina	Sigma	H9268	Dissolva em água e faça 8 mg / ml de solução estoque, depois filtre-a para esterilizar.
Polietilenoglicol 6.000	Sigma	81260
Cloreto de sódio	Sigma	S9888
Hidróxido de sódio	Sigma	S5881
Seção 3 Transdução
Células HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Algumas placas de cultura de células de 10 cm	Sigma	CLS430165
Microplaca de 96 poços com tampa, fundo plano, cultura de tecidos, estéril	BD Falcon	353072	Para titulação
Pipeta multicanal, 10-100 μ l, 8 canais	eppendorf	3122 000.035
Seção 4 Imagem de
vivas Microspopy confocal de disco giratório	PerkinElmer	L7267000
Uma câmara com temperatura controlada	Qualquer marca		Para manter a temperatura em 37 ° C
A CO2 sistema ambiental	Qualquer marca		Opcional para manter a concentração ideal de CO2
2 Meio independente, sem glutamina	invitrogen	18045-054	Para imagens de lapso de tempo de longa duração
DMEM, glicose alta, HEPES, sem invitrogen vermelho de fenol		21063-029	Para imagens de lapso de tempo de longa duração

de células com alto teor de glicose lentiviralde embalagemde transfecçãoadenoviralcélulas CO